《用于治疗表达EGFR和N‑羟乙酰GM3神经节苷脂NEUGCGM3的肿瘤的药物组合物.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《用于治疗表达EGFR和N‑羟乙酰GM3神经节苷脂NEUGCGM3的肿瘤的药物组合物.pdf（13页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201280062315.8 (22)申请日 2012.12.04 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 103998098 A (43)申请公布日 2014.08.20 (30)优先权数据 CU/P/2011/0245 2011.12.27 CU (85)PCT国际申请进入国家阶段日 2014.06.17 (86)PCT国际申请的申请数据 PCT/CU2012/000007 2012.12.04 (87)PCT国际申请的公布数据 WO2013/097834 ES 20。
2、13.07.04 (73)专利权人 分子免疫中心 地址 古巴哈瓦那 (72)发明人 A冈萨雷斯帕罗莫 A卡尔佩勒兹 K莱昂蒙松 R布兰克桑塔纳 MDC巴鲁索阿尔瓦雷兹 AE马思亚斯阿布拉哈姆 JE蒙特罗卡西米洛 (74)专利代理机构 中国国际贸易促进委员会专 利商标事务所 11038 代理人 傅宇昌 (51)Int.Cl. A61K 39/395(2006.01) A61K 39/00(2006.01) C07K 16/28(2006.01) C07K 16/42(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (56)对比文件 CN 1103404 A,1995.06.07, CN。
3、 1507452 A,2004.06.23, 审查员 江涵 (54)发明名称 用于治疗表达EGFR和N-羟乙酰GM3神经节苷 脂(NeuGcGM3)的肿瘤的药物组合物 (57)摘要 本发明涉及用于治疗恶性肿瘤， 特别是表达 EGFR和N-羟乙酰GM3神经节苷脂这些靶的那些肿 瘤的药物组合物， 目的是增强针对所述靶的疗法 单独所产生的治疗效果。 本发明的药物组合物包 含针对所述靶中的每一种的抗体和/或疫苗。 另 外， 本发明涉及用于应用本发明的组合物的方 法。 权利要求书1页 说明书9页 附图2页 CN 103998098 B 2017.08.04 CN 103998098 B 1.用于治疗共表。
4、达EGFR和NeuGcGM3神经节苷脂这些靶的肿瘤的药物组合物， 其包含： (a)尼妥珠单抗， 和 (b)针对NeuGcGM3神经节苷脂的疫苗， 所述疫苗选自具有NeuGcGM3/VSSP作为活性成分 的疫苗和具有佐以氧化铝的雷妥莫单抗的抗独特型疫苗。 2.权利要求1的药物组合物， 其中所述肿瘤选自肺肿瘤、 乳腺肿瘤、 消化器官肿瘤、 泌尿 生殖系统肿瘤、 肉瘤、 源自神经外胚层组织的肿瘤和淋巴组织增生病症。 3.权利要求1的药物组合物， 其中尼妥珠单抗的剂量在100mg至400mg的范围内。 4.权利要求1的药物组合物， 其中所述具有NeuGcGM3/VSSP作为活性成分的疫苗的剂量 在0.。
5、1mg至2mg的范围内。 5.权利要求1的药物组合物， 其中所述抗独特型疫苗的剂量在0.1mg至2mg的范围内。 6.权利要求1至5中任一项的药物组合物， 其与常规的放射疗法相组合。 7.权利要求1至5中任一项的药物组合物， 其与常规的化学疗法相组合。 8.权利要求1至5中任一项的药物组合物， 其与常规的放射疗法和化学疗法相组合。 9.用于共表达EGFR和NeuGcGM3神经节苷脂这些靶的肿瘤的疗法的试剂盒， 其中所述试 剂盒包含下列组分的同时的、 分阶段的或交替的施用： (a)尼妥珠单抗， 和 (b)针对NeuGcGM3神经节苷脂的疫苗， 所述疫苗选自具有NeuGcGM3/VSSP作为活性成。
6、分 的疫苗和具有佐以氧化铝的雷妥莫单抗的抗独特型疫苗。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 103998098 B 2 用于治疗表达EGFR和N-羟乙酰GM3神经节苷脂(NeuGcGM3)的 肿瘤的药物组合物 技术领域 0001 本发明涉及人类医学领域， 特别是涉及过表达EGFR和N-羟乙酰GM3神经节苷脂 (NeuGcGM3)的肿瘤的治疗。 现有技术 0002 表皮生长因子受体(EGFR)是在目前的临床评价中最常使用的分子靶之一。 该分子 在各种各样的人上皮组织中过表达(Yarden,Y.和Sliwkowski M.X.,Nat.Rev.Mol.Cell Biol.2001,2:127。
7、-137)。 在用于抑制EGF受体功能的疗法中两种治疗最常被使用： 通过单克 隆抗体(MAb)进行的中和以及抑制酪氨酸激酶活性的小分子(TKI， 酪氨酸激酶抑制剂) (Ciardiello,F.和Tortora G.,N.Engl.J.Med.2008,358:1160-1174)。 虽然还已证明使用 VSSP作为佐剂的具有EGFR的细胞外结构域的疫苗在路易斯肺癌的鼠类模型中产生抗转移 效应(Snchez Ramrez B.等人,Int.J.Cancer.2006,119:2190-2199)。 用抗-EGFR的单克 隆抗体进行的治疗导致了通过中断致癌信号而引起的肿瘤消退和由Fc受体介导的先天。
8、免 疫应答机制的诱导(Martinelli,E.等人,Clin.Exp.Immunol.2009,158:1-9)。 0003 已经产生了数种针对人EGFR的单克隆抗体， 其中包括西妥昔单抗(Garrett CR和 Eng C .,Expert Opin Biol Ther .2011 ,11:7 ,937-49)和尼妥珠单抗(Mateo C , Immunotechnology1997,3:71-81)。 在过表达EGFR的各种不同肿瘤的疗法中， 已经描述了尼 妥珠单抗的抗肿瘤效应(Crombet T等人,Cancer Biol Therapy.2006,5:375-379)， 或者与 其他。
9、治疗相联合(Crombet T等人,J Clin Oncol.2004,22:1646-1654； Zhao KL等人, Invest New Drugs.2011年9月8日在线预先发表)。 另一方面， 针对鼠类EGFR而产生的单克 隆抗体7A7在路易斯肺癌的治疗中显示出通过T细胞介导的抗肿瘤效应(Garrido G.等人, Cancer Immunol Immunother.2007,56:1701-1710)。 0004 另一个最多地被研究的靶是神经节苷脂， 其是在其结构中包含唾液酸的鞘糖脂。 这些分子存在于正常组织中并且在肿瘤组织中过表达(Zhang S等人,Int J Cancer73。
10、:42- 49,1997)。 存在两种形式的唾液酸： N-乙酰化的和N-羟乙酰化的， 后者已在人肿瘤中作了描 述(Malykh Y N.等人,Biochimie.2001,83:7623-634)， 以神经节苷脂的形式(Kawai T.等 人,1991Cancer.Res.(51)1242-1246)和以N-羟乙酰化的糖蛋白的形式(Devine P.L.等人, Cancer Research,1991,51:21,5826-5836)。 由于这个原因， 已经在大量的恶性肿瘤中鉴定 出这些分子， 从而使其成为用于癌症疗法的有吸引力的靶。 特别地， NeuGcGM3神经节苷脂特 异地被单克隆抗体1。
11、4F7所识别(Carr A.等人,Hybridoma,2000,19:3,241-247)。 已经通过 数 种方法 在各 种不同的 肿瘤中 鉴定出该 神经节苷脂 (Bla nco R .等人 ,ISRN Pathology.2011,Article ID953803,10pag.； Marquina等人,Cancer Research.1996,56: 22,5165-5171)。 0005 已经发表了针对肿瘤中的NeuGcGM3的主动免疫疗法， 其中使用分子疫苗 NeuGcGM3/VSSP(Estevez F.等人,Vaccine.1999,18:190-197)， 该分子疫苗已经在具有晚 。
12、说 明 书 1/9 页 3 CN 103998098 B 3 期乳腺癌的患者中显示出其免疫原性能力和其安全性(Carr A.等人,JCO.2003,21:1015- 1021)。 另一方面， 已经在临床前阶段中证明， 其强有力的抗肿瘤(抗转移)效应由NK和CD8+ 细胞的细胞应答机制来介导(Labrada M.等人,Expert Opin.Biol.Ther.2010,10:2,153- 162)。 同时， 通过用抗独特型疫苗(抗独特型单克隆抗体1E10或雷妥莫单抗(Racotumumab)， 其模拟N-羟乙酰化的神经节苷脂)进行免疫接种， 在具有非小细胞肺癌的患者中产生了抗 肿瘤效应(Alf。
13、onso S.等人,Cancer Biology&Therapy.2007,6:12,1847-1852)。 用该疫苗 发表的结果证明了其免疫原性和安全性(Alfonso M.等人,Journal of Immunology.2002, 168:2523-2529)。 0006 在膜的微结构域中的EGFR在肿瘤细胞生长的控制中发挥着非常重要的作用。 已经 证明， 在体内和在体外， GM3神经节苷脂在各种各样的细胞系中抑制依赖于EGFR的增殖。 GM3 抑制EGFR的激酶活性(EGFR的自磷酸化)。 GM3神经节苷脂抑制EGFR的激酶结构域的自磷酸 化。 GM3显示出这样的潜在能力， 即变构地调。
14、节在通过EGFR二聚体进行信号传导时无活性形 式的结构转变， 以阻止在配体结合时细胞内激酶结构域的自磷酸化(Coskun.等人, PNAS.2011,108:22,9044-9048)。 在膜中神经节苷脂的组成的变化在EGFR的信号转导的调 节中是重要的(Zurita AR.等人,Biochem.J.2001,35:465-472)。 0007 在抗肿瘤疗法的同时或交替应用的医学实践中期望具有前景的结果(Takeda K. 等人,Cancer Sci.,2007,98:9,1297-1302)。 但是， 并非所有的抗肿瘤疗法应用规划方案在 实践中都给出了积极和协同的结果。 在其中使用抗-EGF。
15、R的单克隆抗体(西妥昔单抗)和抗 血管内皮生长因子的单克隆抗体(贝伐珠单抗)连同强有力的化学疗法用药方案一起的III 期的转移性结肠直肠癌临床试验中， 癌症的发展恶化， 这还引起相比于仅接受 “贝伐珠单抗 +化学疗法” 的患者而言更严重的不良事件(Tol J.等人,N Engl J Med.2009,360:6,563- 72)。 在患者中应用数种疗法的成功是在对于所述疗法所选择的靶之间的特殊功能关系、 肿 瘤位置以及在每种情况下所应用的疗法的性质(抗体、 疫苗等)的结果。 0008 现今， 在文献中存在关于在肿瘤细胞中神经节苷脂与EGFR之间的功能和结构关系 的证据。 然而， 在同一个患者中。
16、应用针对EGFR和神经节苷脂这些靶的疗法的成功之中实际 牵涉这种关系既未在临床阶段中， 也未在临床前阶段中谈及。 本发明的新颖性在于， 首次在 临床前和在临床上证明了在共表达EGFR和NeuGcGM3这些靶的肿瘤中源自应用抗-EGFR的疗 法和抗-NeuGcGM3的疫苗的抗肿瘤活性的协同增强。 0009 发明描述 0010 本发明涉及用于癌症的药物组合物， 其特别地针对EGFR和N-羟乙酰GM3神经节苷 脂这些靶， 目的是增强针对所述靶的疗法单独所产生的治疗效果。 在一个实施方案中， 本发 明包括其靶为N-羟乙酰GM3的疫苗和针对EGFR的抗体。 在另一个实施方案中， 本发明包括其 靶为N-羟。
17、乙酰GM3的疫苗和其靶为EGFR的疫苗。 0011 在本发明的另外的实施方案中， 所述针对神经节苷脂该靶的疫苗包括诸如下列的 疫苗： 疫苗NeuGcGM3/VSSP和/或抗独特型疫苗(佐以氧化铝的雷妥莫单抗)。 在另一个实施 方案中， 本发明包括抗-EGFR的疗法例如尼妥珠单抗和/或针对EGFR的疫苗。 0012 在另一个实施方案中， 本发明包括用于在癌症的治疗中使用的组合物， 其包含针 对EGF受体的化合物和针对NeuGcGM3神经节苷脂的化合物。 0013 在另一个方面， 本发明提供了药物组合物， 其包含与药学上可接受的赋形剂相混 说 明 书 2/9 页 4 CN 103998098 B 。
18、4 合的上面所描述的化合物中的任一种。 0014 本发明的化合物可用作药物， 并且可用于制备药物， 包括用于治疗诸如癌症之类 的疾患的药物。 0015 在另一个实施方案中， 本发明的治疗组合物可用于治疗癌症， 特别是具有不同位 置的人肿瘤。 优选地， 将本发明的治疗组合物用于治疗其中同时表达EGFR和神经节苷脂的 N-羟乙酰化变体的那些肿瘤。 最优选地， 用于治疗肺肿瘤、 乳腺肿瘤、 消化器官肿瘤、 泌尿生 殖系统肿瘤、 肉瘤、 源自神经外胚层组织的肿瘤和淋巴组织增生病症。 0016 可以制备上面所描述的化合物的任何合适的制剂， 以用于通过本领域已知的方法 来进行施用。 基于所希望的施用途径和。
19、所施用的化合物的物理特性， 可以无需过度实验地 实现有用的赋形剂或载体的选择。 0017 根据由治疗患者的医生所决定的， 可以使用任何合适的施用途径， 包括但不局限 于： 肠胃外、 静脉内、 肌内、 透皮、 局部和皮下。 适合于每种施用途径的制剂的制备是本领域 已知的。 0018 每种物质的制剂常常包含稀释剂， 以及在一些情况下， 佐剂、 缓冲液、 防腐剂等。 这 些化合物还可以以脂质体或微乳状液的组合物进行施用。 0019 为了注射， 所述制剂可以以常规形式来进行制备， 例如： 液体溶液或悬浮液， 或者 适合于在注射前溶解或悬浮在液体中的固体形式。 合适的赋形剂包括例如： 水、 盐水溶液、 。
20、右旋糖等。 0020 可以单独地或与其他治疗试剂相组合地使用本发明的化合物。 在特别的实施方案 中， 本发明涉及与用于所治疗的肿瘤类型的常规化学疗法和/或放射疗法的组合。 0021 在另一个实施方案中， 本发明还涉及在癌症的治疗中同时地、 分阶段地或交替地 应用针对EGFR和N-羟乙酰GM3神经节苷脂这些靶的疗法。 0022 分开地， 包括在不同的时刻和以不同的频率， 施用针对EGFR的化合物和针对N-羟 乙酰GM3神经节苷脂该靶的化合物。 这两种化合物都可以通过已知的任何途径来进行施用， 例如通过皮下、 静脉内、 真皮内、 肌内或腹膜内等途径。 在许多实施方案中， 至少一种， 和任 选地所述。
21、两种治疗试剂可以通过肠胃外途径进行施用。 0023 当将本发明的化合物或组合物与其他抗癌试剂相组合地进行使用时， 本发明提供 了例如同时的、 分阶段的或交替的治疗。 因此， 本发明的化合物可以以分开的药物组合物同 时地进行施用， 并且其中本发明的化合物可以在其他抗癌试剂之前或之后施用， 例如以数 秒钟、 数分钟、 数小时、 数天或数周的差异。 0024 本发明提供了用于控制和/或抑制肿瘤增殖的方法， 其包括以对于控制或减少肿 瘤增殖来说有效的量向有此需要的受试者施用在本文中所描述的化合物的组合。 在某些实 施方案中， 肿瘤增殖疾患与处于不同临床阶段的肿瘤相关联， 只要所述肿瘤共表达EGFR和 。
22、N-羟乙酰GM3。 在一个特别的实施方案中， 本发明涉及肺肿瘤、 乳腺肿瘤、 消化器官肿瘤、 泌 尿生殖系统肿瘤、 肉瘤、 源自神经外胚层组织的肿瘤和淋巴组织增生病症。 0025 本发明还包括用于在需要所述治疗的受试者中治疗癌症的方法， 其包括： 向所述 受试者施用治疗有效量的对于治疗所述紊乱来说有用的针对EGFR的化合物， 和以对于改善 所希望的效果来说有效的量向所述受试者施用NeuGcGM3疫苗或抗独特型疫苗。 根据本发明 的改善涉及所述疾病的临床症状的部分或全部消退或者稳定化。 在本发明的另一个实施方 说 明 书 3/9 页 5 CN 103998098 B 5 案中， 改善涉及减小肿瘤。
23、的大小和/或引起受试者的存活率增加。 0026 在某个实施方案中， 本发明包括这样的方法， 其包括第一的诱导阶段和第二的维 持阶段。 在一个特别的实施方案中， 诱导阶段包括以在大约0.1至大约2mg的范围内的剂量 向患者施用抗-EGFR的疫苗， 以可以在大约7天至大约14天的范围内的时间段， 在大约8至14 周期间。 在该时间段期间， 以大约7至14天的间隔， 以在大约0.1至大约2mg的范围内的剂量 向患者施用包含NeuGcGM3疫苗或抗独特型疫苗的抗-NeuGcGM3神经节苷脂的疗法。 0027 本发明包括这样的方法， 其包括在大约6至10周的时间间隔期间以在大约100至大 约400mg的。
24、范围内的剂量向患者施用使用抗-EGFR的被动疗法。 在另一个实施方案中， 针对 EGFR的疗法包括以大约7至14天的时间间隔， 以在大约0.1至大约2mg的范围内的剂量施用 针对EGFR的疫苗。 在该时间段期间， 患者另外还以在大约0.1至大约2mg的范围内的剂量接 受NeuGcGM3疫苗或抗独特型疫苗， 以大约7至14天的时间间隔。 0028 在另一个实施方案中， 本发明的治疗方法的第二阶段包括这样的治疗规划方案， 其被设计用于其作为维持疗法进行施用， 而不出现毒性和/或疾病的临床症状。 在维持阶段 中， 优选地以上面所描述的剂量和以大约1至3个月的时间间隔施用所述疫苗。 在另一个实 施方案。
25、中， 以大约14天至大约3个月的间隔施用所述被动疗法。 可以在大约1至大约5年的范 围内的时间段期间施行所述治疗规划方案。 0029 在一些实施方案中， 基本上同时地施用针对EGFR的治疗试剂和NeuGcGM3疫苗或抗 独特型疫苗。 有时将针对EGFR的治疗试剂和NeuGcGM3疫苗或抗独特型疫苗同时地用在受试 者上。 在一些实施方案中， 可以通过皮下、 静脉内、 真皮内、 肌内或腹膜内途径来施用抗- NeuGcGM3神经节苷脂的疗法， 而通过皮下、 静脉内或肌内途径来施用抗-EGFR的疗法。 在其 他实施方案中， 施用位点由输入淋巴结的存在来确定。 0030 在另一个实施方案中， 在应用所述。
26、疗法期间， 记录患者的某些生物化学和成像学 参数。 优选地， 通过使用患者的血液来分析细胞和体液免疫。 血液的抽取以可以从每周至每 六个月的频率来进行。 0031 如在本发明中所使用的，“共表达” 是指， 这两个靶均被表达， 但可以具有或不具有 结构邻近关系； 对于该定义的操作标准是， 借助于双重染色法、 荧光显微镜的使用和允许图 像叠加的处理机来测定EGFR和N-羟乙酰神经节苷脂(NeuGcGM3)的表达。 0032 如在本发明中所使用的，“共定位” 是指， 这两个靶在结构上邻近； 对于该定义的操 作标准是， 借助于双重染色法和共聚焦显微镜的使用来测定EGFR和N-羟乙酰神经节苷脂 (Neu。
27、GcGM3)的表达。 0033 在另外一个实施方案中， 本发明包括针对EGF受体的化合物和针对NeuGcGM3神经 节苷脂的化合物在制备用于按照治疗方案延缓患者中肿瘤生长的药物中的用途， 所述治疗 方案包括： 0034 (a)首先， 向所述患者施用包含针对EGF受体的化合物的药物， 和 0035 (b)随后， 向同一个患者施用包含针对NeuGcGM3神经节苷脂的化合物的药物。 0036 所述施用可以以该顺序， 或者以相反的顺序， 其中首先向所述患者施用包含针对 NeuGcGM3神经节苷脂的化合物的药物， 和随后向同一个患者施用包含针对EGF受体的化合 物的药物。 0037 在一个特别的实施方案。
28、中， 本发明包括用于共表达EGFR和NeuGcGM3神经节苷脂这 说 明 书 4/9 页 6 CN 103998098 B 6 些靶的肿瘤的疗法的试剂盒， 其中所述试剂盒包含针对EGFR的化合物和针对NeuGcGM3神经 节苷脂的其他化合物的同时的、 分阶段的或交替的施用。 0038 在具有不同位置的人肿瘤中EGFR和N-羟乙酰神经节苷脂(NeuGcGM3)的共表达的 测定 0039 在肿瘤中EGFR和NeuGcGM3这些治疗靶的表达的测量可以通过使用本领域中为此 类目的而描述的方法中的任一种来进行。 所述测量在具有不同位置和起源的肿瘤中， 在先 前在福尔马林中固定的肿瘤样品上或者在新鲜的组织。
29、切片上进行。 在一个优选的实施方案 中， 通过使用用于识别EGFR和GM3的N-羟乙酰化变体的免疫技术来进行检测。 特别地， 可以 使用免疫组织化学和明视场显微术来分开地免疫识别这两种分子， 或者使用免疫荧光和荧 光显微术来测定共表达， 或者使用免疫荧光和共聚焦显微术来测定共定位。 0040 在本发明的优选的实施方案中， 可以通过使用在专利EP 0586002B1中所描述的单 克隆抗体ior egf/R3m(5-20 g/ml)来检测EGFR， 和通过使用在专利EP 0972782B1或US 6, 429,295中所描述的单克隆抗体14F7m(5-25 g/ml)来检测NeuGcGM3。 在本。
30、发明的一个实施 方案中， 对于分开地免疫识别这两种分子(简单染色)， 可以使用Dako,LSABR System, Peroxidase,DAB(Dako,Carpinteria,California,USA)作为检测系统。 0041 考虑到EGFR位于肿瘤细胞的细胞质膜上而N-羟乙酰GM3位于膜中和细胞质内， 因 而当反应的强度等于或大于20的阳性时， 将可认为该免疫识别是阳性的。 0042 在一个优选的实施方案中， 这两种分子的共表达可以通过使用双重染色技术来进 行检测并且可以用荧光显微术来进行分析， 仅在其中先前对于这两种分子的分开的免疫识 别的结果为阳性的那些肿瘤样品中。 而这两种分子。
31、的共定位可以通过使用双重染色技术来 进行检测并且用共聚焦荧光显微术来进行分析。 在一个优选的实施方案中， EGFR的免疫识 别通过下述方式来进行： 与单克隆抗体ior egf/R3m(5-20 g/ml)温育1小时， 随后与缀合至 罗丹明的IgG抗体(Dako,Carpinteria,California,USA)进行温育。 在另一个优选的实施方 案中， NeuGcGM3的免疫检测通过下述方式来进行： 使用经生物素化的单克隆抗体14F7(5-20 g/ml)， 30分钟， 随后为缀合至FITC的链霉抗生物素蛋白(Dako,Carpinteria,California, USA)。 0043 下。
32、面的实施例显示了本发明的优选的实施方案， 并且因此用于举例说明本发明， 但无论如何不应当被认为是一种限制。 0044 附图简述 0045 图1.在不同的鼠类肿瘤中， 将EGFR与NeuGcGM3神经节苷脂共定位。 在由路易斯表 皮样癌诱导的肺转移中(A-C)和在鼠类骨髓瘤P3-X63-Ag.8653中(D-F)EGFR和NeuGcGM3神 经节苷脂的共定位(C和F)。 0046 图2.抗-EGFR的疗法(7A7Mab)与抗-NeuGcGM3神经节苷脂的疫苗(NeuGcGM3/VSSP) 一起的应用协同地增加了携带路易斯肺癌的C57BL/6小鼠的存活率。 0047 图3.在具有非小细胞肺癌的患者。
33、中， 对于针对EGFR的被动疗法(尼妥珠单抗)和 抗-NeuGcGM3神经节苷脂的疫苗(雷妥莫单抗/氧化铝)的客观应答。 0048 图4.在具有腹膜后-胰周的血管外皮细胞瘤的患者中， 对于抗-EGFR的疗法(尼妥 珠单抗)和抗-NeuGcGM3神经节苷脂的疫苗(NeuGcGM3/VSSP)的令人惊讶的临床应答。 说 明 书 5/9 页 7 CN 103998098 B 7 实施例 0049 实施例1： 在不同的人肿瘤中EGFR和NeuGcGM3神经节苷脂的共表达的测量 0050 将肿瘤样品在经缓冲的中性的福尔马林中进行固定， 并通过石蜡包埋技术进行处 理， 这是本领域技术人员已知的。 将所获得。
34、的厚度为5微米的组织切片在60下保持30分 钟， 脱石蜡， 并且在一系列的逐渐下降的酒精中进行再水化， 在蒸馏水中保持10分钟并用 TBS洗涤5分钟。 用商业溶液(Dako,Carpinteria,California,USA)将组织总蛋白质的反应 性封闭30分钟。 通过使用单克隆抗体ior egf/R3m(20 g/ml)1小时来免疫检测EGFR。 NeuGcGM3的免疫识别通过使用单克隆抗体14F7(20 g/ml)30分钟来进行。 在一抗的反应后， 在两种情况下， 均使用检测系统Dako,LSABR System,Peroxidase,DAB(Dako,Carpinteria, Cali。
35、fornia,USA)。 使组织切片脱水， 并且使用采用迈尔氏苏木精(Dako,Carpinteria, California,USA)的对比染色。 通过用洗涤溶液TBS(1X)代替一抗(单克隆抗体ior egf/R3m 或单克隆抗体14F7)来获得阴性对照， 和使用输乳管癌作为阳性对照。 0051 EGFR的免疫识别位于肿瘤细胞的细胞质膜上， 和在细胞质内和/或在细胞的细胞 质膜中检测到NeuGcGM3神经节苷脂。 0052 双重染色法。 检测EGFR， 用单克隆抗体ior egf/R3m(抗-EGFR)， 接着与缀合有FITC 的链霉抗生物素蛋白(Dako ,Carpinteria ,Ca。
36、lifornia ,USA)一起进行温育。 而检测 NeuGcGM3， 用经生物素化的单克隆抗体14F7(抗-NeuGcGM3)， 和随后用缀合有罗丹明的抗- 鼠类IgG抗体(Dako,Carpinteria,California,USA)。 在肿瘤细胞中这两种分子的共表达用 在图像中的黄颜色来进行鉴定。 组织切片借助于与Olympus BX51荧光显微镜(Olympus, Japan)相连接的照相机来进行分析和数字化。 对于经数字化的图像的分析， 使用图像处理 机ImageJ1.43u版。 0053 表1显示了其中共表达EGFR和NeuGcGM3神经节苷脂的具有不同位置的肿瘤。 0054 强。
37、度： -阴性， +弱， +中等， +强。 说 明 书 6/9 页 8 CN 103998098 B 8 0055 0056 实施例2： 在鼠类肿瘤模型中EGFR和NeuGcGM3神经节苷脂的共表达和共定位的测 量 0057 所使用的鼠类肿瘤模型为路易斯肺癌(3LL-D122)和骨髓瘤P3-X63-Ag8.653 (X63)。 0058 为了测定共表达/共定位， 进行双重染色。 EGFR的免疫识别通过下述方式来进行： 与经生物素化的单克隆抗体7A7(20 g/ml)一起温育1小时， 随后与缀合至FITC的链霉抗生 物素蛋白(Dako,Carpinteria,California,USA)一起进行。
38、温育。 NeuGcGM3的免疫染色通过 下述方式来进行测定： 与单克隆抗体14F7(20 g/ml)一起温育30分钟， 随后与缀合至罗丹明 的抗-鼠类IgG抗体(Dako,Carpinteria,California,USA)一起进行温育。 通过用洗涤溶液 TBS(1X)代替一抗(单克隆抗体7A7或单克隆抗体14F7)来获得阴性对照。 共表达通过使用 Olympus BX51荧光显微镜(Olympus,Japan)来进行测定， 并且对于经数字化的图像的分析， 使用图像处理机ImageJ1.43u版。 共定位通过Flouview FV500共聚焦激光显微镜(Olympus, Japan)来进行测。
39、定。 0059 图1显示了在各种不同的鼠类模型的肿瘤样品中EGFR和NeuGcGM3的共定位。 用经 生物素化的单克隆抗体7A7， 随后用连接至FITC的链霉抗生物素蛋白来鉴定EGFR。 通过颜色 的叠加， 黄颜色鉴定出了在鼠类模型的肿瘤细胞中这两种分子的共定位(C和F)。 0060 实施例3： 用疫苗NeuGcGM3/VSSP和单克隆抗体7A7进行治疗的携带路易斯肺癌的 C57BL/6小鼠的存活率的测量 说 明 书 7/9 页 9 CN 103998098 B 9 0061 自发转移模型。 在右足垫中给动物接种在0.05ml的体积中的2105个路易斯表皮 样癌(3LL-D122)细胞， 这相。
40、应于该实验方案的第0天。 在该实验的第3天， 将动物随机分成4 个实验组， 每组10只动物。 在第24天， 当肿瘤达到8-9mm的体积时， 进行该原发性肿瘤的外科 手术。 从第48天起， 开始对动物的临床状态进行观察。 存活率的数据通过使用Log-rank检验 (p0.05)来进行分析， 并且显示在卡-迈曲线图中。 结果包括3个有着相同条件的实验。 0062 实验组： 0063 没有治疗的对照(T)； 0064 抗-EGFR的被动疗法： 单克隆抗体7A7， 通过静脉内途径， 以在200 l盐水溶液中的 56 g的剂量， 在第3、 5、 7、 9、 31、 33和35天； 0065 抗-NeuG。
41、cGM3的主动疗法： 疫苗NeuGcGM3/VSSP， 通过皮下途径， 以在200 l中的200 g的剂量， 在第7、 21、 35和47天； 0066 按照对于第2和3组所描述的， 抗-EGFR和抗-NeuGcGM3的疗法的同时施用。 0067 在图2a中显示了， 在用路易斯肺癌诱导的肺转移的模型中， 抗-EGFR和抗- NeuGcGM3的疗法的同时施行(第4组)使动物的存活率相比于其余实验组而言增加了60。 在实验结束后一周， 处死存活的动物(仅在第4组中)并取出肺。 目视分析表明， 仅一只动物 显示出两个肺转移， 此外注意到其余动物的肺是正常的(图2b)。 该结果证明了在其中共定 位EG。
42、FR和NeuGcGM3的该鼠类肿瘤模型中， 所研究的抗-EGFR和抗-NeuGcGM3的疗法的抗肿瘤 活性的强大的协同作用(参见实施例2)。 0068 实施例4： 经历了用抗体尼妥珠单抗和疫苗雷妥莫单抗/氧化铝进行的疗法的癌症 患者的存活率的测量 0069 考虑到在人肺肿瘤样品中EGFR和NeuGcGM3神经节苷脂这些治疗靶的经常的共定 位/共表达这样的发现(实施例1)， 和在实施例3中所显示的临床前证据， 我们着手研究了在 具有肺癌的患者中用抗-EGFR的疗法(抗体尼妥珠单抗)和抗神经节苷脂的疗法(抗独特型 疫苗， 雷妥莫单抗/氧化铝)进行的同时治疗， 所述具有肺癌的患者已经接受了关于每个肿。
43、 瘤位置的标准疗法并且此外还已经遇到了疾病的进展。 0070 表2显示了在疫苗雷妥莫单抗(1E10/氧化铝)或其与尼妥珠单抗的组合的扩大的 (同情的)使用计划中的试验结果。 在其中观察了具有处于晚期阶段的(复发的和/或转移 的)非小细胞肺癌(NSCLC)的患者的存活率。 要强调的是， 患者为这样的患者， 其已经接受了 所有的经建立的标准治疗路线， 仅对于非癌特异性的姑息疗法易感， 并且在包括在该试验 中的时刻遇到了疾病的进展。 在同时接受针对所述两个靶的疗法的患者组中， 观察到在治 疗两年时的总体存活率的显著的增加， 相比于仅接受单一疗法的那些而言。 0071 表2.在治疗两年时， 通过应用抗。
44、-EGFR的疗法(抗体尼妥珠单抗)和抗神经节苷脂 的疗法(抗独特型疫苗， 雷妥莫单抗/氧化铝)增加了具有非小细胞肺癌的患者的存活率。 说 明 书 8/9 页 10 CN 103998098 B 10 0072 0073 图3显示了在具有NSCLC的患者中对于针对EGFR的被动疗法(尼妥珠单抗)和抗- NeuGcGM3神经节苷脂的疫苗(雷妥莫单抗/氧化铝)的客观应答， 所述具有NSCLC的患者， 如 前面所提及的， 已经接受了所有的经建立的标准治疗路线， 仅对于非癌特异性的姑息疗法 易感， 并且在包括在该试验中的时刻遇到了疾病的进展。 图3A显示了在诊断时刻肿瘤的位 置和扩展范围。 在图3B中，。
45、 指出了在应用治疗两年时计算机辅助轴向体层摄影术(CAT)的结 果， 其中仅可以用与肺气肿大泡相关的透明度增加的面积来评价成纤维细胞应答的面积， 并且未观察到肺肿瘤损伤。 相同的放射学图像保持相等， 直至3年后。 该结果显示了非常晚 期的肿瘤的令人惊讶的完全缓解， 作为该疗法的结果。 0074 实施例5： 在经历了用抗体尼妥珠单抗和疫苗NeuGcGM3/VSSP进行的治疗的具有腹 膜后-胰周的血管外皮细胞瘤的患者中的临床应答的测量 0075 图4显示了对于放射疗法和化学疗法无应答的具有腹膜后-胰周的血管外皮细胞 瘤(软组织肿瘤)的患者的腹部的连续计算机辅助体层摄影术。 在这之中， 在最初的诊断。
46、后 18个月， 应用抗-EGFR的疗法(尼妥珠单抗)和抗神经节苷脂的疗法(疫苗NeuGcGM3/VSSP)。 患者具有在脐周区域中的强烈的疼痛和跳动的肿瘤块， 以及超过15公斤的体重丧失。 图4A 和4B相应于所述疗法开始的时刻； 图4C和4D相应于在三年后的评价。 在应用治疗后三年， 观 察到疾病的稳定化， 因为在两个图像中， 肿瘤块保持相同的大小。 另外， 在72个月的评价中， 患者保持着并入其工作寿命的优异的生活质量， 具有肿瘤块减小的倾向。 总之， 观察到作为 对于所应用的治疗的应答的令人惊讶的临床益处。 0076 用在本发明中所描述的抗-EGFR和抗神经节苷脂的免疫疗法进行治疗的癌症患者 在长的治疗时间段期间显示出优异的耐受性(没有重大的毒性)。 该疗法有利于疾病的稳定 化， 提高生活质量， 增加无进展的时间和因此提高患者的总体存活率。 所描述的疗法具有比 传统地在用抗-EGFR或抗神经节苷脂的单一疗法进行治疗的患者中所观察的效果更好的效 果。 说 明 书 9/9 页 11 CN 103998098 B 11 图1 图2 说 明 书 附 图 1/2 页 12 CN 103998098 B 12 图3 图4 说 明 书 附 图 2/2 页 13 CN 103998098 B 13 。