核转录因子AP1的表达抑制剂及使用其的药品和制品.pdf

本发明提供安全性优异、对核转录因子AP-1表达的抑制活性优异的核转录因子AP-1的表达抑制剂。本发明的AP-1表达抑制剂特征在于含有春黄菊苷。本发明中，春黄菊苷可以以罗马春黄菊或德国春黄菊的提取物的形式被包含。春黄菊苷包含在罗马春黄菊或德国春黄菊中，罗马春黄菊和德国春黄菊一直作为化妆品原料或药茶使用，安全上没有问题。罗马春黄菊或德国春黄菊的提取物和春黄菊苷由于在基因水平上抑制上述AP-1的表达(参照图2)，与现有的、阻碍上述AP-1与DNA结合的抑制剂相比，抑制效果更为优异。

1.春黄菊苷在制造核转录因子AP-1的表达抑制剂中的用途。 2.根据权利要求1所述用途，其中，所述AP-1的表达抑制为基因水平的表达抑制和蛋白质水平的表达抑制中的至少一者。 3.根据权利要求1所述的用途，上述春黄菊苷为罗马春黄菊来源的春黄菊苷和德国春黄菊来源的春黄菊苷中的至少一者。 4.根据权利要求1所述的用途，上述春黄菊苷为罗马春黄菊提取物和德国春黄菊提取物中至少一种提取物来源的春黄菊苷。 5.根据权利要求4所述的用途，其中所述提取物为选自由罗马春黄菊的醇提取物和水提取物以及德国春黄菊的醇提取物和水提取物所组成的组中的至少一种提取物。

技术领域

本发明涉及核转录因子AP-1的表达抑制剂、使用其的药品 和制品。

背景技术

癌症、动脉硬化、高血压或糖尿病等多种疾病的发病与白 细胞介素、TNF(tumor necrosis factors，肿瘤坏死因子)等细 胞因子有关。细胞因子受来自外界的刺激而分泌，发挥引起用 于生物体防御的各种反应的作用。

作为一例，基于图4说明白细胞介素-1(IL-1)参与的反应。 如图所示，当IL-1与IL-1受体(IL-1R)结合时，形成由4个蛋 白质即IL-1R、IL-1R-AcP(IL-RAcP)、MyD88和IRAK组成的 受体复合体。之后，IRAK在数分钟内从上述受体复合体脱离， 与被称作TRAF6的接头蛋白质结合。接着，TRAF6与TAK1和 TAB1结合，成为TAB1/TAK1复合体而活化。TAK1为属于MAP 激酶激酶(MAPKKK)的激酶之一，TAB1为TAK1的活化因子。 TAB1/TAK1复合体用于将MAP激酶(MAPKK)和NIK(NF-κB 诱导酶)两者磷酸化而将其活化，由此位于下游的2个激酶级联 体系得到活化。一个激酶级联体系为将核转录因子AP-1(以下 称作“AP-1”)活化的级联。AP-1为属于亮氨酸拉链型的转录调 控因子，通常结合于DNA，通过被磷酸化而活化。该磷酸化反 应通过JNK(c-Jun N-terminal kinase，c-Jun氨基末端激酶)和 p38完成，其中，JNK为MAPKK的成员。另一个激酶级联体系 为将NF-κB(nuclear factor kappa B，核因子B)活化的级联。 NF-κB不结合于DNA，通常与IκB(inhibitor-κB，κB抑制蛋白) 蛋白质形成复合体存在于细胞质内，通过IκB被磷酸化而分解 (分离)，从而被活化。该磷酸化反应通过IKK和NIK进行。而 且，通过核转录因子AP-1、NF-κB活化，引起炎症反应，例如 患上癌症、动脉硬化、高血压或糖尿病等疾病。

AP-1如上所述结合于DNA，作为AP-1结合的DNA区域，已 知例如特定的TRE序列(TGACTCA)或CRE序列 (TGACGTCA)。而且，例如关节炎中具有重要作用的白细胞 介素-6(IL-6)或TNF等细胞因子基因以及引起关节破坏的胶原 酶和溶基质蛋白酶等金属蛋白酶基因在其各自的启动子区域具 有上述特定的序列。因此，AP-1结合于这些DNA，促进上述基 因的转录。因此，AP-1与类风湿关节炎等结缔组织的炎症性疾 病有关，作为制药靶标受到关注。作为通过阻碍AP-1结合到 DNA来抑制AP-1活性的物质的具体例子，例如报告有天然产物 中的茶氨酸(专利文献1)、类维生素A化合物(专利文献2)、 寡核苷酸(专利文献3)和放线菌分泌物(专利文献4)。

专利文献1：日本特开2003-55213号公报

专利文献2：日本特表平11-504328号公报

专利文献3：日本特开平10-36272号公报

专利文献4：日本特开平10-130201号公报

发明内容

发明要解决的问题

但是，在现有的抑制AP-1活性的物质中，化学合成的物质 在安全性上存在问题。另外，来源于天然产物的物质虽然很安 全，但其效果不足。

因此，本发明的目的在于提高安全性优异、抑制AP-1的活 性优异的AP-1的抑制剂。

用于解决问题的方法

为了实现上述目的，本发明的核转录因子AP-1的表达抑制 剂含有春黄菊苷。

本发明的药品为用于预防或治疗与核转录因子AP-1相关 的疾病或者用于治愈与核转录因子AP-1相关的创伤的药品，其 含有本发明的核转录因子AP-1的表达抑制剂。

本发明的制品为用于预防或改善与核转录因子AP-1相关 的疾病或者用于促进与核转录因子AP-1相关的创伤治愈的制 品，其含有本发明核转录因子AP-1的表达抑制剂。

本发明的表达抑制方法为抑制核转录因子AP-1表达的方 法，其包括给予春黄菊苷的工序。

本发明的方法为用于预防或治疗与核转录因子AP-1相关 的疾病或者用于治愈与核转录因子AP-1相关的创伤的方法，其 包括给予春黄菊苷的工序。

本发明的春黄菊苷的应用为：用于抑制核转录因子AP-1表 达，用于预防或治疗与核转录因子AP-1相关的疾病或者用于治 愈与核转录因子AP-1相关的创伤。

发明效果

本发明人等为了实现上述目的，以天然产物为中心，对抑 制AP-1活性的物质进行一系列的研究。结果发现，一种菊科植 物即罗马春黄菊或德国春黄菊所含的春黄菊苷抑制AP-1的表 达，从而完成本发明。罗马春黄菊或德国春黄菊例如作为茶等 食品或化妆品原料而使用，其安全性没有问题。另外，春黄菊 苷由于抑制AP-1的表达，与现有的阻碍表达后的AP-1向DNA结 合来抑制AP-1的活性的抑制剂相比，可以更有效地抑制AP-1的 活性。而且，春黄菊苷不仅具有AP-1的表达抑制活性，而且还 具有抑制NF-κB的活性和抑制美拉德反应(Maillard reaction) 的活性。因此，这些作用与AP-1的表达抑制活性协同地发挥作 用，对炎症性疾病等各种疾病起到显著的效果。

附图说明

图1为表示本发明一个实施例中罗马春黄菊提取液的HPLC 色谱的图。

图2为表示上述实施例中春黄菊苷对核转录因子AP-1表 达抑制效果的图。

图3为表示参考例中罗马春黄菊提取物和春黄菊苷对 NF-κB表达抑制效果的图。

图4为表示白细胞介素-1、核转录因子AP-1和NF-κB的 关系的图。

图5为表示本发明一个实施例的HPLC色谱的图、(a)为德 国春黄菊提取液的HPLC色谱图、(b)为罗马春黄菊来源的春黄 菊苷的HPLC色谱图。

具体实施方式

本发明中，上述AP-1的表达抑制为基因水平上的表达抑制 和蛋白质水平上的表达抑制中的至少一者。上述基因水平的表 达抑制包括对转录成mRNA的抑制。另外，上述所谓的蛋白质 水平的表达抑制包括翻译中的抑制，在翻译后被修饰时，包括 抑制所述修饰。

通过例如给予或摄取本发明的AP-1的表达抑制剂，可以例 如在基因水平或蛋白质水平上抑制AP-1的表达。本发明的AP-1 的表达抑制剂并无限定，例如优选给予人、人以外的哺乳动物 或者使他们摄取。

本发明中，春黄菊苷可以举出例如罗马春黄菊(Anthemisnobilis)来源的春黄菊苷、德国春黄菊(Matricaia recutita)来 源的春黄菊苷等。罗马春黄菊来源的春黄菊苷可以是来自上述 罗马春黄菊的任意部分。例如可以举出罗马春黄菊全体(全草)、 花、茎、叶、枝、枝叶、根茎、根皮、根、种子等，其中优选 全草和花来源的春黄菊苷。德国春黄菊来源的春黄菊苷可以来 源于上述德国春黄菊的任意部分。例如可以举出德国春黄菊全 体(全草)、花、茎、叶、枝、枝叶、根茎、根皮、根、种子等， 其中优选全草和花来源的春黄菊苷。

本发明的表达抑制剂如上所述只要含有春黄菊苷即可，例 如春黄菊苷的含有形式并无限定。即，本发明的表达抑制剂例 如可以含有纯化的春黄菊苷，还可以通过含有罗马春黄菊或德 国春黄菊的全部或一部分来含有春黄菊苷。作为前者，例如可 以举出由罗马春黄菊或德国春黄菊提取进而纯化的春黄菊苷。 另外，纯化提取物时，春黄菊苷可以是单一纯化品，还可以是 部分纯化品。另外，作为后者例如可以举出来自罗马春黄菊或 德国春黄菊的全部或部分的提取物(例如未纯化的粗产品状 态)、罗马春黄菊或德国春黄菊的全部或部分的粉碎物等。罗马 春黄菊和德国春黄菊可以含有任何一者，还可以含有两者。而 且，上述春黄菊苷可以为合成物，还可以使用市售品。

上述春黄菊苷(chamaemeloside)化学名为芹菜素-7-葡糖 苷-6”-(3”’-羟基-3”’-甲基-戊二酸酯)(apigenin 7-glucoside-6”-(3”’-hydroxy-3’”-methyl-glutarate))，由下述 化学式表示。另外，本发明的春黄菊苷可以为春黄菊苷的盐(例 如Na盐、K盐等)。

本发明的AP-1表达抑制剂如上所述，只要含有春黄菊苷即 可，其组成或形态并无限定。即，本发明的AP-1的表达抑制剂 可以单独由上述春黄菊苷、单独由罗马春黄菊或德国春黄菊的 提取物、由罗马春黄菊提取物与德国春黄菊提取物的混合物、 单独由罗马春黄菊或德国春黄菊的粉碎物、由罗马春黄菊粉碎 物与德国春黄菊粉碎物的混合物、或者由这些的混合物构成， 还可以含有其它成分。上述其它成分并无限定，可以通过本发 明的用途等适当决定，可以举出例如后述各种成分、各种添加 剂。

本发明中，上述罗马春黄菊或德国春黄菊的提取物并无限 定，例如如后所述，可以举出水提取物、溶剂提取物。上述溶 剂提取物例如优选醇提取物。上述醇提取物例如可以举出异丙 醇提取物、乙醇提取物、甲醇提取物等。这些中，优选乙醇提 取物。

本发明的表达抑制剂中春黄菊苷含量并无限定，例如可以 根据本发明用途适当决定。作为具体例子，在上述表达抑制剂 中，春黄菊苷的含量以干燥重量计例如为0.001～90重量％、特 别优选配合成0.1～90重量％。当将本发明的表达抑制剂制成例 如片剂或胶囊形状时，可以在每1片或每1粒胶囊中配合例如 0.1～90重量％。这种形态的本发明的表达抑制剂例如可以以后 述的药品、补充剂等形式进行产品化。另外，当将本发明的表 达抑制剂制成例如液体状时，可以将其溶解在液体中使其中有 效成分即春黄菊苷的含量达到例如浓度0.01～1重量％，适当添 加添加剂，装在瓶容器(例如100mL容量)中。上述液体例如 可以举出水、醇等，上述添加剂例如可以举出香料、甜味料、 防腐剂等。另外，容器为了防止内容物变质，优选为棕色瓶。 这种形态的本发明的表达抑制剂例如可以以健康饮食品、特定 保健食品、营养辅助食品等形式进行产品化。春黄菊苷的摄取 量、给予量并无限定，例如成人每日优选0.01～1000mg/kg、更 优选每日0.1～100mg/kg。另外，上述春黄菊苷的给予或摄取例 如可以是一天一次，也可以是一天分为数次进行。

另外，将本发明的表达抑制剂作为例如涂摸用药等皮肤外 用剂使用时，例如优选在乳膏、凝胶、软膏、敷剂等中配合春 黄菊苷达到0.001～10重量％、更优选为0.1～1重量％。另外， 将本发明的表达抑制剂作为例如化妆品等皮肤外用剂使用时， 优选在化妆水、乳液、面霜、粉等中配合春黄菊苷达到0.001～ 10重量％、更优选为0.1～1重量％。

本发明中，用于制备上述罗马春黄菊或德国春黄菊的提取 物的原料，即罗马春黄菊或德国春黄菊的各种部位并无限定。 上述原料例如可以举出罗马春黄菊和德国春黄菊的至少一者的 全体(全草)、花、茎、叶、枝、枝叶、根茎、根皮、根、种子 等。这些中优选全草和花。另外，可作为干燥中药或生药购得 时，还可以利用这些。

上述罗马春黄菊或德国春黄菊的提取物例如可以通过在上 述原料(罗马春黄菊或德国春黄菊的各种部位)中加入溶剂直 接提取而获得。另外，除此之外还可以举出通过对上述原料施 以压榨处理而获得的压榨液。而且，还可以利用通过向利用上 述压榨处理所得的压榨液或残渣中加入溶剂进行提取而获得的 产物。

上述春黄菊苷的提取所使用的提取溶剂并无限定，例如可 以考虑供给制品的使用目的、种类或之后进行的加工处理等的 基础上适当选择。上述提取溶剂例如可以举出水性溶剂、有机 溶剂、它们的混合液等。具体例子例如可以举出水；甲醇、乙 醇、丙醇、异丙醇、丁醇、异丁醇等低级醇或含水低级醇；丙 二醇、1，3-丁二醇、1，2-丁二醇、1，4-丁二醇、1，5-戊二醇、1，2- 戊二醇、1，3-戊二醇、1，4-戊二醇、1，3，5-戊三醇、甘油、聚乙 二醇(分子量100～十万)等多元醇或含水多元醇；丙酮、乙酸 乙酯、二乙醚、二甲醚、甲乙醚、二噁烷、乙腈、二甲苯、苯、 氯仿、四氯化碳、苯酚、甲苯等各种有机溶剂。另外，还可以 举出调制成适当当量浓度的酸或碱。上述酸例如可以举出盐酸、 硫酸、硝酸、磷酸、甲酸、乙酸等，上述碱例如可以举出氢氧 化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氨等。这些溶剂例如可以使用任 意一种，还可以混合使用两种以上。另外，根据本发明的表达 抑制剂的用途，也可以仅使用水等水性溶剂。另外，还可以使 用提取处理后易于除去的溶剂(例如挥发性高的溶剂等)进行 提取，在除去溶剂后，使其溶解于上述水性溶剂的方法。另外， 还可以适当进行压榨提取。

上述提取方法并无限定，例如可以根据所用溶剂的温度、 溶剂与原料的重量比例等适当决定。另外，提取时间也无限定， 例如可以根据所用原料的种类、所用溶剂的种类、它们的组合 等任意地设定。溶剂的温度例如可以在-4℃～100℃的范围内任 意地设定，从原料所含成分的提取率和稳定性的观点出发，优 选10～80℃左右。另外，原料(A)与溶剂(B)的重量比例(A: B)例如可以在4:1～1:50的范围内任意地设定，特别优选为 1:1～1:20的范围。

本发明中，上述罗马春黄菊提取物或德国春黄菊提取物可 以在如上进行提取后，例如进而适当实施纯化处理。纯化处理 例如可以举出通过添加酸(例如盐酸、硫酸、硝酸、磷酸、有 机酸)或碱(例如氢氧化钠、氢氧化钙、氨等)进行分解；利 用微生物进行发酵或代谢转化(metabolic conversion)；利用离 子交换树脂或活性炭、硅藻土等进行成分吸附；使用具有各种 分离模式(例如离子交换、亲水性吸附、疏水性吸附、尺寸排 阻、配体交换、亲合性等)的色谱进行分级分离；使用滤纸、 滤膜、超滤膜等的过滤；加压或减压；升温或冷却；干燥；pH 调整；除臭、脱色；长时间的静置保存等。这些处理可以为任 何一个，还可以任意组合两种以上进行处理。

本发明中，上述罗马春黄菊提取物或德国春黄菊提取物的 形态并无限定，例如可以举出液体状、固体状、粉末状、颗粒 状、凝胶状等。

本发明的AP-1表达抑制剂的剂型并无限定，例如可以根据 使用目的任意地设定。具体例子例如可以举出安瓿状、胶囊状、 粉末状、颗粒状、丸状、片剂状、固体状、液体状、凝胶状、 气泡状、乳液状、乳膏状、软膏状、片状、摩丝状、粉末分散 状、多层状、气雾状等。

接着，本发明的AP-1的表达抑制剂可以应用于例如药品、 类药品(quasi-drugs)、其它制品中。上述制品并无特别限定， 例如有补充剂、食品、饮料、食品添加剂、化妆品原料和化妆 品等。

本发明的药品为用于预防或治疗与核转录因子AP-1相关 疾病或者用于治愈与核转录因子AP-1相关的创伤的药品，其含 有上述本发明的AP-1表达抑制剂。上述疾病包括例如选自由癌 症、癌扩散、动脉硬化、高血压、糖尿病、皮肤病、恶性增殖 性疾病、新内膜增殖性疾病、非恶性增殖性疾病、自身免疫疾 病、免疫性疾病、关节炎、哮喘、过敏、慢性炎症性疾病、脂 质代谢运输相关疾病、干眼症、神经退行性疾病、阿尔茨海默 病和帕金森症所组成的组中的至少一种疾病。上述皮肤病包括 例如选自由痤疮、毛囊角化病、银屑病、鱼鳞病、湿疹、日光 性皮炎和特应性皮炎所组成的组中的至少一种疾病。上述恶性 增殖性疾病包括例如选自由上皮癌、乳腺癌、前列腺癌、头颈 部癌和髓系白血病所组成的组中的至少一种疾病。上述新内膜 增殖性疾病包括例如动脉粥样硬化和再狭窄中的至少一种疾 病。上述非恶性增殖性疾病包括例如选自由子宫内膜增生、良 性前列腺增生症和增生性玻璃体视网膜病变所组成的组中的至 少一种疾病。上述自身免疫疾病包括例如类风湿关节炎。上述 免疫疾病包括例如红斑狼疮。上述慢性炎症性疾病包括例如肺 纤维化。上述脂质代谢运输相关疾病包括例如高脂血症。通过 给予本发明的药品，可以预防或治疗这些疾病、治愈创伤。给 予本发明药品的对象并无限定，例如可以举出人、人以外的哺 乳动物。

本发明的药品除了上述本发明的表达抑制剂之外，还可以 含有例如其它AP-1表达的抑制成分、药学上允许的添加物等。 本发明的药品的具体剂型例如可以举出片剂、颗粒剂(包括散 剂)、胶囊、液体剂(包括糖浆剂)等。可以根据这些各剂型， 分别适当使用适合的添加剂、基材等，根据日本药局方等记载 的通常方法进行制造。另外，给予途径也无限定，例如可以举 出经口给予或非经口给予。上述非经口给予例如可以举出口腔 内给予、气管内给予、直肠内给予、皮下给予、肌肉内给予、 静脉内给予等。上述非经口给予还包括例如在皮肤上的涂抹(经 皮给予)。

本发明的补充剂为用于预防或改善与AP-1相关的疾病或 者用于促进与AP-1相关的创伤治愈的补充剂，其含有上述本发 明的AP-1的表达抑制剂。上述疾病包括例如选自由癌症、癌扩 散、动脉硬化、高血压、糖尿病、皮肤病、恶性增殖性疾病、 新内膜增殖性疾病、非恶性增殖性疾病、自身免疫疾病、免疫 性疾病、关节炎、哮喘、过敏、慢性炎症性疾病、脂质代谢运 输相关疾病、干眼症、神经退行性疾病、阿尔茨海默病和帕金 森症所组成的组中的至少一种疾病。上述皮肤病包括例如选自 由痤疮、毛囊角化病、银屑病、鱼鳞病、湿疹、日光性皮炎和 特应性皮炎所组成的组中的至少一种疾病。上述恶性增殖性疾 病包括例如选自由上皮癌、乳腺癌、前列腺癌、头颈部癌和髓 系白血病所组成的组中的至少一种疾病。上述新内膜增殖性疾 病包括例如动脉粥样硬化和再狭窄中的至少一种疾病。上述非 恶性增殖性疾病包括例如选自由子宫内膜增生、良性前列腺增 生症和增生性玻璃体视网膜病变所组成的组中的至少一种疾 病。上述自身免疫疾病包括例如类风湿关节炎。上述免疫疾病 包括例如红斑狼疮。上述慢性炎症性疾病包括例如肺纤维化。 上述脂质代谢运输相关疾病包括例如高脂血症。通过给予本发 明的补充剂，可以预防或改善这些疾病、促进创伤治愈。给予 本发明补充剂的对象并无限定，例如可以举出人、人以外的哺 乳动物。

本发明的补充剂除了上述本发明的表达抑制剂之外，还可 以含有各种添加剂、其它的补充剂等。上述其它成分例如可以 举出其它的AP-1表达抑制成分、维生素C等各种维生素类、氨 基酸、寡糖等。本发明的补充剂的形态并无特别限定，例如可 以举出片剂、颗粒剂(包括散剂)、胶囊、液体剂(包括糖浆剂) 等。

本发明的食品为用于预防或改善与AP-1相关的疾病或者 用于促进与AP-1相关的创伤治愈的食品，其含有上述本发明的 AP-1的表达抑制剂。上述疾病包括例如选自由癌症、癌扩散、 动脉硬化、高血压、糖尿病、皮肤病、恶性增殖性疾病、新内 膜增殖性疾病、非恶性增殖性疾病、自身免疫疾病、免疫性疾 病、关节炎、哮喘、过敏、慢性炎症性疾病、脂质代谢运输相 关疾病、干眼症、神经退行性疾病、阿尔茨海默病和帕金森症 所组成的组中的至少一种疾病。上述皮肤病包括例如选自由痤 疮、毛囊角化病、银屑病、鱼鳞病、湿疹、日光性皮炎和特应 性皮炎所组成的组中的至少一种疾病。上述恶性增殖性疾病包 括例如选自由上皮癌、乳腺癌、前列腺癌、头颈部癌和髓系白 血病所组成的组中的至少一种疾病。上述新内膜增殖性疾病包 括例如动脉粥样硬化和再狭窄中的至少一种疾病。上述非恶性 增殖性疾病包括例如选自由子宫内膜增生、良性前列腺增生症 和增生性玻璃体视网膜病变所组成的组中的至少一种疾病。上 述自身免疫疾病包括例如类风湿关节炎。上述免疫疾病包括例 如红斑狼疮。上述慢性炎症性疾病包括例如肺纤维化。上述脂 质代谢运输相关疾病包括例如高脂血症。通过摄取本发明的食 品，可以预防或改善这些疾病、促进创伤治愈。本发明的食品 并无限定，例如优选被人、人以外的哺乳动物摄取。

本发明的食品除了上述本发明的表达抑制剂之外，还可以 含有其它各种成分。上述其它成分例如可以举出其它AP-1表达 抑制成分、各种添加剂、补充剂等。本发明中，上述食品包括 例如普通食品和功能性食品两者。本发明中，食品的形态并无 特别限定，例如可以举出谷类、面类、点心类、汤、肉、海产 品类、海藻、蔬菜、水果、豆类、各种加工品、干燥食品、冷 冻食品、熏制品、罐头、瓶装食品、方便食品等。

本发明的饮料为用于预防或改善与AP-1相关的疾病或者 用于促进与AP-1相关的创伤治愈的饮料，其含有上述本发明的 AP-1表达抑制剂。上述疾病包括例如选自由癌症、癌扩散、动 脉硬化、高血压、糖尿病、皮肤病、恶性增殖性疾病、新内膜 增殖性疾病、非恶性增殖性疾病、自身免疫疾病、免疫性疾病、 关节炎、哮喘、过敏、慢性炎症性疾病、脂质代谢运输相关疾 病、干眼症、神经退行性疾病、阿尔茨海默病和帕金森症所组 成的组中的至少一种疾病。上述皮肤病包括例如选自由痤疮、 毛囊角化病、银屑病、鱼鳞病、湿疹、日光性皮炎和特应性皮 炎所组成的组中的至少一种疾病。上述恶性增殖性疾病包括例 如选自由上皮癌、乳腺癌、前列腺癌、头颈部癌和髓系白血病 所组成的组中的至少一种疾病。上述新内膜增殖性疾病包括例 如动脉粥样硬化和再狭窄中的至少一种疾病。上述非恶性增殖 性疾病包括例如选自由子宫内膜增生、良性前列腺增生症和增 生性玻璃体视网膜病变所组成的组中的至少一种疾病。上述自 身免疫疾病包括例如类风湿关节炎。上述免疫疾病包括例如红 斑狼疮。上述慢性炎症性疾病包括例如肺纤维化。上述脂质代 谢运输相关疾病包括例如高脂血症。通过摄取本发明的饮料， 可以预防或改善这些疾病、促进创伤治愈。本发明的饮料并无 限定，例如优选被人、人以外的哺乳动物摄取。

本发明的饮料除了上述本发明的表达抑制剂之外，还可以 含有其它各种成分。上述其它成分例如可以举出其它的AP-1表 达抑制成分、各种添加剂、补充剂等。本发明中，上述饮料包 括例如普通饮料和功能性饮料两者。本发明中，饮料的形态并 无特别限定，例如可以举出果汁等软饮料、碳酸饮料、咖啡、 红茶、绿茶、矿泉水等。

本发明的食品添加剂为用于预防或改善与AP-1相关的疾 病或者用于促进与AP-1相关的创伤治愈的食品添加剂，其含有 上述本发明的AP-1的表达抑制剂。上述疾病包括例如选自由癌 症、癌扩散、动脉硬化、高血压、糖尿病、皮肤病、恶性增殖 性疾病、新内膜增殖性疾病、非恶性增殖性疾病、自身免疫疾 病、免疫性疾病、关节炎、哮喘、过敏、慢性炎症性疾病、脂 质代谢运输相关疾病、干眼症、神经退行性疾病、阿尔茨海默 病和帕金森症所组成的组中的至少一种疾病。上述皮肤病包括 例如选自由痤疮、毛囊角化病、银屑病、鱼鳞病、湿疹、日光 性皮炎和特应性皮炎所组成的组中的至少一种疾病。上述恶性 增殖性疾病包括例如选自由上皮癌、乳腺癌、前列腺癌、头颈 部癌和髓系白血病所组成的组中的至少一种疾病。上述新内膜 增殖性疾病包括例如动脉粥样硬化和再狭窄中的至少一种疾 病。上述非恶性增殖性疾病包括例如选自由子宫内膜增生、良 性前列腺增生症和增生性玻璃体视网膜病变所组成的组中的至 少一种疾病。上述自身免疫疾病包括例如类风湿关节炎。上述 免疫疾病包括例如红斑狼疮。上述慢性炎症性疾病包括例如肺 纤维化。上述脂质代谢运输相关疾病包括例如高脂血症。通过 摄取本发明的食品添加剂，可以预防或改善这些疾病、促进创 伤治愈。本发明的食品添加剂并无限定，例如优选被人、人以 外的哺乳动物摄取。

本发明的食品添加剂除了上述本发明的表达抑制剂之外， 还可以含有其它各种成分。上述其它成分例如可以举出其它的 AP-1表达抑制成分、各种添加剂、补充剂等。本发明的食品添 加剂的形态并无特别限定，例如可以举出液体状、粉末状、片 状、颗粒状等。本发明的食品添加剂不仅包含食品用添加剂， 还包含饮料用食品添加剂。

本发明的化妆品原料为用于预防或改善与AP-1相关的疾 病或者用于促进与AP-1相关的创伤治愈的化妆品原料，其含有 上述本发明的AP-1表达抑制剂。上述疾病可以列举皮肤病。具 体而言，包括例如选自由痤疮、毛囊角化病、银屑病、鱼鳞病、 湿疹、日光性皮炎和特应性皮炎所组成的组中的至少一种疾病。 通过应用本发明的化妆品原料，可以预防或改善上述疾病。本 发明的化妆品原料没有限定，但优选优选应用于人、人以外的 哺乳动物。

本发明的化妆品原料除了本发明的表达抑制剂之外，例如 可以含有其它各种成分。上述其它成分例如可以举出其它的 AP-1表达抑制剂、各种添加剂等。上述各种添加剂例如可以举 出各种油脂类、蜡类、矿物油、脂肪酸类、醇类、多元醇类、 酯类、金属皂类、胶质、糖类、水溶性高分子类、表面活性剂、 各种维生素类、各种氨基酸类、植物或动物来源的添加剂、生 药、海洋成分、微生物培养代谢物、α-羟基酸类、无机颜料、 紫外线吸收剂、防紫外线剂、美白剂、酪氨酸酶活性抑制剂、 黑色素还原剂、黑色素分解剂、细胞活化剂、收敛剂、氧自由 基清除剂、抗氧化剂、过氧化脂质抑制剂、抗炎剂、抗菌剂、 杀菌剂、消毒药、保湿剂、弹性蛋白酶活性抑制剂(elastase activity inhibitors)、头发用剂、抗雄性激素剂、外周血循环促 进剂、刺激剂、代谢激活剂、抗泌脂剂、角质溶解剂、氧化剂、 去毛剂、毛发膨润剂、染料、香料、色素、着色剂、甜味料、 营养强化剂、乳制品、激素类、多价螯合剂、pH调整剂、螯合 剂、防腐剂、防霉剂、清凉剂、稳定剂、乳化剂、血液循环促 进剂、抗炎剂、消炎剂、抗过敏剂、伤口愈合剂、增泡剂、增 稠剂、酶、精制水、口腔用剂、消臭剂、除臭剂、苦味剂、调 味剂等。

本发明的化妆品含有上述本发明的化妆品原料。应用本发 明的化妆品时，能够预防或改善上述皮肤病或者促进创伤治愈。 本发明的化妆品例如优选应用于人、人以外的哺乳动物。本发 明的化妆品除了本发明的化妆品原料之外，例如还可以含有其 它添加剂。上述添加剂例如可以使用在上述化妆品原料中举出 的物质。本发明化妆品的形态并无特别限定，例如可以举出化 妆水、乳液、面霜、软膏、洗剂、油、面膜等基础化妆品，肥 皂、清洁霜、清洁剂、洗面奶等皮肤清洁品；洗发香波、护发 素、护发者哩等洗发用化妆品；发膏、喷发剂、生发油、发胶、 洗发剂、发油、护发精华、整发水啫哩、发蜡、整发泡末等美 发品，护发、养发品；单组分染发剂或双组分染发剂、染发剂 等染发品；永久性卷发剂或拉直剂等烫发剂、烫发保持剂等头 发美容品；粉底、散粉、扑面粉、口红、腮红、眼影膏、眼线、 睫毛膏、眉笔、假睫毛等彩妆化妆品；美甲料等装饰性化妆品； 香水类等化妆品组合物。另外，例如可以举出牙膏类；含漱液 等口腔用组合物；外用药用制剂；软膏；糊剂；浴用剂；药用 牙膏、口中清凉剂等药用口腔用组合物；药用化妆品；永久性 卷发溶剂、染发剂、生发剂、防脱发剂、去毛剂等毛发溶剂； 防腋臭-体臭剂；卫生用品、卫生棉类、湿巾等外用类药品等。

接着，本发明为抑制AP-1表达的方法，其包括给予上述春 黄菊苷的工序。通过给予春黄菊苷，可以抑制细胞中AP-1的表 达。作为给予春黄菊苷的对象并无限制，例如可以为生物体， 还可以为从生物体分离的细胞、培养细胞。作为上述生物体并 无限定，例如可以举出人、包括人在内的哺乳类动物等。所给 予的上述春黄菊苷的形态并无限定，例如如上所述，可以举出 经纯化的春黄菊苷、罗马春黄菊或德国春黄菊全体或部分的提 取物、粉碎物等。本发明的春黄菊苷的形态的具体例子可以举 出与上述本发明的AP-1的表达抑制剂、药品、各种制品等相同 的形态。

上述给予方法并无限定，例如生物体时可以举出经口给予 或非经口给予。为上述非经口给予时，例如可以举出口腔内给 予、气管内给予、直肠内给予、皮下给予、肌肉内给予、静脉 内给予、向皮肤涂抹(经皮给予)等。另外，为从生物体分离 的细胞的情况下，例如可以举出在培养基中添加春黄菊苷进行 培养的方法。

接着，本发明为用于预防或治疗与AP-1相关的疾病或用于 治愈与AP-1相关的创伤的方法，其包括给予春黄菊苷的工序。 上述本发明的AP-1的表达抑制剂的形态并无限定，与上述同 样。另外，上述AP-1的表达抑制剂例如可以作为上述炎症性改 善剂、药品、补充剂、食品、饮料、食品添加剂等进行给予。

上述给予方法并无限定，例如可以举出经口给予或非经口 给予。为上述非经口给予时，例如可以举出口腔内给予、气管 内给予、直肠内给予、皮下给予、肌肉内给予、静脉内给予、 对皮肤涂抹(经皮给予)等。给予上述春黄菊苷的对象并无限 定，例如可以举出人或包括人在内的哺乳类动物。

接着，说明本发明的实施例。另外，本发明并非局限于下 述实施例。

实施例1

本实施例为确认春黄菊苷在基因水平抑制核转录因子 AP-1的表达的例子。

(1)罗马春黄菊提取液的制备

将罗马春黄菊(Anthemis nobilis Linn.)的干燥药材头状花 序1kg浸渍于50％(v/v)乙醇20kg中，进行1周提取处理。 提取处理后，进行抽滤，获得12.63kg的罗马春黄菊提取液。

(2)春黄菊苷的纯化

春黄菊苷按照以下步骤纯化。将上述罗马春黄菊提取液冷 冻干燥。将该干燥物(提取物固态成分)10.31g悬浮在调整至 pH4的水(H2O)750mL中后，使用氯仿进行分配。然后，除 去氯仿层后，在水层中添加乙酸乙酯进行分配，获得2.80g乙 酸乙酯层(乙酸乙酯分配提取物)。用甲醇50mL溶解pH4的 乙酸乙酯分配提取物，向其中添加硅胶。由此，使乙酸乙酯层 中所含上述罗马春黄菊提取物吸附在上述硅胶上。然后，在加 温槽上利用刮勺对其进行搅拌后，进行减压浓缩，从而将有机 溶剂完全地除去。将所得浓缩物称作含硅胶浓缩级分。

通过以下的柱色谱对该含硅胶浓缩级分进行第1次纯化。将 上述含硅胶浓缩级分悬浊于氯仿/甲醇(体积比8/1)，将pH调整 至4。然后，在直径5cm、高度20cm的色谱管中填充用氯仿/甲 醇(体积比7/1)平衡后的硅胶约400cm3，由其上添加上述含硅 胶浓缩级分的悬浊液。接着，按顺序分别使用约1200mL氯仿/ 甲醇(体积比7/1、5/1、3/1、1/1)和甲醇进行洗脱。然后，回 收以氯仿/甲醇(体积比1/1)洗脱的级分，在减压下除去所含 的溶剂。

接着，进一步用以下柱色谱对用第1次柱色谱回收的级分进 行第2次纯化。将浓缩的上述回收级分溶解于乙腈/水/TFA(体 积比10/90/0.1)中。另外，在直径3cm的色谱管中填充用甲醇 悬浊的载体(商品名Cosmosil140 C18-OPN)约60cm3，用600mL 的乙腈/水/TFA(体积比10/90/0.1)平衡。在该色谱管中放入上 述用乙腈/水/TFA溶解的回收级分。接着，按顺序分别用180mL 的乙腈/水/TFA(体积比10/90/0.1、18/82/0.1、25/75/0.1)和乙 腈进行洗脱，然后回收用乙腈/水/TFA(体积比25/75/0.1)洗脱 的级分。

将所得回收级分减压浓缩后，进行冷冻干燥。用甲醇将上 述冷冻干燥物再次溶解后，将该甲醇溶液在下述条件下供于分 离HPLC，从而将春黄菊苷分离。下述条件中，TFA为三氟乙酸。 试样为含有春黄菊苷提取物固态物100mg/mL量的甲醇溶液。

HPLC条件

色谱柱：商品名COSMOSIL 5C18-MS

250×10mm I.D.

洗脱液：乙腈/水/TFA(体积比20/80/0.1)

流速：4.7mL/min

检测：UV在220nm

柱温：40℃

上样量：50μL

分离时间：14～16分钟

HPLC的色谱图示于图1。图1中，箭头所示峰为春黄菊苷的 峰。春黄菊苷的鉴定如下进行：对经HPLC分离的物质测定核磁 共振光谱(NMR)，确认与文献(Gabriela等、Phytochemistry， 41：643-646，1996)的分析值一致。将该上述NMR的数据与 上述文献的数据一并示于下述表1。该结果为，所得纯化春黄菊 苷相对于罗马春黄菊提取液300mg为32mg。

表1

(3)核转录因子AP-1活性测定

胰蛋白酶处理HeLa细胞，在4℃、1000rpm下离心分离3 分钟。将回收的HeLa细胞接种于30mm皿中达到2×105细胞/ 孔的密度，作为检测板。将上述检测板在37℃、5％CO2存在下 培养细胞12小时后，进行转化。上述转化中，使用转化用试剂 (商品名Effectene Transfection Reagent、QIAGEN公司制)， 将2种载体导入上述细胞内。上述载体使用商品名pAP-1 (PMA)-SEAP(CLONTECH公司)(0.4μg)和商品名 pLuc-control(CLONTECH公司)(0.02μg)。然后将导入有上 述两载体的细胞在37℃、5％CO2存在下培养16小时后，使用 胰蛋白酶将培养细胞从上述检测板上剥离。将剥离的细胞分注 于96孔板中，每孔0.2×104个细胞。将所分注的细胞培养2小 时后，添加上述春黄菊苷溶液达到终浓度(提取物固态成分重 量)10μg/mL、5.0μg/mL、2.5μg/mL和1.0μg/mL，进而添加TPA (12-O-十四烷酰佛波醇醋酸酯)达到最终浓度4μg/mL。距离 上述添加24小时后，各回收25μL培养基。然后，对所回收的 培养基使用试剂盒(商品名Great EscAPe SEAP kit，CLONTECK 公司)评价基于所含核转录因子AP-1活性的分泌型碱性磷酸 酶(secreted alkaline phosphatase，SEAP)活性。另外，基因 表达的校正是使用利用萤光素酶活性测定试剂盒(Promega公 司)测定的萤光素酶活性测定值进行的。将该结果示于图2的 图表中。另外，核转录因子AP-1表达抑制的评价是用以各春 黄菊苷添加浓度的萤光素酶活性为100％时的分泌型碱性磷酸 酶(SEAP)活性的相对值％(抑制率％)表示。

如图2的图表所示，通过添加春黄菊苷，可以浓度依赖地抑 制(阻碍)核转录因子AP-1的表达。另外，春黄菊苷的IC50为 5μg/mL。

(4)德国春黄菊中的春黄菊苷

制备德国春黄菊的提取液，对该提取液在上述条件下进行 HPLC分析，确认春黄菊苷的存在。

将德国春黄菊(Matricaia recutita)的干燥药材头状花序 2g浸渍于80℃的蒸馏水200ml中，进行10分钟提取处理。提 取处理后，进行抽滤，获得200ml的德国春黄菊提取液。在下 述条件下将该提取液供至HPLC。另外，对于前述由罗马春黄 菊经HPLC纯化的春黄菊苷(32μg/ml)，在相同条件下供于 HPLC。

HPLC条件

色谱柱：商品名COSMOSIL 5C18-AR-II

250×4.6mm I.D.

洗脱液：乙腈/水/TFA(体积比20/70/0.1)

流速：1.0mL/min

检测：UV在340nm

柱温：40℃

上样量：20μL

将这些HPLC的色谱图示于图5。图5中，(a)为德国春黄菊 提取液的色谱图、(b)为罗马春黄菊来源的春黄菊苷的色谱图。 如图5的(a)所示，可以确认德国春黄菊提取物在与图5的(b) 所示的罗马春黄菊来源的春黄菊苷相同的保留时间处存在峰。 由此结果可以鉴定，德国春黄菊提取物中含有春黄菊苷。如此， 由于德国春黄菊也含春黄菊苷，因此与罗马春黄菊相同，以德 国春黄菊为原料，也可制备本发明的春黄菊苷，获得AP-1表达 抑制效果。

(参考例)

本参考例为使用实施例1所得罗马春黄菊提取液和春黄菊 苷评价抑制NF-κB活性的例子。

胰蛋白酶处理HeLa细胞，在4℃、1000rpm下离心分离3分 钟。将回收的Hela细胞接种于30mm皿中达到2×105细胞/孔的密 度，作为检测板。将上述检测板在37℃、5％CO2存在下培养细 胞12小时后，进行转化。上述转化中，使用转化用试剂(商品 名Effectene Transfection Reagent、QIAGEN公司制)，将2种载 体导入上述细胞内。上述载体使用商品名pNF-κB-SEAP (CLONTECH公司)(0.4μg)和商品名pLuc-control (CLONTECH公司)(0.02μg)。然后将导入有上述两载体的细 胞在37℃、5％CO2存在下培养16小时后，使用胰蛋白酶将培养 细胞从上述检测板上剥离。将剥离的细胞分注于96孔板中，每 孔0.2×104个细胞。将所分注的细胞培养2小时后，添加上述罗 马春黄菊提取液达到终浓度(提取物固态成分重量)100μg/mL、 50μg/mL、25μg/mL，或者添加上述春黄菊苷溶液达到终浓度 100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL，进而添加TNF(肿瘤坏死因子) -α达到最终浓度40ng/mL。距离上述添加24小时后，各回收25μL 培养基。然后，对所回收的培养基使用试剂盒(商品名Great EscAPe SEAP kit，CLONTECK公司)评价基于所含NF-κB活性 的分泌型碱性磷酸酶(SEAP)活性。另外，基因表达的校正是 使用利用萤光素酶活性测定试剂盒(Promega公司)测定的萤 光素酶活性测定值进行的。将该结果示于图3的图表中。另外， NF-κB表达抑制的评价是用以各待测物质(罗马春黄菊提取物 或春黄菊苷溶液)添加浓度的萤光素酶活性为100％时的分泌型 碱性磷酸酶(SEAP)活性相对值％(抑制率％)表示。

如图3的图表所示，罗马春黄菊提取物或春黄菊苷两者均可 以浓度依赖地抑制NF-κB的表达。另外，罗马春黄菊提取物的 IC50为50μg/mL、春黄菊苷的IC50为80μg/mL。

产业实用性

如上所述，本发明的核转录因子AP-1的表达抑制剂的特征 在于含有春黄菊苷，安全性优异，且即便长时间摄取也无问题。 另外，本发明的上述表达抑制剂对核转录因子AP-1的表达起到 优异的抑制活性。因此，本发明的核转录因子AP-1的表达抑制 剂例如可以适用于药品、类药品、补充剂、食品、饮料、食品 添加剂等各种物质中，其用途没有限定，很广泛。