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1、10申请公布号CN104138547A43申请公布日20141112CN104138547A21申请号201410349638622申请日20140722A61K36/8994200601A61P15/12200601A61P5/30200601A61K131/0020060171申请人河南中医学院地址450008河南省郑州市金水路1号申请人黑龙江中医药大学72发明人郑晓珂张娜王小兰王晓帆赫金丽刘小盼李鹏飞娄永冯卫生匡海学74专利代理机构郑州优盾知识产权代理有限公司41125代理人张绍琳孙诗雨54发明名称薏苡仁水提物在制备雌激素类药物中的应用57摘要本发明公开了一种薏苡仁水提物在制备雌激素类药。
2、物中的应用，薏苡仁水提物是将薏苡仁每次用其1012倍重量的水先浸泡0507H，然后煎煮34次，每次煎煮5060MIN，合并煎煮液，减压浓缩干燥得到薏苡仁水提物；所述薏苡仁水提物用于制备雌激素类药物。与现有技术相比，本发明水提物制备方法简单，稳定可靠，并经多次以上试验，均取得了相同或相近似的结果，方便，成本低，其水提物有效用于制备雌激素类药物，开辟了薏苡仁药用新用途，临床意义巨大。51INTCL权利要求书1页说明书8页附图4页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书8页附图4页10申请公布号CN104138547ACN104138547A1/1页21苡仁水提物在制备雌。
3、激素类药物中的应用，其特征在于所述薏苡仁水提物用于制备雌激素类药物。2根据权利要求1所述的薏苡仁水提物在制备雌激素类药物中的应用，其特征在于所述薏苡仁水提物是将薏苡仁每次用其1012倍重量的水先浸泡0507H，然后煎煮34次，每次煎煮5060MIN，合并煎煮液，减压浓缩干燥得到薏苡仁水提物；所述薏苡仁水提物用于制备雌激素类药物。权利要求书CN104138547A1/8页3薏苡仁水提物在制备雌激素类药物中的应用技术领域0001本发明涉及医药领域，特别是一种薏苡仁水提物在制备雌激素类药物中的应用，可有效用于制备治疗体内雌性激素分泌不足而引起的相关疾病，如妇女更年期综合症等。背景技术0002薏苡仁为。
4、禾本科植物薏苡COIXLACROYMAJOBILVARMAYUENROMANSTAPF的干燥成熟种仁。本草纲目列为上品，野生者少，主为栽培。其性凉，味甘、淡，归脾、胃、肺经。具有利水渗湿，健脾止泻，除痹，排脓，解毒散结的功效。主治水肿，脚气，小便不利，脾虚泄泻，湿痹拘挛，肺痈，肠痈，癌肿等病症。现代药理研究表明薏苡仁具有抗肿瘤，增强机体免疫力，抗炎，降血糖，抑制骨骼肌收缩及镇静、镇痛等作用。但尚未有关于薏苡仁雌激素样活性方面的研究报道。发明内容0003针对现有技术中存在的问题，本发明的目的就是提供一种薏苡仁水提物在制备雌激素类药物中的应用，可有效解决由于体内雌性激素分泌不足而引起的相关疾病如妇。
5、女更年期综合症等的用药问题。以及给临床医生提供参考，旨在中药配伍时考虑该因素提高处方疗效。0004为实现上述目的，本发明采用的技术方案是薏苡仁水提物在制备雌激素类药物中的应用，所述薏苡仁水提物用于制备雌激素类药物。0005所述薏苡仁水提物是将薏苡仁每次用其1012倍重量的水先浸泡0507H，然后煎煮34次，每次煎煮5060MIN，合并煎煮液，减压浓缩干燥得到薏苡仁水提物；所述薏苡仁水提物用于制备雌激素类药物，该薏苡仁水提物可有效用于制备治疗由于体内雌性激素分泌不足而引起的相关疾病的药物，实现薏苡仁水提物在制备治疗由于体内雌性激素分泌不足而引起的相关疾病如妇女更年期综合症等药物中的应用。0006。
6、与现有技术相比，本发明水提物制备方法简单，稳定可靠，并经多次试验，均取得了相同或相近似的结果，药物制备方便，成本低。其水提物有效用于制备雌激素类药物，开辟了薏苡仁药用新用途，临床意义巨大。附图说明0007图1为本发明实施例3中薏苡仁水提物对MCF7增殖的影响S，N6示意图，注与空白对照组比较，表示P005，表示P001；与阳性组比较，表示P005，表示P001。0008图2为本发明实施例3中薏苡仁水提物对性未成熟小鼠子宫系数的影响S，N10示意图，注与空白对照组比较，表示P005，表示P001；与阳性组比较，表示P005，表示P001。说明书CN104138547A2/8页40009图3为本发。
7、明实施例3中ER介导时，薏苡仁水提物对ERE调控的报告基因LUC瞬时表达结果S，N3示意图，注与空白对照组比较，表示P005，表示P001；与阳性组比较，表示P005，表示P001。0010图4为本发明实施例3中ER介导时，薏苡仁水提物对ERE调控的报告基因LUC瞬时表达结果S，N3示意图，注与空白对照组比较，表示P005，表示P001；与阳性组比较，表示P005，表示P001。具体实施方式0011以下结合实施例和试验相关资料对本发明的具体情况作详细说明。0012本发明在具体实施中，所述的薏苡仁水提物在制备雌激素类药物中的应用，该薏苡仁水提物是由以下实施例给出实施例1本实施例所用的材料与仪器1。
8、实验材料11实验药物与主要试剂薏苡仁为禾本科植物薏苡COIXLACROYMAJOBILVARMAYUENROMANSTAPF的干燥成熟种仁。秋季果实成熟时采割植株，晒干，打下果实，再晒干，除去外壳、黄褐色种皮和杂质，收集种仁，即为薏苡仁原药材；试剂均为国产分析纯。001312主要仪器纯水仪SARTORIUS611VF；903磁力搅拌器上海振捷实验设备有限公司；ZRD7080全自动新型鼓风干燥箱上海智城分析仪器制造有限公司；AB204N电子读数分析天平梅特勒托利多仪器上海有限公司产品；SK6200H型超声波清洗器上海科导超声仪器有限公司。0014本实施例薏苡仁水提物是将薏苡仁100G每次用其10。
9、倍重量的水1000G即1000ML先浸泡05H，然后煎煮3次，每次煎煮50MIN，合并三次水煎液，减压浓缩干燥得到薏苡仁水提物，平均得率为1038，该水提物可制备雌激素类药物，用于治疗由于体内雌性激素分泌不足而引起的疾病，如妇女更年期综合症药。0015实施例2本实施例所用的材料与仪器1实验材料11实验药物与主要试剂薏苡仁为禾本科植物薏苡COIXLACROYMAJOBILVARMAYUENROMANSTAPF的干燥成熟种仁。秋季果实成熟时采割植株，晒干，打下果实，再晒干，除去外壳、黄褐色种皮和杂质，收集种仁，即为薏苡仁原药材；试剂均为国产分析纯。001612主要仪器纯水仪SARTORIUS611。
10、VF；903磁力搅拌器上海振捷实验设备有限公司；ZRD7080全自动新型鼓风干燥箱上海智城分析仪器制造有限公司；AB204N电子读数分析天平梅特勒托利多仪器上海有限公司产品；SK6200H型超声波清洗器上说明书CN104138547A3/8页5海科导超声仪器有限公司。0017本实施例薏苡仁水提物是将薏苡仁500G每次用其11倍重量的水5500G即5500ML先浸泡06H，然后煎煮3次，每次1H，合并三次水煎液，减压浓缩干燥得到薏苡仁水提物，平均得率为1098，该水提物可制备雌激素类药物，用于治疗由于体内雌性激素分泌不足而引起的疾病，如妇女更年期综合症药。0018实施例3本实施例薏苡仁水提物是将。
11、薏苡仁1000G每次用其12倍重量的水12000G即12000ML先浸泡07H，然后煎煮4次，每次1H，合并四次水煎液，减压浓缩干燥得到薏苡仁水提物，平均得率为1162，该水提物可制备雌激素类药物，用于治疗由于体内雌性激素分泌不足而引起的疾病，如妇女更年期综合症药。0019根据本实施例中的方法按薏苡仁和水的比例可以通过工业化生产制得任意量的薏苡仁水提物，用于制备雌激素类药物，有效解决由于体内雌性激素分泌不足而引起的疾病如妇女更年期综合症等的用药问题，并经试验得到了充分证明。0020本实施例试验资料如下采用细胞增殖实验、动物实验及报告基因技术研究薏苡仁水提物的雌激素样作用，其有关试验资料如下首先。
12、，通过MCF7细胞增殖实验ESCREEN，发现薏苡仁水提物能够促进MCF7细胞的增殖，提示其在体外具有雌激素样作用。0021其次，通过小鼠子宫增重实验，证明薏苡仁水提物能够显著增加性未成熟雌性小鼠的子宫系数，提示其在体内具有雌激素样作用。0022最后，通过ERE调控的报告基因瞬时表达检测，进一步说明薏苡仁水提物是通过与雌激素受体ER和ER的结合而发挥雌激素样作用。0023本实施例已通过实验证明了本发明药物在制备雌激素类药物中的新用途，其主要实施方案如下一、实验材料与方法1实验药物薏苡仁为禾本科植物薏苡COIXLACROYMAJOBILVARMAYUENROMANSTAPF的干燥成熟种仁。秋季果。
13、实成熟时采割植株，晒干，打下果实，再晒干，除去外壳、黄褐色种皮和杂质，收集种仁，即为薏苡仁原药材。00242实验动物与细胞株及质粒昆明种小鼠，雌性，出生21天刚断乳，体重912G，购于河南省实验动物中心。人乳腺癌细胞MCF7购自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心。HEK293细胞株购于中国典型培养物保藏中心。半乳糖苷酶GALACTOSIDASE，GAL对照质粒PGALCONTROL、重组报告基因PERETALLUC由军事医学科学院生物工程研究所叶棋浓博士惠赠。重组人ERHUMANER，HER表达载体PCXN2HER和重组人ERHUMANER，HER表达载体PCXN2HER由东京大学医学系。
14、SATOSHIINOUE博士惠赠。00253主要试剂DMEM高糖培养基和阳离子脂质体LIPOFECTAMINETM2000REAGENT购自GIBCO说明书CN104138547A4/8页6INVITROGEN公司；胎牛血清购自广州四季青公司；无酚红DMEM高糖培养基、葡聚糖活性炭去激素胎牛血清购自HYCLONE公司；17雌二醇17ESTROGEN，E2、氨苄青霉素AMP、TRIS碱均购自SIGMA公司；戊酸雌二醇片拜耳医药；邻硝基苯D半乳吡喃糖苷ONITROPHENYLDGALACTOPYRANOSIDE，ONPG、EDTA、MTT及DMSO为AMRESCO公司产品；STEADYGLO稳定荧。
15、光素酶检测系统试剂盒STEADYGLOLUCIFERASEASSAYSYSTERM、闪亮裂解缓冲液GLOLYSISBUFFER购自PROMEGA公司；酵母粉OXOID公司；胰蛋白胨OXOID公司；琼脂糖BIOWEST公司；感受态大肠杆菌DH5TRANSGEN公司；质粒小提试剂盒天根公司；其余试剂均为国产分析纯。00264所用主要仪器普通手术器械；二氧化碳培养箱STIK；倒置显微镜NIKONECLIPSETS100；SORVALLST16RCENTRIFUGE高速低温冷冻离心机THERMOFISHERSCIENTIC公司；酶标仪BIORAD680；纯水仪SARTORIUS611VF；903磁力搅。
16、拌器上海振捷实验设备有限公司；ZRD7080全自动新型鼓风干燥箱上海智城分析仪器制造有限公司；微量加样器NICHIPETEXPLUS；AB204N电子读数分析天平梅特勒托利多仪器上海有限公司产品；10CM培养皿、96孔培养板、冻存管均为CORNING公司生产；超净工作台江苏苏净集团；BIOMATE3S紫外分光光度计THERMOFISHERSCIENTIC公司；VERITASTM微板光度计TURNERBIOSYSTEMS公司；SK6200H型超声波清洗器上海科导超声仪器有限公司；LRH系列生化培养箱上海一恒科技有限公司。00275实验方法51MCF7细胞增殖实验MCF7细胞人乳腺癌细胞经无酚红含。
17、5去雌激素血清的DMEM培养基培养1周后，选取对数生长期细胞，PBS洗两次，用005胰蛋白酶消化后，加入无酚红DMEM培养基吹打均匀，以6104个/ML的浓度接种于96孔板内，每孔培养总体积为200L。培养24H待细胞贴壁后，换为含药培养液继续培养。37、5CO2培养48H后，每孔加入MTT溶液5MGML120L，37继续培养4H，小心吸净培养液，每孔加入150LDMSO，震荡510MIN，使紫色结晶完全溶解。以DMSO调零，用酶标仪在490NM下测定各孔吸光度值A，计算平均A值和增殖率PROLIFERATIONRATE，RP。实验平行重复三次。0028RP实验组A值空白组A值空白组A值110。
18、052小鼠子宫增重实验将小鼠按体重均衡和随机的原则分组。给药持续7天。空白对照组每日蒸馏水02ML10G1灌胃；阳性对照组每日戊酸雌二醇033MGKG1D1灌胃；薏苡仁水提物按临床用药的20倍量提取率为低剂量，临床用药的40倍量提取率为高剂量计算，配成相应浓度的混悬液，每日按02ML10G1灌胃。最后一次给药24H后，脱颈处死小鼠，立即摘取子宫称重，计算子宫系数子宫湿重体重1100。实验平行重复三次。结果与空白组相比，计算P值，考察有无统计学意义。002953ERE调控的报告基因瞬时表达检测531细胞接种于转染前24H将处于对数生长期的HEK293细胞人胚肾细胞接种于24孔板，密度为16010。
19、4个/05ML/孔，且培养液为含10去雌激素血清的不含抗生素的无酚红DMEM说明书CN104138547A5/8页7培养液，分别设置空白对照孔、雌二醇孔及待测药物孔。0030532质粒的转染1待细胞布皿8090时，小心吸出原培养基，加入420L含10去雌激素血清的不含抗生素的无酚红DMEM培养基。00312取3只EP管，ER管中加490L无酚红DMEM培养基、9LPCXN2HER质粒80NGL1、9LPERETALLUC质粒400NGL1、9LPGALCONTROL质粒200NGL1；ER管中加490L无酚红DMEM培养基、9LPCXN2HER质粒80NGL1、9LPERETALIUC质粒40。
20、0NGL1、9LGALCONTROL质粒200NGL1；脂质体管中加入1000L无酚红DMEM培养基和36L脂质体。00323倒转混匀脂质体管，室温放置5MIN，取510L分别加入ER和ER管，轻轻混匀，室温放置20MIN；4取80LER管中脂质体/DNA复合物分别加入24孔板ER实验孔，取80LER管中脂质体/DNA复合物分别加入24孔板ER实验孔。前后摇匀，放入培养箱。0033546H后加入对照药物和检测药物。0034533ERE调控的报告基因瞬时表达检测加药后24H的细胞，从培养箱中取出细胞，室温平衡20MIN，吸去培养液。按照STEADYGLO稳定荧光素酶检测系统试剂盒STEADYGL。
21、OLUCIFERASEASSAYSYSTERM及闪亮裂解缓冲液GLOLYSISBUFFER改良操作步骤操作，收集细胞裂解上清液，加入荧光素酶反应底物荧光素，置于暗处，用VERITASTM微板光度计检测荧光强度。0035534GAL活性检测为了考察转染效率，对内参照GAL活性进行检测。0036154L巯基乙醇加入40MLZBUFFER中，混匀，取EP管，每管加1800L；2每管加20L裂解上清液；3每管加400LONPG，倒转混匀；4放置37温箱，至显黄色；5加NA2CO31ML终止反应；6测OD420值；7计算标准化的荧光素酶活性；二、统计处理实验数据以S表示，SPSS180进行单因素方差分析。
22、统计处理。0037三、实验结果1给药48小时后薏苡仁水提物对MCF7细胞增殖的影响结果显示，薏苡仁水提物在1、01、001、0001、00001、000001MGML1时与空白对照组比，对MCF7细胞均有极显著的促增殖作用P001。提示薏苡仁水提物在体外具有雌激素样活性。见表1，图1。0038表1薏苡仁水提物对MCF7增殖的影响S，N6说明书CN104138547A6/8页8注与空白对照组比较，表示P005，表示P001；与阳性组比较，表示P005，表示P001。00392薏苡仁水提物对小鼠子宫系数的影响结果显示，阳性药戊酸雌二醇及薏苡仁水提物低剂量和高剂量与空白对照组相比均能极显著诱导性未成。
23、熟小鼠子宫系数的增加P001。提示薏苡仁水提物在体内具有雌激素样活性。见表2，图2。0040表2薏苡仁水提物对性未成熟小鼠子宫系数的影响S，N10注与空白对照组比较，表示P005，表示P001；与阳性组比较，表示P005，表示P001。00413ERE调控的报告基因瞬时表达检测评价薏苡仁水提物是否通过雌激素受体途径发挥雌激素样作用利用报告基因技术检测薏苡仁水提物与雌激素受体ESTROGENRECEPTORS，ERS相互作用的影响。0042阳性对照组即17雌二醇E2加入的终浓度为108MOLL1，薏苡仁水提物加药浓度分别为1MGML1、01MGML1、001MGML1、0001MGML1。结果显。
24、示，不论是由ER或ER介导，E2标准化后的荧光素酶活性都显著高于空白孔P001。由ER介导时，薏苡仁水提物1MGML1标准化后的荧光素酶活性极显著高于正常孔P001，01MGML1标准化后的荧光素酶活性显著高于正常孔P005，表3，图3。由ER介导时，薏苡仁水提物1MGML1和001MGML1两组标准化后的荧光素酶活性也均极显著高于空白孔P001，薏苡仁水提物001MGML1、0001MGML1标准化后的荧光素酶活性显著高于正常孔P005，表4，图4。说明薏苡仁水提物可经过雌激素受体ER和ER介导激活基因转录发挥雌激素样作用，且由实验结果可看出薏苡仁水提物主要是通过ER介导发挥雌激素样作用的。。
25、说明书CN104138547A7/8页90043表3薏苡仁水提物通过ER介导的对ERE调控的报告基因瞬时表达检测结果S，N3注与空白对照组比较，表示P005，表示P001；与阳性组比较，表示P005，表示P001。0044表4薏苡仁水提物通过ER介导的对ERE调控的报告基因瞬时表达检测结果S，N3注与空白对照组比较，表示P005，表示P001；与阳性组比较，表示P005，表示P001。0045MCF7细胞增殖实验结果显示，薏苡仁水提物在浓度为1MGML1、01MGML1、001MGML1、0001MGML1、00001MGML1和、000001MGML1时对MCF7细胞均具有显著的促增殖作用。。
26、0046小鼠子宫增重实验结果显示，薏苡仁水提物可显著增加性未成熟小鼠子宫系数，说明薏苡仁水提物在体内、体外均具有雌激素样活性。0047ERE调控的报告基因瞬时表达检测结果显示，薏苡仁水提物的雌激素样作用是通过ER和ER共同介导发挥的，且主要是通过ER介导发挥雌激素样作用的。0048综上所述，动物及细胞实验结果显示，薏苡仁水提物具有一定的雌激素样作用，且主要是通过ER介导发挥雌激素样作用。0049四、结论MCF7细胞是雌激素受体阳性的人乳腺癌细胞株，能特异地受雌激素或雌激素样活性物质调节而增殖，是最常用的检测雌激素样活性的细胞株。MCF7细胞雌激素样增殖试验非常灵敏，可以区分雌激素激动剂和拮抗剂。
27、，因而被广泛应用于体外大量、快速筛选和评价环境雌激素和植物雌激素。在薏苡仁水提物对MCF7细胞增殖影响的实验中，薏苡仁说明书CN104138547A8/8页10水提物在浓度为1MGML1、01MGML1、001MGML1、0001MGML1、00001MGML1和、000001MGML1时对MCF7细胞有显著的促增殖作用，说明薏苡仁水提物在体外具有雌激素样活性。0050子宫增重实验是最早建立的检测雌激素活性的经典方法，在评价雌激素活性时，它考虑了物质的吸收、代谢、与血浆蛋白结合以及药代动力学等多方面因素，直接反映受试药物经体内代谢后的总体生物学效应。因此，本实验采用性未成熟雌性小鼠子宫湿重与体。
28、重之比子宫系数作为评价雌激素样活性的指标。通过上述实验，薏苡仁水提物可显著增加性未成熟小鼠子宫系数，提示薏苡仁水提物在体内具有雌激素样作用。0051上述试验反复进行多次，均取得了相同或相近的结果，提示，薏苡仁水提物在体内、体外均具有一定的雌激素样作用。0052报告基因REPORTERGENE是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，即一类其表达产物非常容易被鉴定，且与内源性背景蛋白较易区别的的基因。报告基因技术即将应答元件和报告基因相连，通过检测报告基因表达活性，可知信号转导途径及其对细胞内基因表达的调控和影响。报告基因技术灵敏度高、选择性强且操作简单。在薏苡仁水提物对报告基因载体PERETALL。
29、UC瞬时表达的诱导作用实验中，通过观察报告基因的表达情况，即荧光强度的高低可以检测到受试物是否可与雌激素受体结合，并作用于雌激素应答元件ERE来调控基因的表达，从而了解薏苡仁水提物雌激素样作用的强弱以及其与ER或ER亲和力的大小。实验结果显示，由ER介导时，薏苡仁水提物1MGML1标准化后的荧光素酶活性极显著高于正常孔P001，01MGML1标准化后的荧光素酶活性显著高于正常孔P005。由ER介导时，薏苡仁水提物1MGML1和001MGML1两组标准化后的荧光素酶活性也均极显著高于空白孔P001，薏苡仁水提物001MGML1、0001MGML1标准化后的荧光素酶活性显著高于正常孔P005。提示。
30、，薏苡仁水提物可经过雌激素受体介导激活基因转录，且主要是通过ER介导发挥雌激素样作用。0053有机体是一个复杂的体系，体内体外结果存在一定偏差。本实验应用体外细胞实验、体内整体动物实验及报告基因技术相结合共同来验证受试物的雌激素样活性，保证了结果的准确性。0054通过上述实验，证明薏苡仁水提物能够促进MCF7细胞的增殖和增加性未成熟小鼠子宫的湿重，同时薏苡仁水提物还可以激活由ER和ER介导的基因转录而发挥雌激素样活性，且主要是通过ER介导发挥雌激素样作用。由以上实验结果可知，薏苡仁水提物具有雌激素样作用，所以其可有效用于制备治疗体内雌性激素分泌不足而引起的妇女更年期综合症的药物。说明书CN104138547A101/4页11图1说明书附图CN104138547A112/4页12图2说明书附图CN104138547A123/4页13图3说明书附图CN104138547A134/4页14图4说明书附图CN104138547A14。