本申请是2003年6月27日递交的美国申请系列号10/607,623的连续 部分，将其全部内容并入本文作为参考。
1.发明领域
本发明涉及设计用于治疗或处理急性冠状动脉综合征，特别是，不稳 定型心绞痛和急性心肌梗塞的方法和组合物。本发明的方法包括施用有效 量的包含一种或多种治疗剂的制剂，所述治疗剂特异性地降低或抑制吞噬 细胞的活性和/或消除或减少吞噬细胞的量，所述吞噬细胞包括，但不限于 巨噬细胞和单核细胞。
2.发明背景
冠状动脉疾病是工业化国家死亡的主要原因。在美国，50-60％的心脏 病发作发生在没有冠状动脉疾病记录的人中。该疾病的主要病理学原因是 动脉粥样斑块的形成。动脉粥样斑块是血管壁中增厚的区域，其源自胆固 醇、增殖性平滑肌细胞和炎性细胞的积累。
动脉粥样斑块
通常，动脉粥样斑块由血管内膜中升高的焦点组成，其具有被纤维状 帽所覆盖的细胞外脂质的中心核。在斑中的核包含结晶胆固醇、胆固醇酯、 磷脂、细胞降解产物和胶原蛋白残余物。所述纤维状帽将斑的核与血管或 动脉的内腔相分离并且主要由结缔组织组成，其是由胶原蛋白、弹性蛋白、 蛋白聚糖和其它细胞外基质物质构成的致密的纤维性细胞外基质。所述纤 维状帽在厚度、平滑肌细胞数目以及巨噬细胞和胶原蛋白含量上有所不 同。(Vallabhajosula等，1997，J.Nucl.Med.38(11)：1788-1796)。
动脉粥样斑块的特征可以描述为对于破裂有活性和有倾向(“脆弱的 或高危性斑”)的或者失活的和相对稳定的(“稳定斑”)。脆弱的、高危性 的或易于破裂的斑的特征可以描述为大量的炎性细胞(诸如巨噬细胞)、薄 的纤维状帽和大的脂质核。动脉粥样斑块中的脂质库的大小以及覆盖性的 纤维状帽的厚度是预测斑稳定性的重要特性。纤维状帽的边缘(肩状区) 是高压力位置并且易于破裂，部分归因于炎性细胞(诸如巨噬细胞)在该 区域的积聚以及它们的引起组成纤维状帽物质降解的酶的分泌(Moreno 等，Circulation.，1994，90：775-8；van der Wal等，1994，Circulation 89：36- 44.；Jander等，1998，Stroke，29：1625-1630)，其能够导致斑的破裂。
充满脂质的斑的破裂将高度凝血酶原性的核和动脉壁的内皮下血管 平滑肌细胞组分暴露于循环的血液。紧接着，血小板激活、附着和聚集。 血小板附着和激活导致凝集因子的释放以及凝固级联的起始。被释放的生 长因子，特别是血小板衍生生长因子(PDGF)刺激血管平滑肌细胞的增殖和 迁移。血管平滑肌细胞的增殖和迁移能够导致斑的改型和增加血管狭窄， 或者与血小板相互作用，导致血栓形成增加(Pasterkamp等，2000，J.Clin. Basic Cardiol.3：81-86)。由脆弱的斑引发的获得性血栓症能够引发不稳定 型心绞痛、急性心肌梗塞、中风、外周动脉疾病的急性恶化或突变性冠状 死亡。
不稳定型心绞痛
心脏需要富氧的血液以行使功能。右和左侧冠状动脉由主动脉分枝并 携带氧合血液到心脏组织。当冠状动脉不能递送足够量的富氧血液(一种 称为低氧的状态)到心脏，则产生胸痛、压迫、或通常称为心胶痛的不适。 如果这种情形得以持续，氧恶化能够可逆或不可逆地损害心肌本身(一种 称为局部缺血的情形)。
根据其严重性和发生模式，心绞痛被宽泛地划分为稳定型的或不稳定 型的。当增强的体力活动(例如匆忙穿过街道或者爬长楼梯)提高对富氧 血液的需求时发生稳定型心绞痛。由于多种可能的因素(最普遍的是一种 或多种阻塞的冠状动脉)，由冠状动脉血流产生的供应不能满足这种提高 的需求并且产生低氧。不稳定型心绞痛被理解为一种伴随着较小程度的体 力活动、增加的频率或在休息时(即，无体力活动)发生的心绞痛。在休 息时发生的心绞痛代表其最严重形式中的状态。它通常是由破裂斑位点上 冠状动脉中血液凝块的形成所引发的，并且，如果不予治疗，它将导致心 脏病发作和对心脏不可逆的损害。
不稳定型心绞痛可能归因于已变得不稳定的脆弱的斑的部分破裂。斑 的部分破裂引发形成血栓，但是并未完全阻塞动脉。内源性抗凝块机制作 用来打碎凝块，但是随着时间过去，斑继续破裂并且重复凝块发作。尽管 此患者可能未曾患心肌梗塞，但他或她处于患心肌梗塞的高度危险中(例 如，如果不稳定的斑完全破裂或者如果内源性抗凝块机制不能在动脉完全 阻塞之前消除凝块)。由患有不稳定型心绞痛的患者中死后取得的裂解的 纤维状帽经常在斑破裂位点比来自稳定型心绞痛病例的斑更重度地被巨 噬细胞所浸润。
急性心肌梗塞
急性心肌梗塞(″AMI″)指一种导致心肌组织坏死的常见临床状况。 这种状况是本领域公知的并且特征是疼痛的发生(在大多数病例中心前疼 痛)、特征性心电图变化和由坏死性心脏组织释放的细胞内酶(诸如肌酸 酐磷酸激酶和α-羟基丁酸酯脱氢酶)或心脏蛋白质(如肌原蛋白复合物的 组分和肌红蛋白)的血浆水平的提高。AMI可能伴随低血压、循环衰竭、 肺水肿和心律不齐。在大多数情况下，但并非全部，AMI的起因是血管损 伤和冠状动脉血管中的血栓形成，其导致这些血管变得阻塞，随后受损的 血液流向受危害的心肌(Fuster等，1992，New Engl.J：Med.，326：242-310)。 在大多数情况下，冠状动脉血管的阻塞时间可以由病史，细胞内心肌酶血 浆水平的进程和心电图变化来估计。
许多心肌梗塞(心脏病发作)的起始事件是动脉粥样斑块的破裂。这 种破裂可以导致供给梗塞地带的冠状动脉中血栓或血液凝块的形成。梗塞 地带或区域，正如它通常被称作的，是起因自血液循环障碍的坏死区域。 形成的血栓由血纤蛋白和血细胞的组合组成。由凝块引发的阻塞的定位、 程度和持续时间决定梗塞区的质量和损害程度。最终，由冠状动脉阻塞引 发的心肌损害的程度依赖于受影响血管所供给的“领域”、血管的阻塞程 度、旁系血管向受影响组织供应的血液量以及血液供应突然被限制的心肌 对氧的需要(Pasternak和Braunwald，1994，Acute Myocardial Infarction， Harrison′s Principles of Internal Medicine，第13版，1066-77页)。
巨噬细胞和炎症反应
巨噬细胞涉及一些冠状动脉综合征的原因和/或病理学。降解斑的纤维 状帽的蛋白水解蛋白质的巨噬细胞分泌减小了帽的厚度以及增加另外的 巨噬细胞浸润，由此有助于斑的不稳定性。所以巨噬细胞被认为在斑破裂 中具有中心作用并且它们以大浓度的存在被认为对于这种破裂是预测性 的。事实上，已知动脉粥样斑块的纤维状帽的侵蚀和/或破裂调节动脉血栓 形成，导致急性局部缺血事件的发作。显然在脆弱的动脉粥样斑块位点上 的破裂是急性冠状动脉综合征，诸如不稳定型心绞痛、心肌梗塞或猝死的 最常见原因。
炎症与急性心肌梗塞的发病机理以及AMI后的治愈和修复都有关。 心肌局部缺血引起炎症反应。此外，再灌注，目前AMI急性治疗的主要 方法，也促进炎症。再灌注包括阻塞性血栓的快速溶解和血流恢复到血液 供应被切断的心脏区域中。传统上认为局部缺血性心肌组织中炎性细胞的 存在代表对伤害的病理生理学反应。不过，实验研究已经显示尽管对于治 愈是重要的，炎性细胞流向组织，特别是作为吞噬细胞的巨噬细胞导致了 超过局部缺血单独引发的组织伤害。
巨噬细胞和其它白细胞在局部缺血不久后浸润心肌。巨噬细胞分泌几 种细胞因子，其刺激成纤维细胞增殖。然而，激活的巨噬细胞也分泌细胞 因子和其它促进心肌损害的介质。因此，巨噬细胞流入心肌增加了心肌坏 死并延伸了梗塞区。因而，尽管炎症的急性期是对于治愈过程的必需反应， 持续的激活事实上对于梗塞区以及它周围的区域，所谓的“外周梗塞区” 是有害的。
心肌局部缺血之后的炎症反应在确定由激活的巨噬细胞引发的结果 性损害的严重性中是关键的。已经显示炎性趋化因子(巨噬细胞趋化蛋白 -1(MCP-1)，巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)的血浆水平与随后的心力衰 竭和左心室功能障碍相关联(见，例如，Parissis等，2002，J.Interferon Cytokine Res.，22(2)：223-9)。在AMI后两天和三天外周性单核细胞增多症 (单核细胞数目提高)与左心室功能障碍和左心室动脉瘤相关，提示单核细 胞在再灌注的AMI后左心室重构发展中的可能作用(Maekawa，Y等，2002， J.Am.Coll.Cardiol.，39(2)：241-6)。急性心肌梗塞后的左心室重构是梗塞 延伸的过程，其后是进行性的左心室扩张并且与不利的临床结果相关。另 外，巨噬细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的血浆水平在患有急性心肌梗塞的患者 中得以提高。MCP-1由心肌局部缺血/再灌注损伤所诱导并且这种趋化因 子的中和显著减小梗塞大小。
在几种冠状动脉阻塞/再灌注模型中，显示冠状动脉阻塞后通过非特异 性抗炎性复合物对炎性反应的抑制减小了梗塞区域(见，例如，Squadrito 等，1997，Eur.J.Pharmacol.；335：185-92；Libby等，1973，J.Clin.Invest.，3： 599-607；Spath等，1974，Circ.Res.，35：44-51)。不过，这些非特异性方案与 副作用相关联，诸如瘢痕形成和治愈的干扰，并且在一些患者中，形成动 脉瘤并且心室壁破裂。由此，这些方案不可能进行临床使用。不过，在冠 状动脉阻塞模型中，显示动物模型遭受增加的梗塞大小和心肌坏死，所述 动物模型由于缺少抗炎性细胞因子白介素-10，具有降低的抑制巨噬细胞功 能的能力(Yang，Z等，2000，Circulation，101：1019-1026)。
本发明的一个目的是鉴定能够阻抑来自患急性冠状动脉综合征(特别 是不稳定型心绞痛或和急性心肌梗塞)的患者的吞噬细胞(特别是巨噬细胞 和单核细胞)的因子的积聚和/或生物学功能包括分泌的治疗剂。
本发明的另一个目的是发展治疗急性冠状动脉综合征(特别是不稳定 型心绞痛或和急性心肌梗塞)以及稳定与这些综合征相关联的斑的方法。
3.发明概述
本发明涉及设计进行急性冠状动脉综合征，特别是，不稳定型心绞痛 和急性心肌梗塞的治疗或处理的方法和组合物。本发明的方法包括施用有 效量的含有一种或多种治疗剂的制剂，所述治疗剂特异性地抑制吞噬细胞 的活性和/或减少吞噬细胞的量，所述吞噬细胞包括，但不限于巨噬细胞和 单核细胞。施用按照本发明的含有一种或多种治疗剂的制剂作为一种急性 治疗而起作用，其针对稳定患者的冠状动脉综合征状况。在一个实施方案 中，将含有一种或多种治疗剂的制剂给药于患有不稳定型心绞痛的患者以 稳定脆弱的或不稳定的斑。在另一个实施方案中，将制剂施用于目前正在 患或近来已患急性心肌梗塞的患者以使得梗塞大小和心肌坏死最小化。
在优选的实施方案中，所述制剂特异性靶向吞噬细胞。因为吞噬细胞 具有独特的吞噬作用能力，在这些实施方案中，制备所述制剂从而使得它 们包含这种特性的颗粒，所述特性是通过吞噬作用主要地或排他性地进入 细胞。所述制剂可以包含被包封的治疗剂、被包埋的治疗剂或颗粒治疗剂。 一旦被吞噬，治疗剂就从制剂中释放入靶向的吞噬细胞，例如，巨噬细胞 和单核细胞，并且抑制吞噬细胞的功能和/或破坏所述吞噬细胞。
在一个实施方案中，本发明涉及一种通过向需要其的个体施用有效量 的含有被包封的治疗剂的制剂从而治疗急性冠状动脉综合征的方法。将所 述治疗剂包封于合适的特定大小的载体中。所述制剂根据其特性，如，例 如，大小或电荷特异性靶向吞噬细胞，这使得所述制剂通过吞噬作用被主 要地或排他地吸收。一旦所述制剂被吞噬细胞吸收，被包封的治疗剂就得 以释放并且所述治疗剂能够抑制吞噬细胞的活性和/或破坏所述吞噬细胞。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种通过向需要其的个体施用有效 量的含有被包埋的治疗剂的制剂从而治疗急性冠状动脉综合征的方法。将 所述治疗剂包埋于合适的特定大小的载体中。所述制剂根据其特性，如， 例如，大小和/或电荷特异性靶向吞噬细胞，这使得所述制剂通过吞噬作用 被主要地或排他地吸收。一旦在吞噬细胞中，被包埋的治疗剂就得以释放 并且所述治疗剂能够抑制吞噬细胞的活性和/或破坏所述吞噬细胞。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种通过向需要其的个体施用有效 量的含有颗粒治疗剂的制剂从而治疗急性冠状动脉综合征的方法。将治疗 剂制作为具体大小的颗粒。所述制剂根据颗粒特性，诸如，例如，大小和 /或电荷特异性靶向吞噬细胞，这使得所述制剂通过吞噬作用被主要地或排 他地吸收。一旦在吞噬细胞中，颗粒治疗剂能够抑制吞噬细胞的活性和/ 或破坏所述吞噬细胞。
本发明还涉及一种通过向需要其的个体施用有效量的制剂而稳定与 急性冠状动脉综合征相关联的斑的方法，所述制剂含有包封的、包埋的或 颗粒性的试剂。
在另一个实施方案中，本发明包括一种用于向目前正在患或近来已经 患急性冠状动脉综合征，诸如不稳定的心绞痛和急性心肌梗塞的受试者施 用的药物组合物，其包括选自由被包封的治疗剂、包埋的治疗剂和颗粒性 治疗剂组成的组中的制剂和药用赋形剂、载体、稳定剂或稀释剂，以治疗 急性冠状动脉综合征。
本发明的制剂的大小范围优选是0.03-1.0微米。不过，取决于使用的 试剂和/或载体的类型，更加优选的范围包括，但不限于，0.07-0.5微米， 0.1-0.3微米和0.1-0.18微米。
4.附图简述
图1举例说明了在兔的短暂冠状动脉阻塞之后脂质体阿仑膦酸盐 (alendronate)治疗对于梗塞面积大小的影响。梗塞区的大小计算为梗塞 区的面积占由被阻塞的动脉供给的左心室面积的％，因而处于继续梗塞的 危险中。数据表示为平均值±SD，其中n＝4/组，p＜0.05的p值。
图2A-2B举例说明了在兔的可逆冠状动脉阻塞后脂质体阿仑膦酸盐 治疗对于心肌形态学的影响。对照兔(A)具有变形的心肌形态学而用脂质 体阿仑膦酸盐治疗的兔(B)具有更加正常的心肌形态学。
图3A-3B举例说明了在兔的可逆冠状动脉阻塞后继脂质体阿仑膦酸 盐治疗之后巨噬细胞浸润的减少。与用脂质体阿仑膦酸盐处理的兔(B)相 比，对照兔(A)显示了在梗塞区增加的RAM 11+巨噬细胞积累。
5.发明详述
吞噬细胞，特别是巨噬细胞和单核细胞，涉及一些冠状动脉综合征的 病因和/或病理学。巨噬细胞/单核细胞通过分泌各种物质来降解斑的纤维 状帽，所述物质不仅减少帽的厚度，还将另外的巨噬细胞/单核细胞募集到 所述区域中。纤维状帽的降解导致与斑的脂质核的血液接触并启动凝固级 联，其在血栓中达到顶点。血栓可以部分阻塞内腔导致不稳定型心绞痛或 其可以完全阻塞内腔，因此导致急性心肌梗塞。一旦急性心肌梗塞发生， 巨噬细胞/单核细胞被募集到受损的心肌组织并分泌细胞因子和其它促进 心肌损伤的介质，因此导致组织伤害超过了由单独的局部缺血所引起的并 增加扩展梗塞区的心肌坏死。尽管吞噬细胞的完全和慢性的无能和/或脱离 (ablation)不是需要的，在吞噬细胞的活性和/或存在中的这种减少在急 性冠状动脉综合征的过程的短期中或其后是需要的以稳定患者和/或减少 冠状动脉综合征的损伤。
本发明涉及方法和组合物，所述方法和组合物被设计，从而在急性冠 状动脉综合征的过程的急性，短期时期内或其后减少或抑制吞噬细胞(包 括，但不限于，巨噬细胞和单核细胞)的活性和/或消除或减少其的量以治 疗或处理急性冠状动脉综合征(包括，但不限于，不稳定型心绞痛和急性心 肌梗塞)。本发明的方法包括在患者中施用有效量的包含一种或多种治疗剂 的制剂，其特异性减少或抑制吞噬细胞的活性和/或消除或减少吞噬细胞的 量(包括，但不限于，巨噬细胞和单核细胞)。将施用包含一种或多种治疗 剂的制剂认为是急性，短期的治疗，其目标是稳定患者和/或使急性冠状动 脉综合征的直接和长期损伤最小化。在一个实施方案中，将包含一种或多 种治疗剂的制剂施用给遭受不稳定型心绞痛的患者以稳定脆弱的或不稳 定的斑并减少急性心肌梗塞的直接威胁。在另一个实施方案中，将一种或 多种治疗剂施用给患者以使梗塞大小和心肌坏死最小化，所述患者目前正 在遭受或最近已经遭受急性心肌梗塞。
用在本发明方法中的制剂在患者中特异地减少或抑制吞噬细胞的活 性和/或消除或减少吞噬细胞的量。所述制剂的特异性是由于组合物仅影响 具体细胞类型(例如，巨噬细胞和/或单核细胞)的能力。在优选的实施方案 中，制剂对于吞噬细胞的特异性是由于制剂的物理化学特性，例如大小或 电荷从而使其可仅仅或主要地通过吞噬作用被内化。一旦被吞噬和在细胞 内，所述治疗剂抑制或减少吞噬细胞的活性和/或破坏吞噬细胞。尽管不倾 向于被任何具体的作用机制所束缚，在使吞噬细胞失去功能和/或破坏其之 前，使制剂的治疗剂在进入细胞内后被释放。
本发明的制剂，例如被包封的治疗剂，被包埋的治疗剂或颗粒性治疗 剂通过瞬时使细胞减少和/或失活来抑制炎症反应，所述细胞是炎症反应中 重要的引发剂，即巨噬细胞和/或单核细胞。被包封的试剂，被包埋的试剂 和/或颗粒性试剂通过吞噬作用的方式，被巨噬细胞和单核细胞所吸收。与 此相对，由于制剂的大尺寸和/或其它物理化学性质，非吞噬性细胞不能吸 收所述制剂。
用于本文时，术语“吞噬作用”指进入吞噬细胞的优选方式并且是本 领域所众所周知的。然而，应该理解该术语还包括内吞作用的其它形式， 它们也可以实现相同的效果。具体而言，要理解的是本发明的方法和组合 物还包括胞饮作用、受体介导的内吞作用和其它从细胞外部吸收/内化物质 的细胞方式。
本发明还提供药物组合物以施用给受试者，所述药物组合物包括一种 或多种本发明的治疗剂，所述受试者目前正在遭受或最近已经遭受急性冠 状动脉综合征诸如不稳定型心绞痛和急性心肌梗塞。
5.1治疗剂
由于制剂的物理化学特性，诸如大小或电荷，用在本发明的制剂和方 法中的治疗剂特异性减少或抑制吞噬细胞的活性和/或消除或减少患者中 吞噬细胞的量。所述治疗剂可以是细胞内抑制剂，去活化剂，毒素，捕获 物质(arresting substance)和/或抑制细胞生长的物质/细胞毒性物质，其一旦 在吞噬细胞诸如巨噬细胞或单核细胞中，就抑制、破坏、捕获、修改和/ 或改变吞噬细胞从而使其不能再正常发挥功能和/或存活。
用于本文时，术语“治疗剂”指这样的分子，其组成制剂或形成制剂 的部分并提供钝化/毒性效能给所述制剂，例如抑制或减少吞噬细胞活性和 /或消除或减少吞噬细胞的量。可以作为治疗剂的化合物包括，但不限于， 无机或有机化合物；或小分子(少于500 daltons)或大分子，其包括，但不 限于，无机或有机化合物；蛋白质分子，其包括，但不限于，肽、多肽、 蛋白质、在翻译后被修饰的蛋白质、抗体等；或核酸分子，其包括，但不 限于，双链DNA、单链DNA、双链RNA、单链RNA或三股螺旋核酸分 子。化合物可以是衍生自任何已知生物(包括，但不限于，动物、植物、细 菌、真菌、原生生物或病毒)或衍生自合成分子库的天然产物。治疗剂可以 是单体以及聚合的化合物。
在优选的实施方案中，其中优选的治疗剂可以是二膦酸盐 (bisphosphonate)或其类似物。用于本文时，术语“二膦酸盐”指成对(geminal) 和非成对的二膦酸盐。在一个具体实施方案中，二膦酸盐具有如下的式(I)：
其中R1是H、OH或卤素原子；并且R2是卤素；任选地被杂芳基或 杂环基C1-C10烷基氨基或C3-C8环烷基氨基所取代的线性或支链C1-C10烷 基或C2-C10链烯基，其中所述氨基可以是伯、仲或叔；-NHY其中Y是氢， C3-C8环烷基、芳基或杂芳基；或R2是-SZ，其中Z是氯取代的苯基或吡 啶基。
在更具体的实施方案中，二膦酸盐是阿仑膦酸盐或其类似物。在这样 的实施方案中，所述阿仑膦酸盐具有下式(II)：
在其它具体实施方案中，另外的二膦酸盐可以用在本发明的方法中。 其他二膦酸盐的实例包括，但不限于，氯膦酸盐，替鲁膦酸盐，3-(N，N- 二甲基氨基)-1-羟基丙烷-1，1-二膦酸，例如二甲基-APD；1-羟基-亚乙基-1， 1-二膦酸，例如依替膦酸盐；1-羟基-3(甲基戊基氨基)-亚丙基-二膦酸，(伊 班膦酸)；例如伊班膦酸盐；6-氨基-1-羟基己烷-1，1-二膦酸，例如氨基-己 基-BP；3-(N-甲基-N-戊基氨基)-1-羟基丙烷-1，1-二膦酸，例如甲基-戊基 -APD；1-羟基-2-(咪唑-1-基)乙烷-1，1-二膦酸，例如唑来膦酸；1-羟基-2-(3- 吡啶基)乙烷-1，1-二膦酸(利塞膦酸)，例如，利塞膦酸盐；3-[N-(2-苯基硫代 乙基)-N-甲基氨基]-1-羟基丙烷-1，1-二膦酸；1-羟基-3-(吡咯烷-1-基)丙烷 -1，1-二膦酸，1-(N-苯基氨基硫代羰基)甲烷-1，1-二膦酸，例如 FR78844(Fujisawa)；5-苯甲酰-3，4-二氢-2H-吡唑-3，3-二膦酸四乙基酯，例 如U81581(Upjohn)；和1-羟基-2-(咪唑[1，2-a]吡啶-3-基)乙烷-1，1-二膦酸， 例如YM 529，或其类似物。
其它包含治疗剂的制剂包括，但不限于，镓、金、硒、钆、硅石、普 卡霉素、紫杉醇、西罗莫司、依维莫司及它的其它相似的类似物。通常， 还可以将化疗剂，诸如，例如5-氟尿嘧啶、顺铂、烷化剂和其他抗增生或 抗炎化合物，诸如，例如类固醇、阿斯匹林和非类固醇抗炎药物用在制剂 中。
本发明意欲包括施用一种或多种制剂以处理或治疗急性冠状动脉综 合征。可以将超过一种制剂组合施用于患者。术语“组合”不限于完全同 时施用制剂，还意为将制剂依次并在时间间隔内施用给患者从而使它们可 以一起作用以提供比它们以其它方式被施用时增加的益处。例如，每种制 剂可以同时或在不同时间点以任何顺序顺序地进行施用；但是，如果没有 同时进行施用，它们应该在时间上充分接近地进行施用从而提供理想的治 疗效果。可以以任何合适的形式和通过任何合适的路径，将每种制剂分开 施用，所述合适的路径有效地将治疗剂转运到合适或所需的作用位点。施 用的优选模式包括静脉内(IV)和动脉内(IA)。其它合适的施用模式包括肌 内(IM)，皮下(SC)，和腹膜内(IP)以及口服(PO)。这些施用可以是丸剂注射 或输注。另外的施用模式可以是血管周围的传递。可以将所述制剂直接或 在稀释后进行施用。按照本发明，还可以使用任何上述施用路径的组合。
在各种实施方案中，以少于1小时间隔，约1小时间隔，约1小时到 约2小时间隔，约2小到约3小时间隔，约3小时到约4小时间隔，约4 小时到约5小时间隔，约5小时到约6小时间隔，约6小时到约7小时间 隔，约7小时到约8小时间隔，约8小时到约9小时间隔，约9小时到约 10小时间隔，约10小时到约11小时间隔，约11小时到约12小时间隔， 不超过24小时的间隔或不超过48小时的间隔来施用所述制剂。在一个实 施方案中，将两个或更多制剂并存施用或在相同的患者访问中施用。
5.1.1治疗剂的鉴定
本发明提供筛选化合物的方法，所述化合物可以被用作治疗剂。尽管 不倾向于被具体的作用机制所束缚，通过制剂本身的物理化学性质，化合 物一旦靶向到吞噬细胞，就i)抑制吞噬细胞的活性，ii)减少吞噬细胞的活 性，iii)从循环和/或被急性冠状动脉综合征所影响的区域中消除吞噬细胞， 和/或iv)减少吞噬细胞在循环和/或被急性冠状动脉综合征所影响的区域中 的量，所述化合物是用在本发明的方法中的治疗剂。
筛选治疗剂的方法通常包括在体外或体内与吞噬细胞一起温育候选 化合物，接着分析吞噬细胞的活性或寿命的改变(例如，减少)由此鉴定作 为用在本发明中的治疗剂的化合物。可以用本领域任何已知的方法测定吞 噬细胞的活性或寿命。在一个实施方案中，通过细胞响应于激活刺激物的 活化作用的水平来测定吞噬细胞的活性。例如，巨噬细胞/单核细胞活化作 用可以通过量化趋化因子的水平来进行，所述趋化因子诸如巨噬细胞趋化 蛋白-1(MCP-1)和巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)和其它由巨噬细胞 产生的物质诸如白细胞介素1β(IL-1β)和组织坏死因子a(TNF-α)。在另 一个实施方案中，测定吞噬细胞的寿命。例如，可以通过测量3H胸苷结 合，通过直接细胞计数，通过检测已知基因诸如原癌基因(例如，fos，myc) 或细胞周期标记的转录活性的变化；或通过锥虫蓝染色来测定细胞增殖。 可以将本领域已知的任何方法用于测定mRNA转录物的水平(例如，通过 RNA印迹，RT-PCR，Q-PCR等)或蛋白质水平(例如，ELISA，蛋白质印迹 法等)。
在一个实施方案中，通过如下来鉴定减少吞噬细胞活性的化合物：
a)使吞噬细胞与第一化合物和第二化合物接触，所述第一化合物是激 活所述吞噬细胞的化合物并且所述第二化合物是候选化合物；和
b)在所述被接触的吞噬细胞中确定活化作用的水平，其中与在缺乏所 述第二(即，对照细胞)时与所述第一化合物接触的吞噬细胞中的活化作用 水平相比，在所述被接触的细胞中活化作用的减少说明所述第二化合物减 少了吞噬细胞的活性。
在另一个实施方案中，通过如下来鉴定减少吞噬细胞的量的化合物：
a)使吞噬细胞与化合物接触；和
b)确定所述被接触的吞噬细胞的生活力，其中与没有与所述化合物接 触的吞噬细胞(即，对照细胞)的生活力相比，在所述被接触细胞中生活力 的减少说明所述化合物减少吞噬细胞的量。
在其它的实施方案中，与以治疗上所需途径改变吞噬细胞活性或寿命 的已知化合物相比基本相似或更好的方式，候选化合物被测定改变吞噬细 胞活性或寿命的能力。用于本文时，“基本相似”指对吞噬细胞具有与示 范性试剂相似的作用的试剂，所述示范性试剂即抑制吞噬细胞的活性、功 能、运动性和/或减少其的试剂，
另外，可以将候选化合物用在急性冠状动脉综合征的动物模型中以评 价它们用在本发明的方法中的能力。在一个实施方案中，可以使用兔AMI 模型(见，例如部分6.1)。
5.2治疗剂的制剂
可以制备包含一种或多种治疗剂的制剂从而使制剂的大小足够大以 仅仅或主要地被吞噬作用所内化，因此赋予对吞噬细胞的特异性。尽管如 果所述制剂成为细胞内的，非吞噬细胞可能被这样的制剂所影响，不存在 非吞噬细胞内化以这种方式制备的制剂的机制。将外源特异性赋予一种或 多种治疗剂的制剂优选地在0.03-1.0微米，更优选地0.07-0.5微米，更优 选地0.1-0.3微米，和更优选地0.1-0.18微米的大小范围内。
可以将本领域已知的任何方法用于将治疗剂结合到制剂中从而使其 可以通过吞噬作用仅仅或主要地被内化。治疗剂的制剂可以多价鳌合 (sequester)治疗剂以足够的时间从而增加所述试剂向靶位点的传递。而 且，当它们在靶位点的靶细胞(例如，吞噬细胞)中时，治疗剂的制剂可以 将治疗剂从颗粒中放出。
在一个实施方案中，治疗剂被包封在具有所需性质的载体(即，包封 剂(encapsulating agent))中。在具体的实施方案中，所述包封剂是脂质体。 可以通过本领域已知的任何方法来制备所述脂质体(见，例如J. 等.，1994，J.DrugTarget，2：299-308；J.等.，1993，Calcif.Tissue Int.，53：139-145；Lasic DD.，Liposomes Technology Inc.，Elsevier，1993， 63-105.(chapter 3)；Winterhalter M，Lasic DD，Chem Phys Lipids，1993 Sep； 64(1-3)：35-43)。所述脂质体可以带正电荷，中性或更优选地带负电荷。所 述脂质体可以是单一脂层的或可以是多层的。按照本发明的合适的脂质体 优选地是非毒性脂质体诸如，例如，从磷脂酰-胆碱磷酸甘油，和胆固醇中 制备的那些。所用的脂质体的直径优选地在0.03-1.0μm范围内。然而， 还可以使用适合于吞噬细胞的吞噬作用的其它大小范围。
在另一个实施方案中，将治疗剂包埋在具有所需性质的载体(即，包 埋剂)中。被包埋的治疗剂包括被包埋、封入和/或吸收于载体内的那些治 疗剂，被分散在载体基质中的治疗剂，被吸收或连接在载体表面上的治疗 剂，或这些形式的任何的组合。在具体的实施方案中，包埋剂(或载体)是 微粒，纳米颗粒(nanoparticle)，纳米球体(nanosphere)，微球体，微胶 囊或纳米胶囊(nanocapsule)(见例如，M.Donbrow in：Microencapsulationand Nanoparticles in Medicine and Pharmacy，CRC Press，Boca Raton，FL， 347，1991)。术语载体包括聚合的和非聚合的制剂。在具体的实施方案中， 包埋剂是纳米颗粒。优选地，纳米颗粒的直径是0.03-1.0微米并且可以是 球形的，非球形的或聚合的颗粒。可以将治疗剂包埋在纳米颗粒中，均匀 分散或不均匀分散在聚合物基质中，吸附在表面上，或在这些形式的任何 的组合中。在一个优选的实施方案中，用于制作纳米颗粒的聚合物是生物 相容的和可生物降解的，诸如聚(DL-丙交酯-co-乙交酯)聚合物(PLGA)。然 而，可以用于制作纳米颗粒的另外的聚合物包括，但不限于，PLA(聚乳 酸)，和它们的共聚物，聚酐，聚烷基-氰基丙烯酸酯(诸如聚异丁基氰基丙 烯酸酯)，聚乙二醇，聚环氧乙烷和它们的衍生物，脱乙酰壳多糖，白蛋白， 白明胶等。
在另一个实施方案中，治疗剂以颗粒形式存在，所述颗粒每个都具有 所需的性质。颗粒治疗剂形式包括任何不溶解的悬浮的或分散颗粒形式的 治疗剂，其没有被包封、捕获或吸附在载体中。以颗粒形式存在的治疗剂 包括那些治疗剂，所述治疗剂是试剂的悬浮或分散的胶体，聚集体，絮凝 物，不溶解的盐，不溶解的复合体，和聚合物链。这些颗粒在它们被贮存 /施用的液体(例如，盐水或水)以及在它们提供它们的治疗效果的液体(例 如，血液或血清)中是不溶解的。典型地，“不可溶解”指在超过10000份 的溶剂中1份颗粒治疗剂的溶解度。可以使用本领域中任何已知方法来制 备颗粒或聚集体。优选地，颗粒的直径是0.03-1.0微米并且可以是任何具 体性状。
5.2.1颗粒大小的确定
优选地制备包含治疗剂的制剂从而使制剂的大小足够大以仅仅或主 要地通过吞噬作用被内化，即优选地大于0.03微米。在优选的实施方案中， 这些制剂是0.03-1.0微米，更优选地0.07-0.5微米，更优选地0.1-0.3微米， 并且最优选地0.1-0.18微米。可以使用任何本领域已知的方法来在向需要 其的患者施用前确定所述制剂的大小。例如可以使用利用激光光散射的 Nicomp Submicron Particle Sizer(model 370，Nicomp，Santa Barbara，CA)。
5.3所述制剂的施用
认为有效量的制剂是短期，急性的治疗并且不意味着延续很长的施 用。治疗的时间周期优选地是这样的从而使其在少于1个月，优选地少于 两周，最优选地多至1周的时期内产生吞噬细胞的抑制/减少。从经验而言， 这可以通过将所述化合物施用给需要其的个体(或这样的个体的动物模型) 和在不同的时间点检测抑制/减少的水平来确定。还可以将抑制的时间与合 适的所需临床效果，例如斑破裂的急性风险的减少相关联。
5.4治疗效用的特征
术语“有效量”指具体制剂的量，其在成功获得所需治疗效果中是有 效的，即被抑制或减少的吞噬细胞活性和/或消除或减少吞噬细胞的量。在 一个实施方案中，抑制或减少吞噬细胞活性和/或消除或减少吞噬细胞的量 的所需治疗结果稳定了患者中脆弱或不稳定的斑，所述患者患有不稳定型 心绞痛。在另一个实施方案中，抑制或减少吞噬细胞活性和/或消除或减少 吞噬细胞的量的所需治疗结果使患者中的梗塞大小和/或心肌坏死的量最 小化，所述患者已经患有急性心肌梗塞。
可以通过在细胞培养物或实验动物中的标准药物方法，例如，确定 LD50(致死群体的50％的剂量)，不可观察到的不利效果水平(NOAEL)和 ED50(在50％的群体中治疗有效的剂量)，来确定本发明的治疗方法的毒性 和功效。治疗指数是毒性和治疗效果之间的剂量比率，并且可以将其表示 为比率LD50/ED50或NOAEL/ED50。优选显示大治疗指数的制剂。尽管可 以使用显示毒性副作用的制剂，应该小心设计传递系统从而使对未被疾病 侵袭的细胞的潜在损害最小化，并由此减少副作用，所述传递系统将这些 制剂的试剂靶向到被疾病侵袭的组织的位点。
获自细胞培养测定和动物研究的数据可以用于确定用在人中的制剂 的剂量的范围。这些制剂的剂量优选地存在于循环浓度范围内，所述浓度 包括具有极少或没有毒性的ED50。取决于所用的剂型和所用的施用路径， 所述剂量可以在该范围内变化。对于任何用在本发明的方法中的制剂，最 初可以从细胞培养测定中估计有效剂量。如在细胞培养物中所确定，可以 将剂量配制在动物模型中从而成功获得循环血浆浓度范围，所述浓度包括 IC50(即，成功获得对症状的半-最大抑制的测试化合物的浓度)。可以将这 些信息用于在人中更精确地确定有效的剂量。可以，例如通过高效液相色 谱来测量血浆中的水平。
优选地，在用于人之前，在体外，接着在体内测试本发明的方案和组 合物的所需治疗活性。这样在体外测定的一个实例是对吞噬细胞的体外细 胞培养测定，所述吞噬细胞被培养于培养物中，与之接触或施用于细胞， 观察该测定对于细胞的影响，例如抑制或减少活性和/或彻底或部分地细胞 死亡。吞噬细胞可以从已建立的细胞系中获得或最近作为初级细胞系从个 体中进行分离。可以将本领域的许多测定标准用于测量制剂在吞噬细胞上 的活性；例如，巨噬细胞/单核细胞活化作用可以通过量化趋化因子的水平 来进行测定，所述趋化因子诸如巨噬细胞趋化蛋白-1(MCP-1)，白细胞介 素1β(IL-1β)，组织坏死因子α(TNF-α)和巨噬细胞炎性蛋白-1α (MIP-1α)。可以将本领域的许多测定标准用于评价吞噬细胞的存活和/ 或生长；例如，可以通过测量3H胸苷结合，通过直接细胞计数，通过检 测已知基因诸如原癌基因(例如，fos，myc)或细胞周期标记的转录活性的变 化测定细胞的增殖；可以通过锥虫蓝染色来测定细胞的生活力。
基于对本领域普通技术人员已知的一些因素的考虑，本领域技术人员 可以确定优选的有效剂量的选择(例如，通过临床试验)。这些因素包括待 处理或治疗的急性冠状动脉综合征，涉及的症状，患者的体重，患者的免 疫状态和其它技术人员已知的因素，其反应施用药物组合物的精确性。
5.5药物组合物和施用路径
取决于特异于每个患者的各种因素(例如，患者的病症的严重性和类 型、年龄、体重、应答和过去的医疗史)，制剂中治疗剂的数量和类型，制 剂的类型(例如，被包封的，被包埋的，颗粒等)，组合物的形式(例如，以 液体、半液体或固体形式存在)和/或施用的路径(例如，口服，静脉内，肌 内，动脉内，髓内，鞘内，心室内，透皮，皮下，腹膜内，鼻内，肠，局 部，舌下，阴道或直肠的方式)，用在本发明的方法中包括一种或多种治疗 剂的制剂可以以许多形式存在。可以将药物媒介物(carrier)，载体 (vehicle)，赋形剂或稀释剂包括在本发明的组合物中，包括，但不限于， 水、盐溶液、缓冲盐溶液、油(例如石油，动物、植物或合成油)、淀粉、 葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、 甘油一硬脂酸、滑石、氯化钠、干燥的脱脂乳、甘油、丙烯、乙二醇、乙 醇、右旋糖等。如果需要，所述组合物还可包含小量湿润剂或乳化剂，或 pH缓冲剂。这些组合物可以采取溶液、混悬液、乳剂、片剂、丸剂、胶 囊、粉末、缓释制剂等的形式。
可以将适合于肠胃外施用的药物制剂配制在水溶液中，优选地在生理 相容性缓冲液诸如Hanks’溶液，Ringer’s溶液或生理缓冲盐水中。水性注 射混悬液可以包含这样的物质，其增加混悬液的粘度，诸如羧甲基纤维素 钠，山梨糖醇或右旋糖酐。此外，可以将活性化合物的混悬液制备为适合 的油性注射混悬液。合适的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油诸如芝麻油，或 合成脂肪酸酯，诸如油酸乙酯或甘油三酯或脂质体。任选地，所述混悬液 还可以包含合适的稳定剂或增加化合物的溶解度的试剂从而允许制备高 度浓缩的溶液。
所述药物组合物可以作为盐进行提供并可以与许多酸一起形成，包 括，但不限于，盐酸、硫酸、乙酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、琥珀酸等。 与对应的游离碱形式相比，盐倾向于在水性溶剂或其它质子溶剂中更易溶 解。
可以将药物组合物全身性或局部地，例如靠近急性冠状动脉综合征的 病理学位点进行施用。另外，全身施用意味着包括可以靶向具体区域或目 标组织类型的施用。
优选地，在实际斑破裂的第一个症状发作时，立即施用药物组合物； 诸如，例如，胸痛，放射到肩膀、臂、牙齿、颚、腹部或背部的疼痛或呼 吸短促或咳嗽，头昏眼花，晕厥，恶心，呕吐，出汗或与斑破裂相关的焦 虑。其它的症状将对于本领域技术人员和医生是显而易见的并且可以是施 用瞬时药物组合物的信号。或者和/或另外地，药物组合物可以在症状发作 后立即，例如在症状发作的数分钟内进行施用。或者和/或另外地，所述组 合物可以在症状发作后的1小时内，或约2小时内，或约3小时内或约4 小时内，或约5小时内或约6小时内，多至1-3天内进行施用。
在另一个方案中，将药物组合物施用给患者，所述患者具有斑破裂的 增加的风险。例如，在增加斑破裂的风险的程序，诸如，例如血管成形术 程序之前，可以将本发明的组合物施用给患者。在这样的程序前多至3天 施用所述组合物可以是优选的。还优选在所述程序前1-6小时施用，或在 所述程序的1小时内施用或在所述程序前少于1小时或甚至在所述程序的 数分钟内施用。取决于特异于个体患者的各种生理因素，诸如，例如，体 重、医疗史和遗传诱因，以及影响斑破裂的预期风险诸如待执行的程序的 复杂性的各种因素，技术人员可以容易地确定合适的施用计时。
将所有的公开的文章、书籍、参考手册和本文引用的摘要的内容全文 并入作为参考以更充分地描述本发明涉及的领域的状态。
因为可以在不背离本发明的范围和精神的前提下，对上述主题作出各 种变化，倾向于将所有的被包含在上述描述中，或被后附的权利要求所限 定的主题认为是对本发明的描述和举例说明。根据上述教导，本发明的修 改和变化是可能的。
6.实施例
本文提出的随后的实施例意欲举例说明并示范进行本发明的各个方 面并且不倾向于以任何方式限制本发明。
6.1脂质体阿仑膦酸盐对梗塞区大小的影响
在兔AMI模型中，研究用被包封的二膦酸盐进行的处理对梗塞区的 影响。使用如下概述来制作直径约为0.150μm的脂质体阿仑膦酸盐：
a.将脂质，DSPC，DSPG，和胆固醇溶解在1/1乙醇/叔-丁醇中。
b.将溶剂稀释到包含阿仑膦酸盐的缓冲液中以产生大的多层小泡 (MLVs)。
c.将MLVs挤压通过200nm的聚碳酸酯滤器以产生大的单层150±20nm 的小泡(LUVs)。
d.超滤LUVs以去除未被包封的阿仑膦酸盐。
e.无菌过滤
将8只新西兰白色雄兔，2.5-3.5kg B.W.用正常饮食和水随意(ad libitum)饲养。在冠状动脉梗塞的同时，以单一输注对所述兔随机施用盐水 (对照)或脂质体阿仑膦酸盐(3mg/kg，i.v.)。用氯胺酮/赛拉嗪(35mg/kg； 5mg/kg)和异氟烷对所述兔进行麻醉。用通过插管和以在平衡氧中的异氟 烷机械通风所给出的呼吸支持，和持续的超声波心动描记法(ECG)和动脉 血压(在耳动脉中的导管)检测来进行该实验。通过左侧第4肋间间隔进行 胸廓切开术，随后进行心包切开术并产生心包支架。确定左侧主要的冠状 动脉并且大的分枝被5-0丝缝线和套结(snare)所围绕。其后，将套结拉紧 30分钟。通过ECG变化(ST-T区段上升)，区段着色的变化和运动机能减 退来证实局部缺血。30分钟后，松开套结并证实血流的恢复。将缝线留在 适当的位置(in place)，松开并闭合胸腔的每层。将盐酸丁丙诺啡施用给兔 进行镇痛(analgesia)再2-3天。在用Penthotal进行安死术后，兔在7天 后被处死，并收集心脏。用盐水通过升主动脉对冠状动脉进行灌注，随后 在以前梗塞的冠状动脉上拉紧缝线并用0.5％的Evans蓝溶液(Sigma)对冠 状动脉进行灌注以对再-内皮化(re-endothelialization)(血液的存在)的区域 进行染色。认为未被Evans蓝染色的左侧心室区域是有风险的区域。接着 将心脏在-20℃冷冻24小时并将其切成2mm间隔的横切面。将心脏的薄 切片在活性染料tritetrazolium chloride(TTC，1％，Sigma)中温育30分钟， 在10％自然缓冲的福尔马林中进行固定从而对在组织处理前活着的细胞 进行染色。将没有被TTC染色(白色)的左侧心室区域定义为梗塞区域。接 着对被染色的切片进行拍照并通过数字面积法(Photoshop)进行处理。
用脂质体阿仑膦酸盐处理的兔具有梗塞区域，所述梗塞区域是29.5± 6％的有风险的区域。这与对照兔(未用脂质体阿仑膦酸盐处理)相反，所述 对照兔显示梗塞区域，所述梗塞区域是42±5.5％的有风险的区域(图1)。 因此，脂质体阿仑膦酸盐在减少梗塞区域中是有效的。在处理的组中没有 观察到不利效果。
6.2脂质体阿仑膦酸盐对心肌形态学的影响
如通过Hemotoxylin和曙红染色所显示，在部分6.1中被处理的兔显 示了心肌形态学的变化。对照的兔具有变形的心肌形态学(图2A)，而用脂 质体阿仑膦酸盐处理的兔显示了更正常的形态(图2B)。
6.3脂质体阿仑膦酸盐对巨噬细胞浸润的影响
如部分6.1中处理的兔显示了在用脂质体阿仑膦酸盐处理的兔中的巨 噬细胞浸润的减少。对兔心脏的代表性切片进行了RAM11+巨噬细胞的免 疫染色。来自用脂质体阿仑膦酸盐处理的兔的切片(图3B)显示了更少的染 色并因此具有比来自对照兔的切片(图3A)更少的RAM11+巨噬细胞的积 累。
脂质体阿仑膦酸盐还显示系统地减少了循环的单核细胞的数量。兔被 施用了盐水(对照)或脂质体阿仑膦酸盐(3mg/kg，i.v.)。使用CD-14的FACS 分析来确定循环血液中的单核细胞水平。在用脂质体阿仑膦酸盐注射后48 小时，与对照组相比，血液单核细胞群体减少了75-95％。