技术领域
本发明涉及用于诊断和/或治疗方法中的图像增强造影剂，特别是 以充气微囊泡形式存在的造影剂。
发明背景
用作造影剂，特别是用于超声成像的可注射制剂包括分散于水性 介质中的、具有几微米直径的气泡的混悬液。特别令人感兴趣的是通 过适合的添加剂，例如乳化剂、油、增稠剂或糖类或通过将气体或其 前体包埋或包封在各种系统中被稳定的气泡。这些稳定化的气泡通常 在本领域中被称作充气微囊泡。
有用的充气微囊泡包括含水混悬液，其中气泡通过一个非常薄的 封套(薄膜)被约束在气/水界面，该封套包括排列在气液界面上的稳定 性两亲材料。这些混悬液通常是通过下述方法来进行制备的：使粉状 两亲性材料例如冷冻-干燥的预成形的脂质体或冷冻-干燥的或喷雾干 燥的脂质溶液与空气或其它气体接触，然后使其与水性载体接触，同 时搅拌以产生充气微囊泡的混悬液，然后该混悬液可以被给药，优选 在制备不久之后被给药。在例如US 5,271,928、US 5,445,813、 US 5,413,774、US 5,556,610、5,597,549、US 5,827,504、WO 97/29783 和WO2004/069284中对充气微囊泡含水混悬液的实例及其制备进行了 公开，这些文件被全部引入本文作为参考。
在这些脂质稳定的充气微泡成分中，还建议导入可变数量的携带 亲水聚合物的脂质如与聚乙二醇相连的磷脂的形式的稳定化合物。例 如，美国专利6,416,740公开了一些组合物，其中所述携带聚合物的 脂质的数量高于约1摩尔％，当该脂质是携带聚乙二醇的磷脂时，含 量至少在5摩尔％。
申请人现在发现，携带亲水聚合物的脂质的这个量对获得稳定的 微囊泡来说并不是必要的，这是因为在携带亲水聚合物的脂质的浓度 极低的条件下，出人意料的得到了这种稳定性。申请人进一步观察到， 如此低的携带亲水聚合物的脂质数量使得可以向微囊泡中捕获更高的 气体体积。此外，申请人还观察到，该类极低的携带亲水聚合物的脂 质浓度还可令人吃惊地导致微囊泡的数目增加。
本发明的概述
本发明一方面涉及用含有0.15％至1摩尔％的携带亲水聚合物的 脂质的两亲性材料层稳定的充气微囊泡。所述浓度优选地为至少0.3 摩尔％，优选为约0.5摩尔％。
该携带亲水聚合物的脂质优选地为与聚乙二醇共价连接的磷脂。
本发明的另一方面包括所述微囊泡各自的前体(其特别是为包括 所述两亲性材料和所述携带亲水聚合物的脂质的干粉形式)、包括所述 微囊泡或其前体的药盒、制备所述微囊泡的方法以及使用所述微囊泡 的方法。
本发明的详细说明
本文所定义的充气微囊泡包含微米级和亚-微米级尺寸的气泡在 含有两亲化合物的含水混悬液中的分散体。该两亲化合物的至少一部 分排列在气液界面上，因此形成一种为气泡带来所需稳定性的薄封套 (通常为薄膜形式)。
用于形成稳定封套的两亲化合物可以是合成的或天然存在的生物 相容化合物并且可以包括例如成膜脂质，特别是磷脂。两性分子化合 物的实例包括例如磷脂类；溶血磷脂类；脂肪酸类如棕榈酸、硬脂酸、 花生四烯酸或油酸；携带聚合物的脂质如壳多糖、透明质酸、聚乙烯 吡咯烷酮或聚乙二醇(PEG)(其也被称为“PEG化脂质”)；携带磺化的 单糖、二糖、低聚糖或多糖的脂质；胆固醇、硫酸胆固醇或半琥珀酸 胆固醇；生育酚半琥珀酸酯；具有醚或酯连接的脂肪酸的脂质；聚合 脂质；磷酸二乙酰基酯(diacetyl phosphate)；磷酸二鲸蜡酯；神经 酰胺；聚氧乙烯脂肪酸酯(如聚氧乙烯脂肪酸硬脂酸酯)、聚氧乙烯脂 肪醇、聚氧乙烯脂肪醇酯、聚氧乙烯化脱水山梨醇脂肪酸酯、甘油聚 乙二醇蓖麻油酸酯、乙氧基化大豆甾醇、乙氧基化蓖麻油或环氧乙烷 (EO)和环氧丙烷(PO)嵌段共聚物；甾醇脂肪酸酯，包括胆固醇丁酸酯、 胆固醇异丁酸酯、胆固醇棕榈酸酯、胆固醇硬脂酸酯、羊毛甾醇醋酸 酯、麦角甾醇棕榈酸酯、或植物甾醇正丁酸酯；糖酸的甾醇酯，包括 胆固醇葡萄糖醛酸苷、羊毛甾醇葡萄糖醛酸苷、7-脱氢胆固醇葡萄糖 醛酸苷、麦角甾醇葡萄糖醛酸苷、胆固醇葡萄糖酸酯、羊毛甾醇葡萄 糖酸酯、或麦角甾醇葡萄糖酸酯；糖酸酯和糖醇的酯，包括月桂基葡 萄糖醛酸苷、硬脂酰基葡萄糖醛酸苷、肉豆蔻酰基葡萄糖醛酸苷、月 桂基葡萄糖酸酯、肉豆蔻酰基葡萄糖酸酯、或硬脂酰基葡萄糖酸酯； 具有脂肪酸的糖酯，包括蔗糖月桂酸酯、果糖月桂酸酯、蔗糖棕榈酸 酯、蔗糖硬脂酸酯、葡糖醛酸、葡糖酸或多糖醛酸；皂苷类，包括菝 葜皂苷元、异菝葜皂式配基(smilagenin)、常春藤皂甙元、齐墩果酸 或洋地黄毒甙元；甘油或甘油酯，包括甘油三棕榈酸酯、甘油二硬脂 酸酯、甘油三硬脂酸酯、甘油二肉豆蔻酸酯、甘油三肉豆蔻酸酯、甘 油二月桂酸酯、甘油三月桂酸酯、甘油二棕榈酸酯；长链醇类，包括 正癸醇、月桂醇、肉豆蔻醇、鲸蜡醇、或正十八烷醇；6-(5-胆甾烯-3 β-基氧基)-1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷；双半乳糖甘油二酯；6-(5- 胆甾烯-3β-基氧基)己基-6-氨基-6-脱氧-1-硫代-β-D-吡喃半乳 糖苷；6-(5-胆甾烯-3β-基氧基)己基6-氨基-6-脱氧-1-硫代-β -D-吡喃甘露糖苷；12-(((7’-二乙基氨基香豆素-3-基)羰基)-甲氨基) 硬脂酸；N-[12-(((7’-二乙基氨基香豆素-3-基)羰基)-甲氨基)硬脂 酰基]-2-氨基棕榈酸；N-琥珀酰基二油酰基磷脂酰基乙醇胺；1，2-二 油酰基-sn-甘油；1，2-二棕榈酰基-sn-3-琥珀酰甘油；1，3-二棕榈酰 基-2-琥珀酰甘油；1-十六烷基-2-棕榈酰基甘油磷酸乙醇胺或棕榈酰 基高半胱氨酸；烷基胺或烷基铵盐，包括至少一个(C10-C20)，优选 (C14-C18)烷基链如N-硬脂酰胺、N，N’-二硬脂酰胺、N-十六烷基胺、N，N’- 双十六烷基胺、N-硬脂酰氯化铵、N，N’-二硬脂酰氯化铵、N-十六烷基 氯化铵、N，N’-双十六烷基氯化铵、二甲基双十八烷基溴化铵(DDAB)、 十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)；叔铵或季铵盐，包括一个或优选两个 (C10-C20)(优选(C14-C18))通过(C3-C6)亚烷基桥与N-原子相连的酰基链 如，例如1，2-二硬脂酰基-3-三甲基铵-丙烷(DSTAP)、1，2-二棕榈酰 基-3-三甲基铵-丙烷(DPTAP)、1，2-油酰基-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)、 1，2-二硬脂酰基-3-二甲基铵-丙烷(DSDAP)；及它们的混合物或组合。
根据这些成分的组合和微囊泡的生产过程，那些上面所列的示例 性化合物可被用作形成微囊泡封套的主要成分或者被用作简单的添加 剂，并因此仅以微小数量存在。
根据一个优选的实施方案，形成微囊泡封套的化合物中的至少一 种为磷脂，其任选地与上述任何其它成膜材料混合。根据本说明书， 术语磷脂意指包括其分子能在最终的微囊泡混悬液中的气-水界面形 成材料的稳定膜的任何两亲性磷脂化合物。因此，这些材料在现有技 术中也被称为“成膜磷脂”。
两亲性磷脂化合物通常包含至少一个磷酸酯基团和至少一个优选 两个亲脂性长链烃基。
磷脂的适宜实例包括具有一个或优选两个(相同或不同的)脂肪酸 残基的并具有磷酸的甘油酯，其中该磷酸残基又与亲水基团例如胆碱 (磷脂酰胆碱-PC)、丝氨酸(磷脂酰基丝氨酸-PS)、甘油(磷脂酰基甘油 -PG)、乙醇胺(磷脂酰基乙醇胺-PE)、肌醇(磷脂酰基肌醇)结合。仅具 有一个脂肪酸残基的磷脂的酯类在本领域中通常被称为磷脂的“溶解” (“lyso”)形式或“溶血磷脂”。磷脂中存在的脂肪酸残基通常为长 链脂族酸，通常含有12至24个碳原子，优选含有14至22个碳原子； 该脂族链可包含一个或多个不饱和键或者优选地为完全饱和的。该磷 脂中包含的适宜脂肪酸的实例包括例如月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、 硬脂酸、花生酸、山萮酸、油酸、亚油酸和亚麻酸。优选地使用饱和 脂肪酸如肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸和花生酸。
其它的磷脂实例有磷脂酸，即甘油-磷酸与脂肪酸的二酯；鞘脂类 如鞘磷脂，即那些其中具有脂肪酸的甘油二酯的残基被神经酰胺链替 代的磷脂酰胆碱类似物；心磷脂，即1，3-二磷脂酰基甘油与脂肪酸的 酯；糖脂(glycolipids)如神经节苷脂GM1(或GM2)或脑苷脂；糖酯类 (glucolipids)；硫脂类和糖鞘脂类。
本文所用的术语磷脂包括天然存在的、半合成或合成制备的产品， 它们可单独使用或者作为混合物使用。
天然存在的磷脂的实例有天然卵磷脂(磷脂酰胆碱(PC)衍生物)如 通常为大豆或蛋黄卵磷脂。
半合成的磷脂的实例有部分或全部氢化的天然存在的卵磷脂的衍 生物。优选的磷脂为磷脂酰胆碱、乙基磷脂酰胆碱、磷脂酰基甘油、 磷脂酸、磷脂酰基乙醇胺、磷脂酰基丝氨酸、磷脂酰基肌醇的脂肪酸 二酯，或鞘磷脂的脂肪酸二酯。
优选的磷脂的实例有例如二月桂酰基-磷脂酰胆碱(DLPC)、二肉豆 蔻酰基-磷脂酰胆碱(DMPC)、二棕榈酰基-磷脂酰胆碱(DPPC)、二花生 四烯酰基-磷脂酰胆碱(DAPC)、二硬脂酰基-磷脂酰胆碱(DSPC)、二油 酰基-磷脂酰胆碱(DOPC)、1，2二硬脂酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱 (乙基-DSPC)、双十五烷酰基-磷脂酰胆碱(DPDPC)、1-肉豆蔻酰基-2- 棕榈酰基-磷脂酰胆碱(MPPC)、1-棕榈酰基-2-肉豆蔻酰基-磷脂酰胆碱 (PMPC)、1-棕榈酰基-2-硬脂酰基-磷脂酰胆碱(PSPC)、1-硬脂酰基 -2-棕榈酰基-磷脂酰胆碱(SPPC)、1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰胆碱 (POPC)、1-油酰基-2-棕榈酰基-磷脂酰胆碱(OPPC)、二月桂酰基-磷脂 酰基甘油(DLPG)及它的碱金属盐、二花生四烯酰磷脂酰基甘油(DAPG) 及它的碱金属盐、二肉豆蔻酰磷脂酰基甘油(DMPG)及它的碱金属盐、 二棕榈酰磷脂酰基甘油(DPPG)及它的碱金属盐、二硬脂酰磷脂酰基甘 油(DSPG)及它的碱金属盐、二油酰基-磷脂酰基甘油(DOPG)及它的 碱金属盐、二肉豆蔻酰磷脂酸(DMPA)及它的碱金属盐、二棕榈酰磷脂 酸(DPPA)及它的碱金属盐、二硬脂酰磷脂酸(DSPA)、二花生四烯 酰磷脂酸(DAPA)及它的碱金属盐、二肉豆蔻酰基-磷脂酰基乙醇胺 (DMPE)、二棕榈酰磷脂酰基乙醇胺(DPPE)、二硬脂酰磷脂酰基乙醇胺 (DSPE)、二油酰基磷脂酰基乙醇胺(DOPE)、二花生四烯酰磷脂酰基乙 醇胺(DAPE)、二亚油酰基磷脂酰基乙醇胺(DLPE)、二肉豆蔻酰基磷脂 酰基丝氨酸(DMPS)、二花生四烯酰磷脂酰基丝氨酸(DAPS)、二棕榈酰 磷脂酰基丝氨酸(DPPS)、二硬脂酰磷脂酰基丝氨酸(DSPS)、二油酰基 磷脂酰基丝氨酸(DOPS)、二棕榈酰鞘磷脂(DPSP)、和二硬脂酰鞘磷脂 (DSSP)、二月桂酰基-磷脂酰基肌醇(DLPI)、二花生四烯酰磷脂酰基肌 醇(DAPI)、二肉豆蔻酰磷脂酰基肌醇(DMPI)、二棕榈酰磷脂酰基肌醇 (DPPI)、二硬脂酰磷脂酰基肌醇(DSPI)、二油酰基-磷脂酰基肌醇 (DOPI)。
特别优选的磷脂是DAPC、DSPC、DPPA、DSPA、DMPS、DPPS、DSPS 和乙基-DSPC。最优选的是DPPS或DSPC。
也可以使用磷脂的混合物如，例如DPPE、DPPC、DSPC和/或DAPC 与DSPS、DPPS、DSPA、DPPA、DSPG、DPPG、乙基-DSPC和/或乙基-DPPC 的混合物。
在优选的实施方案中，该磷脂是微囊泡稳定化封套的主要成分， 其数量占形成所述充气微囊泡封套的成分总量的至少50％(w/w)。在 一些优选的实施方案中，所述封套的几乎全部(即至少90％并且可高 达100重量％)可由磷脂组成。
所述磷脂可方便地与上述所列两亲化合物中任何一个混合使用。 因此，例如，脂质如胆固醇、麦角甾醇、植物甾醇、谷甾醇、羊毛甾 醇、生育酚、没食子酸丙酯或抗坏血酸棕榈酸酯、脂肪酸如肉豆蔻酸、 棕榈酸、硬脂酸、花生酸及其衍生物或丁羟甲苯和/或其它非磷脂类化 合物可以以0至50重量％，优选高至25重量％的比例被任选地添加 到上述一种或多种磷脂中。特别优选的是棕榈酸。
根据一个优选的实施方案，形成一种本发明组合物的微囊泡的封 套包括一种整体上带净电荷(正电或负电荷)的化合物。所述化合物可 以是带电荷的两亲性材料，优选地是脂质或磷脂。
整体上带负电荷的磷脂的实例有磷脂酰基丝氨酸的衍生物，特别 是脂肪酸二酯类衍生物，如DMPS、DPPS、DSPS；磷脂酸的衍生物，特 别是脂肪酸二酯类衍生物如DMPA、DPPA、DSPA；磷脂酰基甘油的衍生 物，特别是脂肪酸二酯类衍生物如DMPG、DPPG和DSPG或磷脂酰基肌 醇的衍生物，如DMPI、DPPI或DPPI。还可有利地用上述磷脂的溶解 形式如溶血磷脂酰基丝氨酸衍生物(例如溶血-DMPS、-DPPS或 -DSPS)、溶血磷脂酸衍生物如(例如溶血-DMPA、-DPPA或-DSPA)和溶 血磷脂酰基甘油衍生物如(例如溶血-DMPG、-DPPG或-DSPG)作为荷负 电化合物。带负电荷脂质的实例有胆汁酸盐如胆酸盐、去氧胆酸盐或 甘氨胆酸盐；和(C12-C24)，优选(C14-C22)的脂肪酸盐如，例如棕榈酸盐、 硬脂酸盐、1，2-二棕榈酰基-sn-3-琥珀酰甘油盐或1，3-二棕榈酰基 -2-琥珀酰甘油盐。
该带负电荷的化合物优选地从DPPA、DPPS、DSPG或其混合物中进 行选择。
所述带负电荷的成分通常与相应的正电反荷离子缔合，所述反荷 离子可以是单价-(例如碱金属或铵)、二价-(例如碱土金属)或三价的 (例如铝)。该反荷离子优选地在碱金属阳离子如Li+、Na+、或K+中进 行选择，更优选地是Na+。
整体上带正电荷的磷脂的实例有乙基磷脂酰胆碱的衍生物，特别 是乙基磷脂酰胆碱与脂肪酸的二酯，如1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3- 乙基磷酸胆碱(乙基-DSPC或DSEPC)、1，2-二棕榈酰基-sn-甘油-3- 乙基磷酸胆碱(乙基-DPPC或DPEPC)。其负的反荷离子优选地是卤素 离子，特别是氯或溴。带正电荷的脂质的实例有具有卤素反荷离子(例 如氯或溴)的烷基铵盐，其包含至少一个(C10-C20)烷基链，优选(C14-C18) 烷基链，例如单或二-硬脂酰基氯化铵、单或二-十六烷基氯化铵、二 甲基双十八烷基溴化铵(DDAB)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)。带正 电荷的脂质的其它实例有具有卤素反荷离子(例如氯或溴)的叔或季铵 盐，其包含一个或优选两个通过(C3-C6)亚烷基桥与N-原子相连的 (C10-C20)，优选(C14-C18)酰基链，例如1，2-二硬脂酰基-3-三甲基铵- 丙烷(DSTAP)、1，2-二棕榈酰基-3-三甲基铵-丙烷(DPTAP)、1，2-油酰 基-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)、1，2-二硬脂酰基-3-二甲基铵-丙烷 (DSDAP)。
所述带正电荷的成分通常与相应的负的反荷离子缔合，所述反荷 离子可以是单价-(例如卤素)、二价-(例如硫酸盐)或三价的(例如磷酸 盐)。该反荷离子实例优选地是在卤素离子，如F-(氟)、Cl-(氯)或 Br-(溴)中进行选择的。
中性和荷电化合物的混合物，特别是磷脂和/或脂质类化合物的混 合物可令人满意地用于形成微囊泡的封套。荷电脂质或磷脂的数量可 以为脂质或磷脂总量的约95％至约1摩尔％，优选地为在80％至20 摩尔％。
中性磷脂和荷电脂质或磷脂的优选混合物为，例如DPPG/DSPC、 DPPG/DAPC、DPPS/DSPC、DPPS/DAPC、DPPE/DPPG、DSPA/DAPC、DSPA/DSPC 和DSPG/DSPC。
根据本发明，含水混悬液中包含的两亲性材料进一步包括0.15％ 至1.0％携带亲水聚合物的脂质(在下文被称为“聚合物修饰的脂 质”)。所述的浓度优选地为至少0.3摩尔％，更优选为约0.5摩尔％。 优选的脂质是磷脂，更优选地是磷脂酰基肌醇乙醇胺 (phosphatitylethanolamine)，特别是磷脂酰基乙醇胺的脂肪酸二酯， 如上面列举的DMPE、DPPE、DSPE、DOPE、DAPE或DLPE。与脂质缔合 的亲水聚合物优选地以共价键与脂质进行连接。所述聚合物具有约 500至约50,000道尔顿的分子量，优选的分子量为约1,000至约 20,000道尔顿，更优地为约2,000至约10,000道尔顿。适合的亲水 聚合物是和可以选自壳多糖、透明质酸、聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇 (PPG)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚丙烯酰胺、聚(乙 酰基乙烯亚胺)、聚乙烯亚胺(PEI)、聚氰基丙烯酸酯、聚乳酸(PLA)、 聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)及其混合物和共聚物。该聚合物有利地 是可生物相容的和/或可生物降解的聚合物。该亲水聚合物优选地是分 子量为1,000至约10,000道尔顿，优选4,000至7,500道尔顿的PEG。 聚合物修饰的脂质的优选实例有用聚乙二醇(PEG)修饰的磷脂酰基乙 醇胺，即其中亲水的乙醇胺部分与分子量可变的PEG分子以共价键相 连的磷脂酰基乙醇胺。首字母缩写词PEG确定的是聚乙二醇本身以及 其任何进行了修饰的变型，包括携带保护基团或反应基团的聚乙二醇。 例如，它包括MPEG，即其中其末端羟基被甲基化的聚乙二醇。根据一 个优选的实施方案，将磷脂酰基乙醇胺，特别是DPPE或DSPE与不同 分子量的聚乙二醇例如PEG2000、PEG4000或PEG5000(即平均分子量 分别为2000、4000或5000的聚乙二醇)结合，从而形成相应分子量 的各聚乙二醇化的磷脂(例如DPPE-PEG或DSPE-PEG)。可商业获得的 适宜聚乙二醇化的脂质例如可得自Genzyme(Massachusetts，USA)。 其它适合的聚合物修饰的脂质有可商业获得的其中PEG通过酯键与脂 肪酸共价键相连的聚乙二醇化的脂质(例如聚氧乙烯二醇棕榈酸酯、硬 脂酸酯、月桂酸酯或油酸酯)，例如可以以Myrj的商品名获得；或可 以商业获得的其中PEG通过醚键与脂肪醇以共价键相连的聚乙二醇化 的脂质(例如聚氧乙烯二醇月桂基-、十六烷基-、硬脂酰基-或油酰基- 醚)，例如可以以Brij的商品名获得。
如前面所提到的，申请人观察到使用少量聚合物修饰的脂质时， 可获得至少可与含有较高数量聚合物修饰的脂质的微囊泡相比的充气 微囊泡。此外，就包含较高数量聚合物修饰的脂质的组合物而言，该 类聚合物修饰的脂质的低数量还使得可以获得较大量的充气微囊泡并 且向该微囊泡中混入更大体积的气体。
一般而言，与相应的携带较低分子量聚合物的脂质相比，可以使 用较低数量携带高分子量聚合物的脂质，而仍能得到类似的结果。
在一些情况中，特别是当该聚合物修饰的脂质是与上面所定义的 PEG结合的磷脂(例如聚乙二醇化的磷脂酰基乙醇胺)时，可能希望将 其相对数量增加至高至约5.0摩尔％，优选地升到3.0摩尔％。
在所述微囊泡的干制剂中可以存在其它赋形剂或添加剂，可以将 其它赋形剂或添加剂与用于其重构的含水载体在不必涉及(或仅部分 涉及)形成微囊泡的稳定封套的情况下一起添加。这些赋形剂或添加剂 包括pH调节剂、渗透压调节剂、粘度增强剂、乳化剂、膨胀剂等，并 且可以常规用量使用。例如可以使用诸如聚氧丙烯二醇和聚氧乙烯二 醇及其共聚物之类的化合物。粘度增强剂或稳定剂的实例有选自线性 和交联的多糖和低聚糖、糖、亲水聚合物如聚乙二醇的化合物。
由于充气微囊泡的制备可能涉及冷冻干燥或喷雾干燥步骤，所以 在制剂中包括冻干添加剂是有利的，所述添加剂如具有低温防冻和/ 或溶解保护(lyoprotective)作用的物质和/或膨胀剂，例如氨基酸如 甘氨酸；糖类，例如糖如蔗糖、甘露醇、麦芽糖、海藻糖、葡萄糖、 乳糖或环糊精、或多糖如葡聚糖；或聚二醇如聚乙二醇。
可以用任何生物相容的气体、气体前体或其混合物来制备本发明 的微囊泡。
所述气体包括例如空气；氮气；氧气；二氧化碳；氢气；一氧化 氮；稀有或惰性气体如氦、氩、氙或氪气；放射性气体如Xe133或Kr81； 超极化稀有气体如超极化氦、超极化氙或超极化氖；低分子量烃(例如 含高至7个碳原子)，例如链烷烃如甲烷、乙烷、丙烷、丁烷、异丁烷、 戊烷或异戊烷，环烷烃如环丁烷或环戊烷，链烯烃如丙烯、丁烯或异 丁烯，炔烃如乙炔；醚；酮；酯；卤化气体，优选氟化气体，如卤化、 氟化或预氟化的低分子量烃(例如含高至7个碳原子)；或上述任何成 分的混合物。当使用卤化烃时，所述化合物中的卤原子优选地至少一 些，更优选地全部为氟原子。
优选氟化气体，特别是全氟化的气体，在超声成像领域中尤其如 此。氟化气体包括含有至少一种氟原子的物质，例如氟代烃(含有一个 或多个碳原子和氟的有机化合物)；六氟化硫；氟化的，优选全氟化的 酮如全氟化丙酮；和氟化的，优选全氟化的醚如全氟化乙醚。优选的 化合物为预氟化的气体，如SF6或全氟化碳(全氟化烃)，即所有的氢 原子都被氟原子替代的烃，如例如EP 0554 213中所公开的那样，已 知这些气体能形成特别稳定的微囊泡混悬液，该文件被引入本文作为 参考。
术语全氟化碳包括饱和、不饱和和环状的全氟化碳。生物相容的、 生理上可接受的全氟化碳的实例有：全氟化烷烃，如全氟化甲烷、全 氟化乙烷、全氟化丙烷、全氟化丁烷(例如全氟化正丁烷，其任选地与 其它异构体如全氟化异丁烷混合)、全氟化戊烷、全氟化己烷或全氟化 庚烷；全氟化烯烃，如全氟化丙烯、全氟化丁烯(例如全氟化丁-2-烯) 或全氟化丁二烯；全氟化炔烃(例如全氟化丁-2-炔)；和全氟化环烷烃 (例如全氟化环丁烷、全氟化甲基环丁烷、全氟化二甲基环丁烷、全氟 化三甲基环丁烷、全氟化环戊烷、全氟化甲基环戊烷、全氟化二甲基 环戊烷、全氟化环己烷、全氟化甲基环己烷和全氟化环庚烷)。优选的 饱和全氟化碳具有结构式CnFn+2，其中n为1-12，优选2-10，最优选 地为3-8并且更优选地为3-6。适合的全氟化碳包括例如CF4、C2F6、 C3F8、C4F8、C4F10、C5F12、C6F12、C6F14、C7F14、C7F16、C8F18，和C9F20。
特别优选的气体是SF6或选自CF4、C2F6、C3F8、C4F8、C4F10或其混 合物中的全氟化碳；特别优选的是SF6、C3F8或C4F10。
还可有利地使用上述气体以任何比例混合的混合物。例如，该混 合物可包括常规气体，如氮气、空气或二氧化碳和形成稳定的微囊泡 混悬液的气体，如六氟化硫或如上所述的全氟化碳。适合气体混合物 的实例可以参见，例如WO 94/09829，其被引入本文作为参考。特别优 选下列组合：气体(A)和(B)的混合物，其中气体(B)为氟化气体，优选 自SF6、CF4、C2F6、C3F6、C3F8、C4F6、C4F8、C4F10、C5F10、C5F12或其混合 物，和(A)选自空气、氧气、氮气、二氧化碳或其混合物。气体(B)的 量可以占总混合物的约0.5％至约95％v/v，优选地占约5％至80 ％。
在某些情况下，可能需要包括气体物质的前体(即能够在体内转化 成气体的材料)。该气体前体和由其衍生的气体优选地是生理学上可接 受的。这些气体前体可以是pH-激活的、光-激活的、温度激活的等。 例如，某些全氟化碳可以用作温度激活的气体前体。这些全氟化碳如 全氟化戊烷或全氟化己烷具有高于室温(或生产和/或保存该物质的 温度)，但是低于体温的液/气相转变温度；因此，它们在人体内发生 液/气相转变并且转化为气体。
对于超声波回波描记术来说，生物相容的气体或气体混合物优选 自空气、氮气、二氧化碳、氦、氪、氙、氩、甲烷、卤代烃(包括氟化 气体如全氟化碳和六氟化硫)或其混合物。可有利地使用全氟化碳(特 别是C4F10或C3F8)或SF6，其任选地与空气或氮气混合。
为了用于MRI，微囊泡优选地包含超极化稀有气体如超极化氖、 超极化氦、超极化氙、或其混合物，其任选地与空气、二氧化碳、氧 气、氮气、氦、氙或上述任何卤代烃混合。
为了用于闪烁扫描术，微囊泡优选地包含放射性气体如Xe133或 Kr81或其混合物，其任选地与空气、二氧化碳、氧气、氮气、氦、氪 或上述任何卤代烃混合。
本发明的微囊泡可以按照本领域已知的任何方法来进行制备。该 生产方法通常涉及干粉状材料形式的前体的制备，该干粉状材料包含 上述两亲性材料，优选通过冻干(冷冻干燥)包含所述材料的含水或有 机混悬液来进行制备。
例如，如WO 91/15244中所描述的那样，可以用任何形成脂质体 的方法来将成膜两亲化合物首先转化成层状形式。为此，可以对包含 成膜脂质和任选的其它添加剂(例如粘度增强剂、非成膜表面活性剂、 电解质等)的水溶液进行高速机械匀浆或在声学或超声频率下进行声 处理，然后将其冷冻干燥，从而形成可自由流动的粉末，然后将其在 存在气体的情况下保存。在冻干之前，如US 5,597,549中所公开的那 样，可以任选地进行洗涤步骤。
根据另一个实施方案，(如US 5,597,549中所描述的那样)可以将 成膜化合物和亲水的稳定剂(例如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯 醇、乙醇酸、苹果酸或麦芽醇)溶解于有机溶剂(例如叔丁醇、2-甲基 -2-丁醇或C2Cl4F2)中，并将所述溶液冷冻干燥，从而形成干燥的粉末。
优选地，如在国际专利申请WO2004/069284中所公开的那样，将 磷脂(选自上述所例举的物质并包括至少一种上述带电荷的磷脂)和低 温保护剂(如前面所列出的那些物质，特别是碳水化合物、糖醇、聚乙 二醇及其混合物)在搅拌下分散于水和与水不混溶的有机溶剂(例如支 链或直链链烷烃、烯烃、环烷烃、芳族烃、烷基醚、酮，卤代烃、全 氟化烃或其混合物)的乳液中。该乳液可以通过用本领域已知的任何适 当的乳液生产技术，在存在至少一种磷脂的情况下处理含水介质和溶 剂而得到，所述技术如，例如声处理、振荡、高压匀浆法、微量混合、 膜乳化、高速搅拌或高剪切混合。例如可使用转子-定子式匀浆器，如 PT3000。转子-定子式匀浆器的搅拌速度可以根据乳液的组 分、乳液的体积、有机溶剂的相对体积、包含该乳液的容器的直径和 所需的乳液中溶剂微滴的最后直径来进行选择。或者，可以用微量混 合技术来对该混合物进行乳化，例如通过第一入口向该混合器中引入 有机溶剂(流速为例如0.05-5ml/min)，和通过第二入口导入水相(例 如流速为2-100ml/min)。然后将该微量混合器的出口与包含所述水 相的容器连接，以便使得水相随后立即从所述容器中流出并被导入到 装有量逐渐增加的被乳化的溶剂的微量混合器中。当所有体积的溶剂 都被加入时，使得自该容器的乳液通过微量混合器再循环另一段预定 时间，例如5-120分钟，以便完成所述乳化。根据乳化技术，可以在 乳化步骤期间逐渐导入有机溶剂或者可以在乳化步骤开始前立刻导 入。或者，可以在乳化步骤期间将含水介质逐渐加入到与水不相混溶 的溶剂中，或可以在乳化步骤开始前立刻加入。优选地将磷脂分散在 水性介质中，此前将该介质与有机溶剂混合。或者，可以将磷脂分散 在有机溶剂中或将其在乳化步骤开始之前或期间分别加入到该水-有 机混合物中。然后，根据常规技术对由此获得的包含由磷脂材料(并任 选地由其它两亲成膜化合物和/或添加剂)包围和稳定化的溶剂微滴的 微乳液进行冷冻干燥，从而得到冷冻干燥的材料，储存该冻干材料(例 如将其在存在适合的气体之下储存在玻璃小瓶中)，可以用水性载体重 构该材料，从而最后得到一种其中微囊泡的量度和尺寸分布大体上与 该微滴混悬液相当的充气微囊泡悬浮液。
用于制备充气微囊泡的另一种方法包括通过在存在需要的气体的 条件下为含有磷脂(和任选的其它两亲成膜化合物和/或添加剂)的水 性介质提供受控制的高搅拌能量(例如用转子定子搅拌器来提供高搅 拌能量)来产生一种气体微囊泡分散液，和将所得到的分散液冻干，从 而得到干燥的重构产物。例如，该方法的一个实例可以参见 WO97/29782，其被引入本文作为参考。
也可以用喷雾干燥技术(例如参见US 5,605,673)获得干燥的粉 末，其在与生理学可接受的含水载体接触时能够重构，从而获得充气 微囊泡。
用任何上述技术得到的干燥的或冷冻-干燥的产物通常是粉末或 饼状物，并且可以在与所需气体接触的情况下被储存(例如在玻璃小瓶 中)。该产物可在存在上面提及的任何一种气体的情况下，在适合的生 理学可接受的含水液体载体(通常为可注射的)中容易地重构，从而在 对该混悬液轻轻搅拌的条件下形成充气微囊泡。
本发明的微囊泡可以任选地包含靶向配体、诊断试剂和/或生物活 性剂，其可以被包含在微囊泡结构中或者与其缔合。
术语“靶向配体”在其含义内包括具有或能够促进本发明组合物 的微囊泡对体内任何生物学或病理学部位的靶向活性(例如包括选择 性结合)的任何化合物、部分或残基。靶向配体可以缔合的目标包括组 织，例如心肌组织(包括心肌细胞和cardiomyocites)、膜组织(包括 内皮和上皮)、层状体、结缔组织(包括间质组织)或肿瘤；血液凝块； 和受体，例如用于肽激素的细胞表面受体、神经递质、抗原、补体片 段、和免疫球蛋白及甾醇激素的胞质受体。
该靶向配体可以是合成、半合成或天然存在的。可用作靶向配体 的材料或物质例如包括但不限于蛋白质，包括抗体、抗体片段、受体 分子、受体结合分子、糖蛋白和外源凝集素；肽，包括寡肽和多肽； 肽模拟物；糖类，包括单糖和多糖；维生素；甾醇、甾醇类似物、激 素、辅因子、生物活性剂和遗传物质，包括核苷、核苷酸和多核苷酸。
适合的目标和靶向配体的实例例如在美国专利号6,139,819中进 行了公开，它被引入本文作为参考。
该靶向配体可是与所述微囊泡的气体组分混合的化合物本身，或 者可以是与用于形成微囊泡的两亲性分子结合的化合物。
在一个优选的实施方案中，该靶向配体可以通过共价键与微囊泡 的两亲性分子结合。在这种情况下，需要出现在两亲性分子上的特有 反应部分将取决于要与之偶合的特定靶向配体。作为一个实例，如果 靶向配体可以通过氨基基团与两亲性分子连接，则该两亲性分子的适 宜反应部分可以是异硫氰酸酯基团(其将形成硫脲键)、活性酯(以形成 酰胺键)、醛基(用于形成被还原成烷基胺键的亚胺键)等；如果靶向配 体可以通过巯基基团与该两亲性分子连接，则对于该两亲性分子来说 适宜的互补活性部分包括卤代乙酰基衍生物或马来酰亚胺(以形成硫 醚键)；并且如果靶向配体可以通过羧基与该两亲性分子连接，则对 于该两亲性分子来说适宜的活性部分可以是胺和酰肼(以形成酰胺或 烷基酰胺键)。为了共价结合需要的靶向配体，形成微囊泡壳的两亲化 合物的至少部分应因此包含适和的活性部分，并且将根据已知技术将 含有互补性官能团的靶向配体与之相连，例如通过将其添加到含有所 述的微囊泡两亲性组分的混悬液中。该两亲性化合物优选地是携带亲 水聚合物的脂质，如前面所提到的那些物质，优选聚乙二醇化的磷脂。 在这种情况中，靶向配体被连接到亲水聚合物上的适宜活性部分上。 可以在制备微囊泡前将该两亲性化合物与所需靶向配体结合，和由此 获得的组合可被用于所述微囊泡的制备过程中。或者，可以在微囊泡 的制备过程中将靶向配体与各自的两亲性化合物进行连接。
根据另一实施方案，靶向配体还可以通过物理和/或静电相互作用 适当地与微囊泡缔合。作为一个实例，在该互补部分将连接到靶向配 体的同时，可以向两亲分子中引入对互补部分具有高度亲和力和选择 性的功能部分。例如，在抗生物素蛋白(或抗生物素蛋白链菌素)部分 (其对抗生素具有高度亲和力)可以与磷脂(或与聚乙二醇化磷脂)共价 连接时，互补生物素部分可以被混入到适合的靶向配体，例如肽或抗 体中。该生物素标记的靶向配体将因此通过抗生物素蛋白-生物素偶合 系统与微囊泡的抗生物素蛋白标记的磷脂缔合。或者，磷脂和靶向配 体都可具有生物素部分，然后通过抗生素蛋白(它是能桥接两个生物素 部分的双官能组分)彼此偶合。在上述US 6,139,819中也公开了磷脂和 肽的生物素/抗生物素蛋白偶合的实例。或者，可以通过范德华相互作 用、静电相互作用和其它缔合过程使靶向配体与两亲性分子缔合或连 接。
根据另外一个实施方案，靶向配体可以是与形成微囊泡的组分混 合并从而最终被混入到所述微囊泡结构中的化合物，例如，在国际专 利申请WO 98/18501或99/55383中公开的脂肽，二者均被引入本文作为 参考。
或者，可以首先制备一种包含具有能够与靶向配体的相应互补部 分相互作用的适合部分的化合物(脂质或聚合物-修饰的脂质)的微囊 泡；其后，将所需的靶向配体加入到该微囊泡混悬液中，从而使相应 的互补部分结合在微囊泡上。微囊泡可以导向于其上的适宜特定靶的 实例有例如纤维蛋白和激活的血小板上的GPIIbIIIa结合受体。纤维蛋 白和血小板实际上一般出现在“血栓”，即可以在血液中形成并造成 血管阻塞的凝结块中。例如，在上面引用的US 6,139,819中公开了适 宜的结合肽。在例如国际专利申请WO 02/055544中公开了对纤维蛋白 靶向有特异性的另一些结合肽，其被引入本文作为参考。
重要靶的其它实例包括易损血小板中的受体和肿瘤特异性受体， 如激酶域(KDR)和VEGF(血管内皮生长因子)/KDR复合物。例如，在国 际专利申请WO 03/74005和WO 03/084574中公开了适合于KDR或 VEGF/KDR复合物的结合肽，二者均被引入本文作为参考。
术语“诊断试剂”在其含义内包括可用于对患者的体内部位进行 成像的方法和/或诊断患者体内的疾病存在与否的任何化合物、组合物 或颗粒。被混入或缔合到本发明组合物中的微囊泡中的诊断剂特别可 以是使得与诊断技术(包括磁共振成像、X-放射，特别是计算机X线体 层照相术、光学成像、核成像或分子成像)有关的成像增强的任何化合 物、组合物或颗粒。适合的诊断试剂的实例有例如磁毫微颗粒、碘化 化合物如、或顺磁性离子复合物，如疏水性钆复合物。
术语“治疗剂”在其含义内包括可用于任何治疗应用，如用于治 疗患者疾病的方法中的任何物质、组合物或颗粒，以及能够在体外和/ 或体内发挥或负责发挥生物活性作用的任何物质。因此，治疗剂包括 能够用于治疗(包括诊断、预防、减轻、疼痛缓解或治愈)患者的任何 病理状态(包括疾病、痛苦、病变或损伤)的任何化合物或材料。治疗 剂的实例有药物、药品、生物活性剂、细胞毒素剂、化疗剂、放射治 疗剂、蛋白、天然或合成的肽(包括寡肽和多肽)、维生素、甾醇和遗 传物质(包括核苷、核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸和质粒)。其中，优 选药物或药品。
本发明的微囊泡还可以与其它组分例如脂质体或胶束缔合，所述 组分可以与微囊泡简单地混合在一起，或者可以与微囊泡的稳定化封 套通过物理和/或化学相互作用例如通过共价键、静电或离子相互作 用、范德华相互作用、疏水或亲水相互作用形成组件。这些进行了缔 合的微囊泡组合物的实例及其制备的实例在例如，美国专利专利号 6,258,378和国际专利申请WO 2005/063305和WO2005/063306中进行 了公开，二者均被引入本文作为参考。这些可缔合的或与微囊泡缔合 的组分又可以携带上面所列的任何靶向配体、诊断试剂或生物活性剂， 这些物质因此将通过所述的被缔合的组分与微囊泡缔合。例如可以将 磁毫微颗粒与如前所述的带电荷的两亲性材料混合到一起，以稳定所 述的颗粒并且保持它们分散在水溶液中(如在US 5,545,395中所公开 的那样，其被引入本文作为参考)，从而使其与微囊泡缔合。或者，可 以将钆复合物与适当的成胶束化合物，例如欧洲专利EP 804 251(其被 引入本文作为参考)中公开的化合物混合，并且可以使形成的胶束与微 囊泡缔合。类似地，可以将治疗剂制备成胶束或脂质体混悬液并且使 其以这种形式与微囊泡缔合。
本发明的微囊泡优选地以干粉形式进行储存，并且该类形式可有 利地被包装在双组件诊断和/或治疗试剂盒中，优选地经注射给药。该 试剂盒优选地包括包含与所选择的形成微囊泡的气体接触的冷冻-干 燥组分的第一个容器；和包含生理学可接受的含水载体的第二个容器。 适合载体的实例有水(通常为无菌、无热源的水(以便可能的避免对中 间冻干产物的污染))、水溶液，如盐水(其有利地被平衡，从而使得用 于注射的最终产品不低渗)、或一种或多种张力调节物的水溶液，所述 张力调节物如盐或糖、糖醇、乙二醇或其它非离子多元醇材料(例如葡 萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、甘油、聚乙二醇、丙二醇等)。所述的 双组件试剂盒可包括两个独立的容器或一个双室容器。对前一种情况 来说，此容器优选地是传统的隔膜密封小瓶，其中用一种隔膜对装有 冻干残余物的小瓶进行密封，可以用任选地预填充了的注射器通过该 隔膜对载体液体进行注射。在这种情况下，然后被用作第二个组件的 容器的注射器还被用于注射造影剂。在后一种情况中，该双室容器优 选地是双室腔注射器，并且一旦冻干物被重构，就进行适当的混合或 轻微震摇，此容器可直接地被用于注射造影剂。
本发明的微囊泡可被用于多种诊断和/或治疗技术中，所述技术特 别是包括超声和磁共振。术语诊断成像在其含义内包括其中使用造影 剂使得可以增强一种动物(包括人)体的部分或一部分的显像(包括用 于临床前和临床研究目的的成像)的任何方法。术语治疗成像在其含义 内包括用于治疗患者疾病的任何方法，其包括使用造影剂(例如用于将 生物活性化合物输送到所选择的靶点或组织)，并且其能够在体外和/ 或体内发挥或负责发挥生物活性作用。可能的其它诊断成像应用包括 闪烁扫描术、光学成像、和X-射线成像，包括X-射线相位反差成像。 在超声波应用中可以使用多种成像技术，例如包括基波和谐波B-模式 成像、脉冲或相反转成像以及基波和谐波多普勒成像；如果需要的话， 可以使用三-二维成像技术。本发明的微囊泡通常以每kg患者体重约 0.01至约1.0μl气体的浓度被给药，其取决于例如它们各自的组成、 被成像的组织或器官、和/或所选择的成像技术。这种一般性的浓度范 围当然可以根据特殊的成像应用而改变，例如当能够以非常低的剂量 观察信号如在彩色多普勒或功率脉冲反转中时。
下面的实施例将有助于进一步对本发明进行说明。
实施例
在下面的实施例中，位于混悬液中的充气微囊泡的数量和其中含 有的气体体积是用Coulter计数器(配有30μm孔的Counter Mark II 装置，测定范围为0.7至20μm)来进行测定的。
实施例1
用下述方法制备一种混悬液：将120mg DAPC和70mg DPPS溶 解于含有4g甘油和1g聚丙二醇的100ml水性混悬液中。在70℃下加 热混合物，然后将其通过0.2μm聚碳酸酯膜()挤压三次。 然后将所得混悬液在C4F10气体下，用(20,000rpm，3分钟) 在高速机械搅拌下进行匀化。将由此得到的混悬液离心以便除去过量 的脂质颗粒、甘油和丙二醇，将其重新混悬于10％葡聚糖(MW 15000) 中，并将其分装到10ml玻璃小瓶中。将该小瓶(每个装有2ml混悬液) 在-45℃下冷冻，并且在20mbar的减压条件下进行冻干。使得到的干 燥样品在小瓶中与C4F10接触，然后用2ml无菌水将其重构。
如上面所述的那样测定该混悬液中的微囊泡浓度，其为约 4.26·109个微囊泡/ml。在表1的结果中，这个数量在100％下被归 一化，在表1中本制剂被称为制剂1A。
重复进行上面的制备操作，但是向起始混合物中分别加入约0.5 摩尔％(3.2mg)、1摩尔％(6.6mg)、2摩尔％(13mg)、3摩尔％(20 mg)和5摩尔％(34mg)的DPPE-PEG2000，由此得到相应的制剂1B、 1C、1D、1E和1F。表1进一步表示了用这四个制剂测得的归一化了 的微囊泡的数量。
表1：聚合物修饰的脂质的数量-微囊泡浓度
制剂 DPPE-PEG2000的浓度 微囊泡的数量
(摩尔％) (％)
1A - 100
1B 0.5 100
1C 1 100
1D 2 60
1E 3 40
1F 5 30
正如从上面的表格可以推出的那样，过量的聚合物修饰的脂质对 所得微囊泡的数量有消极影响。
实施例2
在60℃下，将60mg DAPC、30mg DPPG-Na和4g的PEG4000分 散到20ml叔丁醇中，直至得到澄清的溶液。然后，将该溶液放在一个 圆底玻璃瓶中，然后将其在-45℃下冷冻并且在20mbar的减压条件下 冻干。将得到的干燥样品放在20ml的玻璃小瓶中并且使其暴露于SF6中(100mg冻干样品/小瓶)，然后用10ml生理盐水(0.9％NaCl)将其 重构。
如上面所述的那样测定该混悬液中的微囊泡浓度，其为约 1.90·109个微囊泡/ml。在表2的结果中，这个数量在100％下被归 一化，在表2中本制剂被称为制剂2A。
重复进行上面的制备操作，但是向起始混合物中分别加入约0.46 摩尔％(1.5mg)、0.97摩尔％(3.2mg)、1.51摩尔％(5mg)、2.97 摩尔％(10mg)和7.12摩尔％(40mg)的DPPE-PEG2000，由此得到相 应的制剂2B、2C、2D、2E和2F。表2进一步表示了用这四个制剂测 得的归一化了的微囊泡的数量。
表2：聚合物修饰的脂质的数量-微囊泡浓度
制剂 DPPE-PEG2000的浓度 微囊泡的数量
(摩尔％) (％)
2A - 84
2B 0.46 100
2C 0.97 93
2D 1.51 62
2E 2.97 53
2F 7.12 39
正如从上面的表格可以推出的那样，过量的聚合物修饰的脂质对 所得微囊泡的数量有消极影响。
实施例3
根据下面的方法制备充气微囊泡的各种混悬液(在表2中被称为 制剂3A-2F)：用超声探针将25mg DSPC/DSPA(如表3中所示，以不 同的摩尔比使用)的混合物溶解于4ml环辛烷中直至完全溶解。将这一 有机相加入到50ml用(11,000rpm，3分钟)在高速机械 搅拌条件下进行了匀化的10％PEG4000溶液中。在搅拌下，在80℃ 下，将由此得到的乳液加热一小时，然后将其分装到10ml玻璃小瓶中。 在-50℃下冷冻这些小瓶(每个小瓶装有1ml混悬液)并且将其在0.2 mbar的减压条件下冻干。将得到的干燥样品在小瓶中暴露于35/65 (vol./vol.)C4F10/N2的混合物，然后用2ml无菌水将其重构。
重复进行上述制备，但是向该混合物中(见表3)分别加入0.5摩 尔％或1摩尔％的DSPE-PEG，从而得到相应的制剂3A’至3F’。
在制备之后立刻以及在制备后6小时，对上述每一个制剂的微囊 泡浓度进行测量。表3的结果表示的是各制剂在6小时后的微囊泡百 分比。
表3：携带聚合物的脂质对微囊泡稳定性的影响
制剂 DSPC/DSPA的比例 聚乙二醇化脂质的种 类和数量 (摩尔％) 6小时后的微囊泡数量 (相对于初始数量而言的 ％) 3A 3A’ 90/10 90/10 - DSPE-PEG 5000 0.5％ 64％ 84％ 3B 3B’ 80/20 80/20 - DSPE-PEG 5000 0.5％ 57％ 90％ 3C 3C’ 70/30 70/30 - DSPE-PEG 5000 0.5％ 67％ 96％ 3D 3D’ 90/10 90/10 - DSPE-PEG 2000 1.0％ 46％ 83％ 3E 3E’ 80/20 80/20 - DSPE-PEG 2000 1.0％ 48％ 83％ 3F 3F’ 95/5 95/5 - DSPE-PEG 2000 1.0％ 45％ 85％
上述结果表明，在6小时后，与其中不存在聚合物修饰的脂质的 制剂不同，聚合物修饰的脂质的最低限度数量使得保存了相对高数量 的微囊泡。
实施例4
用下面的方法制备6种具有DPPE-MPEG 5000数量(见表4中的4A 至4F)的充气微囊泡组合物。
用超声探针将25mg DSPC/DSPA(摩尔比80/20)混合物溶解于4ml 环辛烷中直至其完全溶解。将这一有机相加入到50ml用(11,000rpm，3分钟)在高速机械搅拌条件下进行了匀化的10％ PEG4000溶液中。在搅拌下，在80℃下将该乳液加热一小时，然后将 其用一个体积的10％PEG4000溶液进行稀释。将所得乳剂分装在10ml 玻璃小瓶中。在-50℃下冷冻这些小瓶(每个小瓶装有0.75ml混悬液) 并且将其在0.2mbar的减压条件下冻干。将得到的干燥样品在小瓶中 暴露于35/65 C4F10/N2的混合物，然后用1.5ml生理盐水溶液将其重 构。
然后，用计数器测量上面各制剂所得微囊泡中捕获的气 体数量和上面各制剂中的微囊泡总数。
下面的表4表示了气体体积的测量结果。
表4：被捕获到微囊泡中的气体数量
正如从上面的表格可以推出的那样，在被稳定了的微囊泡组合物 中低含量的聚合物修饰的脂质使得可以在所述微囊泡中混入相对较高 数量的气体。
然后在6小时后，测定混悬液微囊泡的数量并将其与各混悬液中 的初始数量进行比较。结果见表5。
表5：6小时后，含不同浓度携带聚合物的脂质的微囊泡的稳定性