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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201410817576.7 (22)申请日 2014.12.17 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 104491854 A (43)申请公布日 2015.04.08 (73)专利权人 浙江卫信生物药业有限公司 地址 315600 浙江省宁波市宁海县科技工 业园区竹泉路29号浙江卫信生物药业 有限公司 (72)发明人 朱康华 王磊 刘海昌 焦泽武 杨乾敏 王德学 杨廷潺 朱梦丹 (51)Int.Cl. A61K 39/102(2006.01) A61K 9/19(2。
2、006.01) A61P 31/04(2006.01) F26B 5/06(2006.01) (56)对比文件 CN 102600086 A,2012.07.25,权利要求1， 说明书实施例1-3. Maila J Matjila et alSafety and immunogenicity of two Haemophilus influenzae type b conjugate vaccines. S Afr Med J .2004,43. 审查员 宋梦 (54)发明名称 一种无佐剂b型流感嗜血杆菌结合疫苗冻干 剂的制备方法 (57)摘要 本发明公开了一种无佐剂b型流感嗜血杆菌 结合疫苗。
3、冻干剂的制备方法， 包括配方、 混合料 预备和冻干工艺。 本发明采用在冻干工艺的真空 冷冻升华干燥去除自由水的过程中， 控制瓶装料 的温度在自由水与结合水的共溶点以下来消除 CRM197蛋白的聚集； 在真空升温解吸干燥去除自 由水的过程中， 控制瓶装料的温度在降解点以下 来消除Hib荚膜结构的降解， 使b型流感嗜血杆菌 结合疫苗冻干剂无需添加佐剂的技术方案， 克服 了现有技术存在蛋白聚集、 结构降解、 需加佐剂 的问题与不足， 使b型流感嗜血杆菌结合疫苗冻 干剂， 达到了消除蛋白聚集和结构降解， 无需加 佐剂的目的。 权利要求书1页 说明书4页 附图2页 CN 104491854 B 2017。
4、.10.31 CN 104491854 B 1.一种无佐剂b型流感嗜血杆菌结合疫苗冻干剂的制备方法， 包括混合料预备和冻干 工艺， 其特征在于： 配方为， 原料： Hib-CRM197蛋白结合物原浆； 稀释剂： 注射用水； 冻干保护剂： 蔗糖， 分析纯； 所述的混合料预备为： 室温下， 将所述配方中的原料置于中性硼硅玻璃质的搅拌釜中， 用所述稀释剂将所述原料搅拌稀释至2025微克/毫升， 获得稀料； 之后， 将所述冻干保护 剂按2.5毫克/毫升所述稀料的比例投入搅拌釜中搅拌混合， 搅拌转速100转/分钟， 混合搅 拌用时5分钟， 获得含有冻干保护剂的混合料； 之后， 将所述混合料按0.5ml/。
5、瓶分装于中性 硼硅玻璃质注射剂瓶中， 获得瓶装料， 待用； 所述的冻干工艺， 包括预冻阶段、 升华干燥阶段、 解吸干燥阶段； 其中， 一、 预冻阶段： 将所述瓶装料开口置于真空冷冻干燥机中进行深冷预冻； 冷阱温度-80， 气压为一 个大气压， 瓶装料温度为-55-45， 用时23小时； 二、 升华干燥阶段： 所述瓶装料仍然留在真空冷冻干燥机中， 冷阱温度-80， 真空度5Pa， 分二步进行升华干燥； 升华干燥步骤1： 瓶装料温度为-35-30， 用时12小时； 升华干燥步骤2： 瓶装料温度为-20-10， 用时8小时； 三、 解吸干燥阶段： 所述瓶装料仍然留在真空冷冻干燥机中， 冷阱温度-80。
6、， 真空度5Pa， 进行解吸干燥； 瓶装料温度为1520， 用时10小时； 取出， 封盖， 获得无佐剂b型流感嗜血杆菌结合疫苗冻干剂制品。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 104491854 B 2 一种无佐剂b型流感嗜血杆菌结合疫苗冻干剂的制备方法 技术领域 0001 本发明涉及一种疫苗冻干制剂的制备方法， 具体是指用于将b型流感嗜血杆菌结 合疫苗制成冻干制剂的一种无佐剂b型流感嗜血杆菌结合疫苗冻干剂的制备方法。 背景技术 0002 b型流感嗜血杆菌结合疫苗， 学名b型流感嗜血杆菌荚膜寡糖与CRM197蛋白结合 物， 又称Hib-CRM197蛋白结合物， 是一种用于预防儿童b型流感。
7、的疫苗； b型流感嗜血杆菌结 合疫苗有冻干制剂和液态制剂两种剂型， 这两种剂型在多糖含量及分子大小与分布等质量 指标上均保持一致； 其中， 冻干制剂稳定性高， 无需添加防腐剂， 且能够延长保存期和有效 期。 0003 b型流感嗜血杆菌结合疫苗冻干剂， 简称b型冻干疫苗； b型冻干疫苗的品质取决于 冷冻干燥工艺曲线， 简称冻干工艺； 现有技术的冻干工艺使制备的b型冻干疫苗中的CRM197 蛋白存在聚集现象， 以及Hib荚膜结构(核糖基核糖醇磷酸聚合物)存在降解现象， 参阅图3 并对照图1， 使得b型冻干疫苗的生物活性下降， 为此需要在b型冻干疫苗中添加佐剂以增强 免疫受体的应答强度； 然而， 疫。
8、苗佐剂的负作用会因不同的生物受体而各异， 而理想的疫苗 应该无需添加佐剂； 因此， 现有技术存在蛋白聚集、 结构降解、 需加佐剂的问题与不足。 发明内容 0004 针对上述现有技术存在的问题与不足， 本发明采用在冻干工艺的真空冷冻升华干 燥去除自由水的过程中， 控制瓶装料的温度在自由水与结合水的共溶点以下来消除CRM197 蛋白的聚集； 在真空升温解吸干燥去除自由水的过程中， 控制瓶装料的温度在降解点以下 来消除Hib荚膜结构的降解， 使b型流感嗜血杆菌结合疫苗冻干剂无需添加佐剂的技术方 案， 提供一种无佐剂b型流感嗜血杆菌结合疫苗冻干剂的制备方法， 旨在使b型流感嗜血杆 菌结合疫苗冻干剂， 。
9、达到消除蛋白聚集和结构降解， 无需加佐剂的目的。 0005 本发明的目的是这样实现的： 一种无佐剂b型流感嗜血杆菌结合疫苗冻干剂的制 备方法， 包括配方、 混合料预备和冻干工艺， 其中， 0006 所述的配方为， 0007 原料： Hib-CRM197蛋白结合物原浆； 0008 稀释剂： 注射用水； 0009 冻干保护剂： 蔗糖， 分析纯； 0010 所述的混合料预备为： 室温下， 将所述配方中的原料置于中性硼硅玻璃质的搅拌 釜中， 用所述稀释剂将所述原料搅拌稀释至2025微克/毫升， 获得稀料； 之后， 将所述冻干 保护剂按2.5毫克/毫升所述稀料的比例投入搅拌釜中搅拌混合， 搅拌转速100。
10、转/分钟， 混 合搅拌用时5分钟， 获得含有冻干保护剂的混合料； 之后， 将所述混合料按0.5ml/瓶分装于 中性硼硅玻璃质注射剂瓶中， 获得瓶装料， 待用； 0011 所述的冻干工艺， 包括预冻阶段、 升华干燥阶段、 解吸干燥阶段； 其中， 说 明 书 1/4 页 3 CN 104491854 B 3 0012 一、 预冻阶段： 0013 将所述瓶装料开口置于真空冷冻干燥机中进行深冷预冻； 冷阱温度-80， 气压 为一个大气压， 瓶装料温度为-55-45， 用时23小时； 0014 二、 升华干燥阶段： 0015 所述瓶装料仍然留在真空冷冻干燥机中， 0016 冷阱温度-80， 真空度5Pa。
11、， 分二步进行升华干燥； 0017 升华干燥步骤1： 瓶装料温度为-35-30， 用时12小时； 0018 升华干燥步骤2： 瓶装料温度为-20-10， 用时8小时； 0019 三、 解吸干燥阶段： 0020 所述瓶装料仍然留在真空冷冻干燥机中， 0021 冷阱温度-80， 真空度5Pa， 进行解吸干燥； 0022 瓶装料温度为1520， 用时10小时； 0023 取出， 封盖， 获得无佐剂b型流感嗜血杆菌结合疫苗冻干剂制品。 0024 有益效果 0025 本发明制备的b型流感嗜血杆菌结合疫苗冻干剂制品， 水分含量为1.89， 经 AKTAprime plus蛋白质层析仪检测， 参阅图2并对照。
12、图1， 消除了蛋白聚集和结构降解现象， 无需添加佐剂， 因而称为无佐剂b型流感嗜血杆菌结合疫苗冻干剂。 0026 上述， 本发明采用在冻干工艺的真空冷冻升华干燥去除自由水的过程中， 控制瓶 装料的温度在自由水与结合水的共溶点以下来消除CRM197蛋白的聚集； 在真空升温解吸干 燥去除自由水的过程中， 控制瓶装料的温度在降解点以下来消除Hib荚膜结构的降解， 使b 型流感嗜血杆菌结合疫苗冻干剂无需添加佐剂的技术方案， 克服了现有技术存在蛋白聚 集、 结构降解、 需加佐剂的问题与不足， 所提供的一种无佐剂b型流感嗜血杆菌结合疫苗冻 干剂的制备方法， 使b型流感嗜血杆菌结合疫苗冻干剂， 达到了消除蛋。
13、白聚集和结构降解， 无需加佐剂的目的。 附图说明 0027 读图说明： 0028 图1、 图2、 图3均为AKTAprime plus蛋白质层析仪的检测图谱， 简称图谱； 其中， 图 中曲线位于横坐标60ml附近称为聚集吸收段， 所述聚集吸收段对应的纵坐标峰值表示多糖 大分子聚集的吸收量值； 图中曲线位于横坐标120ml附近称为目标结合物吸收段， 所述目标 结合物吸收段对应的纵坐标峰值表示目标结合物的吸收量值； 图中曲线位于横坐标180ml 附近称为蔗糖吸收段， 所述蔗糖吸收段对应的纵坐标峰值表示蔗糖吸收量值； 0029 图1是未稀释未冻干前的b型流感嗜血杆菌结合疫苗原液的图谱， 图中显示含有。
14、可 忽略的蔗糖吸收量值； 0030 图2是本发明制备的b型流感嗜血杆菌结合疫苗冻干剂冻干后的图谱； 图中的多糖 大分子聚集的吸收量值低于-9.7mAu， 与图1对比， 在可忽略范围内； 图中可见添加的冻干保 护剂蔗糖的吸收量值； 0031 图3是现有技术制备的b型流感嗜血杆菌结合疫苗冻干剂冻干后的图谱； 图中的多 糖大分子聚集的吸收量值高于-9.0mAu， 这表明CRM197蛋白发生了聚集， 与图1对比， 超出了 说 明 书 2/4 页 4 CN 104491854 B 4 许可范围； 同时， 目标结合物的吸收量值因多糖大分子聚集的吸收量值的增高而下降， 低 于-9.5mAu； 这表明目标结合。
15、物结构， 与图1对比， 发生了超出许可范围的降解， 因而需要添 加佐剂； 此外， 图中可见添加的冻干保护剂蔗糖的吸收量值。 实施例说明 0032 以下通过具体实施例对本发明的一种无佐剂b型流感嗜血杆菌结合疫苗冻干剂的 制备方法作进一步详细说明， 所属领域的技术人员可以参照实施例的配方及工艺方法制得 无佐剂b型流感嗜血杆菌结合疫苗冻干剂制品， 但不应理解为对本发明的任何限制。 具体实施方式 0033 实施例 0034 品名： 无佐剂b型流感嗜血杆菌结合疫苗冻干剂 0035 配方： 原料： Hib-CRM197蛋白结合物原浆； 0036 稀释剂： 注射用水； 0037 冻干保护剂： 蔗糖， 分析纯。
16、； 0038 制备 0039 制备条件、 0040 环境气压： 一个大气压； 环境温度： 室温； 0041 设施、 设备： 无菌室； 中性硼硅玻璃质搅拌釜； 中性硼硅玻璃质注射剂瓶； 真空冷冻 干燥机 0042 制备工艺： 包括混合料预备、 冻干工艺； 0043 混合料预备： 0044 将所述配方中的原料置于中性硼硅玻璃质的搅拌釜中， 用所述稀释剂将所述原料 搅拌稀释至2025微克/毫升， 获得稀料； 之后， 将所述冻干保护剂按2.5毫克/毫升所述稀 料的比例投入搅拌釜中搅拌混合， 搅拌转速100转/分钟， 混合搅拌用时5分钟， 获得含有冻 干保护剂的混合料； 之后， 将所述混合料按0.5ml。
17、/瓶分装于中性硼硅玻璃质注射剂瓶中， 获 得瓶装料， 待用； 0045 冻干工艺： 0046 包括预冻阶段、 升华干燥阶段、 解吸干燥阶段； 0047 一、 预冻阶段： 0048 将所述瓶装料开口置于真空冷冻干燥机中进行深冷预冻； 冷阱温度-80， 气压 为一个大气压， 瓶装料温度为-55-45， 用时23小时； 0049 二、 升华干燥阶段： 0050 所述瓶装料仍然留在真空冷冻干燥机中， 0051 冷阱温度-80， 真空度5Pa， 分二步进行升华干燥； 0052 升华干燥步骤1： 瓶装料温度为-35-30， 用时12小时； 0053 升华干燥步骤2： 瓶装料温度为-20-10， 用时8小时； 0054 三、 解吸干燥阶段： 0055 所述瓶装料仍然留在真空冷冻干燥机中， 说 明 书 3/4 页 5 CN 104491854 B 5 0056 冷阱温度-80， 真空度5Pa， 进行解吸干燥； 0057 瓶装料温度为1520， 用时10小时； 0058 取出， 封盖， 获得无佐剂b型流感嗜血杆菌结合疫苗冻干剂制品。 说 明 书 4/4 页 6 CN 104491854 B 6 图1 图2 说 明 书 附 图 1/2 页 7 CN 104491854 B 7 图3 说 明 书 附 图 2/2 页 8 CN 104491854 B 8 。