技术领域
本发明属生物技术领域，具体涉及一种弱势表位优势化新系统 及其制备的乙肝治疗性疫苗
技术背景
抗原表位(epitope)是抗原分子中诱生不同免疫应答最基本的结 构及功能单位。机体对抗原分子的免疫识别和应答，其本质上是对 抗原表位的识别和应答。通常，同一抗原分子中存在有不同功能的 抗原表位，其中，能优先引起较强免疫应答的抗原表位称为主要抗 原表位(immunodominant epitope)或优势表位(superior epitope)。 优势表位不仅可诱生针对其本身的特异性免疫应答，同时也可抑制 机体免疫系统对其他抗原表位的免疫识别，这些不能引起免疫识别 和应答的抗原表位称为隐匿表位(cryptic epitope)或弱势表位 (inferior epitope)。弱势表位的形成除与优势表位的免疫抑制有 关外，MHC和TCR的选择性、T细胞前体数量以及抗原表位局部的结 构稳定性亦起作重要作用。
尽管天然状态下的弱势表位不能有效诱生机体的免疫识别和应 答。然而，据研究弱势表位在疾病的发病机制和防治中可能具有重 要作用：1)某些弱势表位可能是抗原分子中诱生中和抗体或特异性 CTL的重要表位；2)大多数肿瘤相关抗原免疫原性较弱，难以诱生 有效的免疫应答，包含了许多弱势表位；3)优势表位可优先诱生较 强免疫应答，但同时在某些状态下也为重要的免疫耐受原，此时诱 生对其弱势表位的应答，可能是消除免疫耐受的有效途径。因此， 弱势表位的优势化(superiorization of inferior epitope)将可 提高某些重要表位的免疫原性，对新型治疗性疫苗的分子设计具有 重要的理论和应用意义。
乙型肝炎病毒简称乙肝病毒的感染，是较严重的公共卫生问题。 据统计，我国为一肝炎大国，约7.2亿感染过乙肝病毒，1.2亿为 乙肝病毒表面抗原携带者。现患慢性肝炎病人约3000万，每年因肝 病死亡约40万。慢性乙型肝炎的治疗是目前尚未解决的世界难题。 机体的免疫机制不能有效地清除病毒(称免疫耐受性)，是造成慢性 肝炎的主要原因。某些可特异性活化Th细胞的乙肝病毒重要抗原表 位在免疫耐受状态下不能有效激活免疫系统，表现为特异性无应答 性即优势表位弱势化。因此，弱势表位优势化可望激发、增强、调 控机体对免疫耐受性弱势化表位的特异性免疫应答，从根本上清除 病毒。因此，十分必要建立弱势表位优势化新系统。
发明内容
本发明的目的是提供一弱势表位的优势化的新系统，并以该系 统为基础制备一种新的多功能乙肝治疗性疫苗。
本发明实现弱势表位优势化的基本方案是将不同的优势表位与 弱势表位同时克隆于抗体分子CDRs，以获得一分子量足够大、免疫 原性优势化、表位空间构象限定、含多种不同免疫功能抗原表位的 新型免疫分子。因此，本发明构建的弱势表位优势化新系统是以抗 体分子为骨架，以CDR结构为克隆点，以TT表位为优势表位，以乙 肝病毒B细胞及CTL表位为弱势表位。本发明的实验证实了该系统 可实现弱势表位优势化；经该系统优势化的表位是一种新的多功能 乙肝治疗性疫苗。
本发明的技术方案是通过以下步骤实现的：
1.选择及克隆弱势表位
根据以往的工作基础及计算机辅助分析，确定了用于弱势表位 优势化新系统构建的乙肝病毒B细胞抗原表位P133-145和CTL表 位P18-27，其氨基酸序列分别为DPRVPGLYFPAGG和FLPSDFFPSI。在 急性乙肝病毒感染者或疫苗免疫者中这两个表位具有较好免疫原 性，体外可与特异性抗体或特异性CTL发生有效识别和反应。但这 两个表位单独作为免疫原或在慢性乙肝患者中的抗原性较差，为弱 势表位。本发明中人工合成了引物并退火形成P133-145和P18-27 表位编码基因序列，分别克隆于含人抗体重链基因的真核表达载体 的CDR3和CDR1中，获得了可表达该抗原表位的全抗体重链分子的 真核表达重组体γB和γC，经DNA测序证实序列和插入方向的正确性。
2.选择及克隆优势表位
自破伤风类毒素中筛选及确定了用于弱势表位优势化新系统构 建的优势抗原表位TT 830-844，其氨基酸序列为QYIKANSKF抗体 ITE。研究表明，该表位可在不同MHC个体间诱生、增强抗原特异性 免疫反应。人工合成引物并退火形成TT830-844编码基因序列，克隆 于γB和γC的CDR2中，分别获得可表达多抗原表位的全抗体重链分 子的真核表达重组体γHB、γCH和γCHB。经DNA测序证实序列和插入 方向的正确性。
3.弱势表位优势化新系统可构象限定性表达抗原表位
本发明以γB、γCH和γC、γCH、γCHB体外转染抗体重链缺失的J558L细胞，以G418筛选阳性克隆，获得稳定传代和表达抗体的细胞株。 研究证实抗体分子克隆乙肝B细胞抗原表位或CTL表位后，并不改 变抗体的分泌功能；且优势表位TT830-844的同时克隆不影响弱势 表位的表达。重组的重链在体外转染细胞中与内源性轻链结合，装 配成H2L2结构，有效表达的抗原表位可与相应抗体结合，提示抗体 CDRS表达的表位多肽可能具有与天然蛋白中抗原表位类似的空间构 象。在体内研究中，以上述构建的质粒DNA经脾免疫小鼠，其血清 中也检测到相应转基因产物(人源化抗体)。自第五天起几检出，高 峰持续约二周，以后逐渐消失，至第四周完全消失。表明该系统在 体内均可正确转录、翻译，表达和自分泌出细胞。
4.弱势表位优势化新系统中的优势表位可增强弱势表位诱导特 异性免疫应答
以纯化的γHB免疫C57BL小鼠，以γB免疫小鼠为对照。结果发 现：1)γB及γHB免疫组均可诱生乙肝病毒特异性抗体反应，反应动 力学与上述γB免疫小鼠一致；2)γHB诱生的乙肝病毒特异性抗体应 答水平显著高于γB免疫小鼠，在蛋白免疫水平上证实表达于抗体分 子CDR2中优势抗原表位可增强同一抗体分子CDR3中的弱势B细胞表 位诱生的抗体应答，具有弱势表位优势化的作用。
以γBDNA直接免疫6-8周龄BALB/c雌性小鼠，结果诱导出一定 水平的特异性抗体应答，而以γHB DNA则在BALB/c和C57BL/6小鼠 体内均能诱导出比单独应用γB更强的特异性抗体应答。值得一提的 是，单以γB免疫BALB/c小鼠诱导的抗体反应较弱，而加入TH抗原 表位后，其特异性抗体反应增强的幅度较大，超过对单一B细胞表 位有较高反应的C57BL/6小鼠的平均应答水平，表明优势表位TT830-844可在不同MHC个体间增强弱势表位B细胞原表位的免疫原性， 诱生更强的抗体应答。研究还证实这一新系统工作的机制是优势表 位可广泛活化Th细胞。这些研究结果从基因免疫水平证实和确立 了弱势表位优势化新系统。
以γC DNA免疫小鼠，结果显示γC可诱生乙肝病毒特异性CTL应 答，而γCHB DNA免疫小鼠后诱生的乙肝病毒特异性CTL应答显著强 于单一表位γC，从细胞免疫学水平上再次确立了弱势表位优势化的 新系统。 一、本发明弱势表位优势化的新系统有以下特点： 1.是以抗体为骨架、以CDR为克隆位点、含多种目的表位的新分子。 2.该新分子的不同表位可相互作用。 3.该相互作用表现为优势表位对弱势表位的增强作用，使弱势表位 优势化。 4.弱势表位优势化的结果使机体产生对弱势表位增强的特异性免疫 应答。 5.该新系统不仅可用于免疫耐受中弱势表位的优势化，而且普遍适 用于所有弱势抗原如肿瘤抗原等的优势化及相应的疫苗应用。 二、本发明新的多功能乙肝治疗性疫苗具备以下特点： 1.是一经上述弱势表位优势化新系统改造后构建的新型疫苗。 2.该疫苗含有三种不同的抗原表位，具有不同的抗原特性。 3.上述三种不同抗原表位的克隆位点是抗体重链的CDR区。 4.克隆于CDR2中的优势表位可增强克隆于CDR3和CDR1中的弱势 B表位、CTL表位诱生的特异性体液免疫应答和细胞免疫应答。 5.该疫苗可同时诱生乙肝特异性抗体应答和CTL应答。 6.上述应答之效应分子或细胞可与乙肝病毒抗原特异性反应。 7.该多功能乙肝疫苗可用于乙型肝炎的治疗。
附图说明： 图1 γ系列质粒的构建及表位插入情况 图2 γB、γHB、γC、γCH、γCHB的DNA序列测定 图3转染细胞上清液中人源化抗体的检测 图4弱势表位优势化系统中抗原表位的检测 图5免疫小鼠血清中转基因产物的检测 图6 γB及γHB免疫小鼠血清中抗乙肝病毒特异性抗体的检测
a.BALB/c小鼠 b.C57BL/6小鼠 图7 γHB基因免疫小鼠血清中抗乙肝病毒特异性抗体 图8 γHB免疫小鼠诱生的淋巴细胞特异性增殖
a.BALB/c b.C57BL/6 图9 γCHB基因免疫小鼠诱生的CTL应答