本发明涉及含有外源DNA的脂质体在制备用于通过睾丸注射向动 物中导入外源DNA的制剂中的应用。本发明还涉及通过睾丸注射向动 物中导入外源DNA的方法，
转基因动物的制备方法，对于制备转基因家畜和建立人类疾病动 物模型等研究是至关重要的。如在分析人类疾病基因表达的组织及阶段 的特异性、分析基因的生理功能、药物有效性测试等方面。本发明是一 种简便有效地制备转基因动物的方法，实质是制备含外源DNA精子的 方法：将外源DNA注射到性成熟的非人类雄性脊椎动物睾丸中，产生 含有上述外源DNA的精子。而且，本方法所制备的含外源DNA的精子 能使非人类脊椎动物尚未受精的卵子受精，用于生产转基因动物。
最常用的制备转基因动物的方法是显微注射法，即用显微注射仪将 外源DNA注射到受精卵子的原核中(Palmiter and Brinster，Annu.Rev. Genet.，20：465-499，1986.)。显微注射在某些实验室是常规实验方法，但 是该方法在制备转基因动物时却遇到了难以克服的困难，如：某些动物 的卵细胞核在显微镜下无法看到，在这种情况下需要离心和其他一些额 外的操作。显微注射外源DNA既费时又需掌握特殊的技术，且需要价 格昂贵的显微操作仪。即使上述操作过程顺利完成，该方法制备转基因 动物的成功率还要受到很大变化因素的影响。
在另一方面，一些不依赖显微注射的制备转基因动物的方法也在尝 试。例如：一种制备转基因动物的方法是将小鼠的精子和外源DNA在 试管中混合，再用上述精子使成熟卵受精。1989年，Lavitrano等人(Cell， 57：717-723，1989)报道，他已成功的运用了这种方法，但直到目前，其 他人还无法成功的重复其试验(Brinster et al.Cell，59，239-241，1989.)。
1991年，Bachiller等人所用的另一种方法是上述Lavitrano等人方 法的一种改进。方法为：将小鼠精子与外源DNA和脂质体组成的复合 体进行体外共培养，以提高单个精子对外源DNA的摄入，然后用精子 使成熟卵子受精，但是，在受精卵子中测不出外源DNA(Mol.Reprod. Develop.，30：194-200，1991.)。也就是说，这种方法在制备转基因动物方 面失败了。但由于其不需要特殊的显微注射操作，虽然还未发展到实践 运用的程度，还是比前面提到的显微注射法显现出更大的优势。
1994年，Sato等人采用了不同的方法，用注射器将磷酸钙沉淀与外 源DNA混合物直接注射到雄性动物的睾丸中(Sato，et al.Animal Biotech.，5：19-31，1994.)用注射有外源DNA的雄鼠与雌鼠交配。实验结 果表明：射出的精子中确实含有外DNA，但是受精后的卵子中未测出外 源DNA(Sato et al Animal Biotech 5：19-31，1994)。
为克服以上诸多方法的不足，在发展所谓的精子介导的基因转移方 面，精子介导的基因转移方法是将外源DNA通过精子这一媒介进行转 移。本发明者在精子介导法的基础上加以改进，提出了该发明专利。本 发明改用外源DNA和脂质体共同温育，形成外源DNA-脂质体复合物， 然后用注射器将外源DNA-脂质体复合物直接注射到雄性动物的睾丸 中。睾丸内包括不同分化阶段的精子，从未分化的精原细胞(它是精子 的未分化前体)经过分化过程中的精母细胞到更加分化的睾丸精子。睾 丸精子不显示活跃的精子运动能力，但通过副睾被转运时显示出这种活 性。通常，与哺乳动物细胞共培养时，被脂质体包裹的DNA将被哺乳 动物细胞摄入。这个过程的结果是精子将发生表型转变(Wigler et al 11：223-232，1997)。用脂质体包裹的外源DNA注射到睾丸，由于外源DNA 的导入将导致睾丸精子表型的转变，这一点是可以予见的。通过交配， 将表型转变的精子(含外源DNA)释放出来并使雌性动物输卵管中的卵 子受精，从而将外源DNA插入受精卵的染色体上。因此，便制备了转 基因受精卵。假如，该方法能成功制备转基因动物，很有可能一次将外 源DNA导入100000个精子中，该方法与显微注射法相比更加简便实际。 而且，利用含有外源DNA精子还有一些优点：可将精子冷冻并且在方 便的时候融化，并用于人工授精和离体授精等其他一些技术。
本发明的目的在于：不依赖传统的显微注射条件，建立一种在短期 内能大规模制备转基因动物的便捷高效的新方法。通过该发明渴望能够 解决高效大量地生产转基因小鼠、大鼠、兔以及大家畜的难题。
本发明将涉及到：将外源DNA与脂质体混合后注射到非人类雄性 性成熟脊椎动物的睾丸，然后在该动物的睾丸中产生含有外源DNA的 精子。为了将外源DNA转导入哺乳动物细胞，将外源DNA与脂质体形 成复合物后再注射到非人类雄性性成熟脊椎动物的睾丸中，并在其中形 成含外源DNA的精子。然后，使上述雄性动物与发情的雌性动物进行 交配，生产转基因动物。
本发明的特点是：为了将外源DNA导入哺乳动物细胞，故将其与脂质 体形成复合物，直接注射到非人类雄性性成熟动物的睾丸中。该睾丸中 将产生含外源DNA的精子。
因而，本发明提供了一种通过睾丸注射向动物中导入外源DNA的 方法，包括：将外源DNA与脂质体共同孵育形成外源DNA-脂质体复合 物；将得到的含有外源DNA的脂质体注射进雄性动物睾丸的实质部； 注射2天后将该雄性动物与雌雄动物交配，是雌性动物受孕，生产出导 入了外源基因的动物。
在本发明的方法中，所述的注射进雄性动物睾丸可分三次进行，第 一次注射左侧睾丸实质部，第二次注射右侧睾丸实质部，第三次双侧实 质部。其中，每次注射之间最好相隔4天，所述的3次注射组成一个周 期，对雄性动物睾丸的注射应进行1和或多个周期。
在本发明书中“外源DNA”指的是“质粒DNA”，被导入外源DNA 的种类依据所要获得的目的转基因动物而变化。混有DNA的脂质体是 为了将DNA导入哺乳动物细胞，其中脂质体为可购得的任何商品化脂 质体(阳离子脂质体)。这些脂质体都含有脂质转染剂DOTMA(N-[1- (2，3-dioleyloxy)propyl]-N，N，N-trimethylammonium chloride(DOMTA) and dioleoyphosphatidylethanolamine(DOPE)，按1∶1比例混合最好。 形成DNA和脂质体复合物可按常规操作。
脂质体外源DNA复合物直接注射到非人类雄性脊椎动物睾丸中，成 熟雄性动物麻醉后将含外源DNA的脂质体溶液从阴囊刺入睾丸内进行 注射，注射过程每4天重复一次，至少3次。最后一次注射脂质体和DNA 复合物后两天，上述雄性动物产生含外源DNA的精子。
用促性腺激素诱导雌性动物发情并与上述雄性动物交配，使雌性动 物怀孕，生产转基因动物。
本发明的方法可能被用于有效生产非人类脊椎动物如：实验小鼠、 大鼠、兔、狗、猫等以及家畜马、猪、山羊和绵羊等。用本发明方法获 得的转基因动物，可以在通常的牲畜管理条件并利用普通饲料来喂养。
以下实验方法用来鉴定获得的受精卵和动物是否含有外源DNA。
一部分雌性动物在交配确定后(确定为怀孕第一天)被屠宰，将子 宫内精子和输卵管内受精卵(单细胞胚胎)取样，上述样品用来分析外 源DNA是否存在。其它雌性哺乳动物任其生长到怀孕中期或生长到分 娩期。对于那些生长到怀孕中期的雌性动物摘取胚胎，提取DNA。外源 DNA在胚胎染色体上整合率可以用Southern Blotting或PCR法进行检 测。对新生个体，以出生第五天的动物尾巴作材料，提取基因组DNA 来确定是否存在外源DNA。
成熟转基因个体(可称为第一代或F0代)与正常动物交配产生后代。 从第2代(F1)个体提取DNA用Southern Blotting或PCR法来确定外 源DNA是否从F0代传到了F3代。
使用本发明，一次可生产100000个或更多个含有外源DNA的精子， 对于难以显微操作的家畜卵子来说这是一种特别有效的技术。此外，由 于含有外源DNA的精子可冻融，能用于人工授精或体外授精，因此， 失为一种简便、高效的制备转基因动物的技术。
附图简要说明：
图1：显示pMT-neo/MT-β-gal质粒图谱，其包括编码小鼠金属硫蛋 白I启动子的DNA序列，编码neomycin(neo)抗性基因，以及编码位 于小鼠金属硫蛋白I启动区重复序列下游的β-半乳糖甘酶基因序列。图 示中的符号解释：H，HindIII限制性内切酶位点；E，EcoRI限制性内切 酶位点；B，BamHI限制性内切酶位点；K，KpnI限制性内切酶位点； Xh，XhoI限制性内切酶位点；Xb，XbaI限制内切酶位点；S，SalI限制性 内切酶位点；P，PstI限制性内切酶位点；BII BglI限制性内切酶位点； Sm，SmaI限制性内切酶位点；ATG，蛋白质翻译起始位点；SapA，SV40 poly(A)增加信号起始位点；N，NotI限制性内切酶位点；CmR氯酶素抗性 基因，Ori，复制起始。
图2，显示直接将外源DNA-脂质体复合物注射到成年雄性小鼠睾丸 的操作流程图。
图3，显示子宫内精子基因组DNA的PCR分析照片，利用MI499 β-gal MI500β-gal作为引物，雄性动物已进行过3次外源DNA-脂质体 复合物注射，符号M指分子量标准。
图4(a，b)，显示经3次注射外源DNA-脂质体复合物的雄鼠使雌鼠 卵子受精后所产生的囊胚显微照片。图4c是13天胎龄的胚胎照片。图4a 箭头所指为不表达β-半乳糖甘酶活性的囊胚。图4(c)中符号＂Tg＂表示 含外源DNA并表现出β-半乳糖甘酶活性的胚胎，而non-Tg表示无任 何β-半乳糖甘酶活性的非转基因胚胎。
图5，显示胚胎基因组DNA的PCR分析照片。(MI499β-半乳糖 甘酶和MI500β-半乳糖甘酶作为引物)，用于受精的雄鼠已注射过3 次外源DNA-脂质体复合物。符号M表示分子量标准。
图6，是13天胎龄的胚胎基因组DNA的PCR分析照片，用于受精 的雄鼠已经过3次外源基因注射，符号M表示分子量标准。
图7，显示第7号雄鼠后代谱系，其睾丸注射过外源DNA。
实施例
以下实例较具体说明本发明的方法。
实施例1
1.1制备质粒pMT-neo/MT-β-gal用于DNA转导。用EcoRI/BglII 将小鼠金属硫蛋白启动子(MT)片段约1.9kb从质粒pMGH(Palmiter et al.， Nature，300：611-615，1982.)切下并分离纯化，将此片段导入质粒pHSG396 的EcoRI/BglII限制酶位点(大约2.3Kb，Takeshita et al.，Gene，71：9- 18，1988)，这就是质粒pMT/1。
1.2用BglII/HindIII限制性内切酶消化质粒pHSG294(Brady et al.，Gene，27：223-232，1984)，分离新霉素抗性基因，(约1.5Kb，‘neo’)， 引入pMT/I的BglII/HindIII位点，从而形成载体pMT/neo-1。该载体包 括neo表达单元(Mt-neo)，neo表达处于MT控制之下。正常情况下， 一个表达单位包括一个启动子和基因(cDNA或基因组DNA)。
1.3大约5kb长的β-gal表达单元(MT-β-gal)是和大肠杆菌来源 的β-gal基因的融合，(约3kb，包括3’末端SV40 polyA增加部分， 此单元来自pMT/β-gal-l(Sato et al.，Mol.Reprod.Develop.，34：349- 356，1993)，然后插入pMT/neo-l(下游MT-neo)的HindIII限制性内切 酶位点，本实验中，一个NotI连接子(Boehringer Mannheim GmbH)置于 MT-β-gal的3’端，获得的质粒被命名为pMT-neo/MT-β-gal(约 10Kb，参见图1)。这一质粒包括β-gal表达单元和neo表达单元，实 验中用于DNA转导的质粒由pMT-neo/MT-β-gal形成。当然，也可用 不同的目的基因取代MT-neo or MT-β-gal。
实施例2
首先将外源DNA-脂质体复合物(pMT-neo/MT-β-gal)注射入雄鼠 睾丸，该睾丸内精子在注入脂质体-外源基因后易发生表形变化，将此雄 鼠与雌鼠交配，精子经交配后射出，从雌鼠子宫内收集精子及囊胚并提 取其基因组DNA，用于外源DNA的检测。
2.1首先，质粒pMT-neo/MT-β-gal DNA经Not I酶切使其线形 化。
2.2大约5ug外源线性DNA按照1∶1比例与Lipofectin TM室 温混匀，(GIBCO-BRL，dissolive in PBS buffer PH7.2)并放置15分钟，此 过程按操作说明进行。在此过程中，外源DNA(pMT-neo/MT-β-gal) 逐渐被脂质体包围，进而形成所谓的脂质体外源DNA复合物。
2.3对照组溶液由脂质体和PBS按1∶1比例混合。
2.4将上述脂质体外源DNA复合物与对照组溶液分别用注射器 (1/6gauge needle)吸入，大约20ul，通过阴囊直接注射入麻醉后的 成年雄鼠睾丸(年龄8-10周，购自CLEA Japan，Inc)。按图2显示流 程将脂质体外源DNA复合物注射入雄鼠睾丸中。
2.5注射脂质体外源DNA复合物2天后，雄鼠与发情ICR雌鼠(用 促性腺激素诱导发情)交配。然后，分别从输卵管及子宫回收受精卵和 子宫内精子。用透明质酸酶从回收的受精卵祛除卵丘细胞，然后在37℃ 培养3天，5％CO2，95％空气，100ulM16培养基(Whittingham，et al.，J. Reprod.Fert.，14(supple)：7-21，1971)含有1uM CdCl2(增强MT活性)，直 至囊胚形成。
2.6用PCR方法分析培养的囊胚中外源DNA的存在。参照 Saiki(Science，239：487-491，1988)的PCR方法。本实验中，使用了2对引 物，第一对含MI499 β-gal(SEQ ID NO.：1)MI500 β-gal(SEQ ID NO.：2)，两组引物都识别β-gal基因的3’端Moleculer Cloning A laboratory Manual，CSH，NY，1982)；第2组含有MI1511 neo(SEQ ID NO.：3) 和MI1512 neo(SEQ ID NO.：4)，两者都识别neo基因的5’末端。 (Gene，19：327-336，1982.)。PCR反应条件如下；1ul(约1ug)基因组DNA 或含囊胚的溶液，加入9ul反应混合物(10nM Tris-Cl，PH8.3，1.5mM MgCl2，50mM KCl，0.01％(w/v)明胶，200uM dATP，dTTP，GTP，dCTP每 种引物50pM，0.1uLTaq酶，反应次数为36个循环。95℃变性1分钟， 58℃退火1分钟，75℃延伸4分钟，反应产物走4％琼脂糖电泳，溴 化乙锭显色，紫外灯检测外源DNA的扩增情况。
2.7β-gal的组化分析按下列方法进行：囊胚在室温下固定于 1.25％戊二醛(PBS)5分钟，用含0.05％牛血清白蛋白(BSA)50ulPBS 洗3次，然后在50ul(含1.2mM 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D- galactopyranoside(X-gal)，1mM MgCl2，0.1％Triton X-100，3mM K4Fe[CN]6.3H2O(p3289，Sigma)，3mM K3Fe[CN]6(p3667；Sigma)37℃，反应24 小时。此处理是使细胞质染成兰色，表现出β-gal活性。无β-gal活 性的细胞质则无颜色反应。
2.8回收的子宫内精子按Sato(Animal Biotech，5：19-31，1994)方 法，分离基因组DNA。用离心法分离的子宫内精子被置于700ul溶解液 中(150ug/ml蛋白酶K，0.5mg/ml链霉蛋白酶E，100mM NaCL，0.4％ SDS，10mM Tris，10mM EDTA，pH8.0)，37℃溶解24-28小时。然后将100ul 酚加入裂解液中，抽取上清，加80ug/ml Rnase A于上清，37℃30分 钟以去除混合物中的RNA，再加入700ul异丙醇处理上清，产生DNA沉 淀，70％乙醇洗涤沉淀，将沉淀溶解于70ul TE液中(10mMTris，1Mm EDTA，PH7.0)。子宫内精子DNA用于PCR分析，用两套不同引物检测 外源DNA的存在。
2.9将已制备好的外源DNA(pMT-neo/MT-β-gal)脂质体复合 物、对照液分别注射于雄性动物睾丸，此雄性小鼠于注射次日与发情雌 鼠交配，以获得受精卵。由受精卵发育的囊胚用于外源DNA表达的检 测。在第一次注射后的第四天，对雄鼠进行第二次睾丸注射，两天后其 与发情雌鼠交配，同上法进行外源DNA检测。分离受精卵基因组DNA， 对其进行外源DNA检测，其方法与第一次注射时一样。进而，第二次 注射后第四天另一次注射外源DNA，即第三次注射；交配后回收受精卵 及囊胚，用于外源DNA的表达分析。一般而言，第一次的注射方向为 “A”见图2，用注射针从阴囊的表面刺入4mm深(在溶液注出前)， 第二次注射方向为“B”如图2，刺入深度为4mm；第三次注射方向为 “C”如图2所示，刺入深度3mm。在第三次注射的次日，雄鼠与发 情雌鼠交配，用PCR法对外源DNA的存在进行检测；用组化方法检 测β-gal的表达。检测结果见表一。图3显示连续三次注射后，交配 获得的子宫内精子外源DNA的存在情况。图3中，第一泳道显示第三 次注射脂质体-外源DNA复合物第四天睾丸基因组DNA的PCR分析的 结果，可见264bp的DNA条带。第二泳道显示，正常小鼠基因组DNA 的PCR分析结果，没有相应于外源DNA片段264bp大小的条带。第三 泳道为10pg外源DNA的PCR结果，可见264bp的DNA条带。第四， 第五泳道显示获得第三次注射脂质体-外源DNA复合物雄鼠次日释放到 子宫内精子基因组DNA的PCR的分析结果，可见264bp的DNA条带， 第四，第五泳道样品来自不同雄鼠。
2.10图4a，4b.显示β-gal的组织化学分析结果，其囊胚是已注射 三次脂质体外源DNA复合物后雄鼠使雌鼠受精获得的囊胚，图4a中的 囊胚是外源DNA表达阳性的囊胚，这些囊胚在X-gal中反应，其结果是 大多数有色反应。箭头指的是无色囊胚。图4b显示注射对照液的阴性 对照组获得的囊胚，在X-gal反应中均未染色.图4c显示的是13天胎龄 的胚胎照片，即雄性经第三次注射DNA脂质体复合物后第二次自然交 配获得的胚胎。胚胎在X-gal中反应后，两个被染色，(符号“Tg”指示 是转基因的)。
2.11图5是囊胚基因组DNA的PCR分析结果的照片(利用MI499 β-gal和MI500β-gal作为引物)。这些囊胚是雄性动物获得三次注射脂 质体-外源DNA复合物后，与雌性交配后获得的动物。第一，二泳道分 别显示10个，5个实验组囊胚的PCR分析结果，可见在264bp处有一 DNA条带。第三泳道显示阴性对照组小鼠10个囊胚PCR的分析结果。 因此，未观察到264bp的DNA条带。
2.12实验结果总结如下：
1).雄鼠获得睾丸内注射脂质体外源DNA复合物后，与雌鼠交配 后获得的子宫内精子DNA中发现有外源DNA的存在。
2).雄鼠获得睾丸内注射脂质体外源DNA复合物后，与雌鼠自然交 配获得受精卵，其发育成的囊胚中检测到外源DNA的存在。说明外源 DNA进入睾丸通过交配由精子到达受精卵。
3).经组织免疫化学法分析，实验组获得的囊胚具有β-gal活性， 显示外源DNA已得到表达。特别是随着注射脂质体-外源DNA复合物 次数的增加，表达β-gal活性囊胚的比例也增加。
实施例3
雄性动物睾丸内进行三次外源DNA注射两天后与雌鼠进行交配， 对所产生的F0代胚胎外源DNA进行检测。这一实验是要证明：外源DNA 是否已在胚胎中存在，(孕期13天的胚胎)，此胚胎是由卵子与已注射 有外源DNA的变型精子使卵子受精而来的。
3.1雄性小鼠进行连续三次的外源DNA注射(对照为阴性溶液)， 并与8-10周龄的雌性鼠交配(已用雌性激素催情)，孕13天，即孕中期， 自子宫内取出胚胎。
3.2自鼠尾提取基因组DNA，以PCR方法对其基因组DNA进行 分析，PCR方法已于实例2中描述。实验结果如图6和表2中所示。图 6中，第1、2、4、6、8泳道中没有264bp的DNA条带，这说明没有 外源DNA存在。第3、5、7、9、10泳道，在264bp处有相应的DNA 条带，这表明转基因成功。在C泳道无264bp的外源DNA条带，这说 明正常鼠基因组DNA不含外源DNA。
实验结果概略如下：
(1)以PCR法对外源DNA的存在进行分析，实验组动物14只、 阳性动物4只，胚胎转基因阳性率28.6％。这一结果与以neo基因识别 引物位点的PCR分析结果一致。
(2)组织化学法检测外源DNA的表达(具有β-gal的活性)：分 析实验组动物53只，阳性动物18只，阳性率为34％。即证明有β-gal 的活性。
(3)在阴性对照组中10个胚胎样品均无外源DNA存在。21个阴 性对照样品均无β-gal活性。
这些实验结果证明：此专利方法能成功地产生转有外源DNA的转 基因动物。
实施例4
外源DNA由F0代遗传给F1代
由于已确证了以脂质体外源DNA复合物注射入雄性动物睾丸，能 使其精子的表型发生改变，该精子使卵子受精所产生的后代有外源DNA 的表达，所以，下面的实验将证明外源DNA是否能遗传给下一代。
4.1阳性实验组已经连续三次将脂质体外源DNA注射于雄鼠睾丸 (对照为缓冲液)，在末次注射2天后，雄鼠与发情雌鼠交配，所产F0代阳性个体继续交配产生子代F1代。
4.2自4周龄F1鼠尾提取基因组DNA，并以PCR、Southern法 进行分析，从鼠尾提取基因组DNA、PCR分析方法已在实例2中述及。
4.3 Southem杂交法参照Sato et al.，Mol.Reprod.Develop.34：349- 356，1993.，不同之处如下：10ug基因组DNA经EcoRI、BamHI酶切， 走0.8％琼脂糖电泳，将胶中的DNA转移到尼龙膜上(U.S.A.)此膜以32p 标记的探针进行Southem杂交，(探针DNA部分neo gene or β-gal) 杂交后，用0.1×SSC/0.01％SDS洗膜一次，56℃，30分钟。X-光片压 片。
4.4实验结果：
(1)如表2示：实验组中，实验动物个体数47个，阳性个体数25， 阳性率53.2％，表明外源DNA已经插入实验动物染色体内，并通过精子 可遗传给子代。
(2)对F0代转基因动物产生的F1代进行外源DNA的检测。小鼠 尾提取基因组DNA，方法如实例2所述，对DNA进行PCR分析、 Southem杂交，方法如实例2和实例4所述。部分结果如表7所示，在 表7中，F0、F1代为4周龄鼠，已用PCR法检测到外源DNA。经DNA 分析证明：F0代转基因阳性率约40％，F1代转基因阳性率为38％。这一 比例显示出外源基因的传递符合孟德尔定律，同时也表明该发明方法在 制备转基因动物阳性个体获得方面与显微注射法相同。 表1将外源DNA注射入雄性鼠睾丸，经交配，产生的胚胞内外源DNA的表达 外源基因注射次数 ×1 ×2 ×3 对照(×3) 睾丸内注射外源DNA后交配 产生的1细胞期胚胎数 82 81 21 40 发育到2细胞期的胚胎数(％) 82(100％) 81(100％) 20(95.2％) 40(100％) 发育至囊胚期的胚胎数(％) 53(64.6％) 61(75.3％) 20(95.2％) 38(95.0％) 具有β-gal活性的胚胎数 1/53 25/61 16/20 0/38 实验囊胚数 具有β-gal活性囊胚的比例 1.9％ 41％ 80％ 0.0％ 表2将外源DNA注射入雄性动物睾丸，经交配所产生的胚胎、 新生动物进行外源DNA检测及其表达的实验结果。 外源基因注射次数 ×3 对照(×3) 具有β-活性的13天龄胚胎数 18/53 0/21 13天龄胚胎总数 具有β-gal活性的胚胎阳性率 34.0 0 具有外源DNA的13天龄胚胎数 4/14 0/10 13天龄胚胎数 外源基因整和阳性率 28.6 0 外源DNA检测阳性的新生动物数 25/47 0/15 实验中所获新生动物数 含外源DNA动物阳性率 53.2 0 实施例5
外源DNA从F0代传递给F1代的遗传学数据
如实例4中实验程序一样，并增加实验动物的数量来进行分析，结 果如表3、图7所示。
表3 外源DNA注射次数 F0 F1 F2 F3 含外源DNA的新生 动物数 39/107 28/74 14/45 14/52 所有新生动物数 新生动物外源DNA 阳性率 36.4％ 37.8％ 31.1％ 26.9％
从这一实验结果可断定，此发明方法对转基因动物的制备更加方便、 高效。
本发明是一项与转基因非人类脊椎动物制备方法有关的发明，通过 将外源DNA与脂质体复合物直接注射入非人雄性脊椎动物的睾丸内， 将外源DNA转导入哺乳动物细胞内，理想的注射次数是3次或更多， 然后，用被注射动物与性成熟的雌性进行交配，或者用被注射的雄性动 物之精子与雌性卵进行人工体外授精，从而达到制备转基因动物的目 的。
作为有效制备转基因家畜、人类疾病模型动物的技术，转基因动物 制备技术至关重要。目前已建立的转基因动物的方法是显微注射法，即 用微注射仪将外源基因注射入受精卵的原核之中，但是由于耗时，一次 注射卵数目有限，技术要求高及仪器昂贵等因素，因此，该技术受到相 当的限制。
使用本技术发明，一次可注射100000个或更多个精子，对于难以显 微操作的家畜卵子来说这是一种特别有效的技术。此外，由于含有外源 DNA的精子可冻可融，可适时使用人工授精或体外授精，因此，可用于 工业化制备转基因动物。
序列目录：
序列号：1
序列长度：21
序列类型：核糖核酸
股：单股
拓扑学：线形
分子类型：其他核糖核酸
原始来源：无
有机物：无
种系：无
功能：识别β-gal基因4035-4055核苷酸引物，＂MI499β-gal＂
序列描述：序列号：1，GACCGCTGG GATCTGCCATTG
序列号：2
序列长度：21
序列类型：核酸
股：单股
拓扑学：线状
分子类型：其他核酸
原始来源：无
有机体：无
种系：无
功能：识别β-gal基因4278-4298核苷酸的引物，称为“MI500β-gal＂
序列描述：序列号：2，TACTGACGGG CTCCAGGAGTC
序列号：3
序列长度：26
序列类型：核酸
股：单股
拓扑学：线形
分子类型：其他核酸 原始来源：无 有机体：无 种系：无 功能：识别NEO基因1752-1767核苷酸的引物，称为“MI1511 neo” 序列描述：序列号：3，TCGTGGCTGG CCACGACGGG CGTTCC 序列号：4 序列长度：16 序列类型：核酸 股：单股 拓扑学：线形 分子类型：其他核酸 原始来源：无 有机体：无 种系：无 功能：识别NEO基因1846-1861核苷酸的引物，称为“MI1512 neo’ 序列描述：序列号：4，GACAGGAGAT CCTGCC