流感血凝素和神经氨酸酶变体.pdf

本发明提供了包含(禽类大流行)流感血凝素和神经氨酸酶变体的多肽、多核苷酸、方法、组合物和疫苗。

1.  一种6:2重配流感病毒，其中所述病毒包含来自一个或多个供体病毒的6个内部基因组区段以及编码HA多肽和NA多肽的2个基因组区段，其中所述HA多肽具有SEQ ID NO：29的氨基酸序列。

2.  如权利要求1所述的重配流感病毒，其中所述NA多肽具有SEQ IDNO：30的氨基酸序列。

3.  如权利要求1所述的重配流感病毒，其中所述编码HA多肽的基因组区段具有SEQ ID NO：23的核苷酸序列。

4.  如权利要求1所述的重配流感病毒，其中所述编码NA多肽的基因组区段具有SEQ ID NO：24的核苷酸序列。

5.  如权利要求1-4中任一项所述的重配流感病毒，其中所述一个或多个供体病毒包括A/Ann Arbor/6/60供体病毒。

6.  如权利要求1-4中任一项所述的重配流感病毒，其中所述一个或多个供体病毒包括A/Ann Arbor/6/60以外的供体病毒。

7.  如权利要求6所述的重配流感病毒，其中所述一个或多个供体病毒是PR8或A/Leningrad/17。

8.  如权利要求1-4中任一项所述的重配流感病毒，其中所述一个或多个供体病毒选自一种或多种下列表型：减毒、冷适应性和温度敏感性。

9.  一种免疫原性组合物，其含有免疫有效量的权利要求1-4中任一项所述的重配流感病毒。

10.  如权利要求9所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述HA多肽包含修饰的多碱性切割位点。

11.  如权利要求1-4中任一项所述的重配流感病毒在药物制备中的用途，所述药物以免疫有效量于生理有效载体中给予个体来刺激免疫系统产生对抗流感病毒的保护性免疫应答。

12.  如权利要求1-4中任一项所述的重配流感病毒在药物制备中的用途，所述药物以免疫有效量给予个体来产生对抗病毒感染的免疫原性应答用于所述病毒感染的预防或治疗性处理。

13.  一种减毒的活流感疫苗，其含有权利要求9所述的组合物。

14.  一种分裂病毒或死病毒疫苗，其含有权利要求9所述的组合物。

15.  一种在细胞培养物中产生重配流感病毒的方法，所述方法包括：
i)将多个载体引入一群宿主细胞，所述宿主细胞群能够支持流感病毒的复制，所述载体含有对应于来自一个或多个供体病毒的6个内部基因组区段以及编码HA多肽和NA多肽的2个基因组区段的多种多核苷酸，其中所述HA多肽具有SEQ ID NO:29的氨基酸序列；
ii)培养所述宿主细胞群；和，
iii)回收流感病毒。

16.  如权利要求15所述的方法，其中所述NA多肽具有SEQ ID NO：30的氨基酸序列。

17.  如权利要求15所述的方法，其中所述编码HA多肽的基因组区段具有SEQ ID NO：23的核苷酸序列。

18.  如权利要求15所述的方法，其中所述编码NA多肽的基因组区段具有SEQ ID NO：24的核苷酸序列。

19.  如权利要求15-18中任一项所述的方法，其中所述一个或多个供体病毒选自一种或多种下列表型：减毒、冷适应性和温度敏感性。

20.  如权利要求15-18中任一项所述的方法，其中所述一个或多个供体病毒包括A/Ann Arbor/6/60供体病毒。

21.  如权利要求15-18中任一项所述的方法，其中所述一个或多个供体病毒包括A/Ann Arbor/6/60以外的供体病毒。

22.  如权利要求21所述的方法，其中所述一个或多个供体病毒是PR8或A/Leningrad/17。

流感血凝素和神经氨酸酶变体
本发明专利申请是国际申请号为PCT/US2007/075585，国际申请日为2007年8月9日，进入中国国家阶段的申请号为“200780029510.X”，发明名称为“流感血凝素和神经氨酸酶变体”的发明专利申请的分案申请。
发明背景
每年众多个体感染不同品系和类型的流感病毒，因此对抗多种和不断演化的流感病毒株的疫苗不仅对于公共卫生很重要，同时具有商业重要性。婴儿、老年人、缺乏医疗条件的人群以及免疫削弱的人群对于此类感染具有很高的致死风险。此类流感感染的复杂性在于新的流感病毒株容易演化并在不同物种间传播，因此迫使新的疫苗不断产生。
近50年生产了数种能够对此类不同流感病毒/病毒株产生特异性保护性免疫应答的疫苗，包括完全病毒疫苗、分裂病毒疫苗、表面抗原疫苗和减毒病毒疫苗。然而，尽管任一这些疫苗类型的合适剂型都可产生系统的免疫应答，但减毒病毒疫苗的优势在于还可在呼吸道内刺激局部黏膜免疫。本发明人和同事为生产疫苗在产生流感病毒及其片段方面进行了大量工作；参见例如，2002年10月23日提交的美国申请号60/420,708；2004年5月24日提交的60/574,117；2003年4月25日提交的10/423,828；2004年6月12日提交的60/578,962；以及2004年6月16日提交的10/870,690，其公开内容纳入文本作参考。
因为不同流感病毒株的持续出现(或再现)，因此持续需要新的流感疫苗。通常利用新出现病毒株的抗原部分创造此类疫苗，因此，急需新的、新出现的或新重现的病毒株的多肽和多核苷酸(尤其是抗原性基因序列)。
本发明提供了可用于数种类型疫苗的生产及研究、诊断等的新的和/或新分离的流感血凝素和神经氨酸酶变体。浏览下述内容后还可明了其它多种益 处。
发明概述
在本发明的一些方面，本发明包括分离或重组多肽，其选自：SEQ ID NO:1－SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:21－SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:33－SEQ ID NO:38编码的任一种多肽；SEQ ID NO:11－SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:27－SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:39－SEQ ID NO:44编码的任一种多肽；仅仅是编码SEQ ID NO:11－SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:27－SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:39－SEQ ID NO:44的多肽的开放阅读框；SEQ ID NO:11-20或SEQ ID NO:27-32或SEQ ID NO:39-44多肽的任何可选(如，无信号肽的成熟形式，或开放阅读框外无5’和3’序列，或表达于病毒(如流感)表面的序列)形式；多核苷酸序列编码的任何多肽，该多核苷酸序列在高度严谨条件下与SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:21至SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:33-38或SEQ ID NO:45的多核苷酸序列基本上全长杂交；以及，上述包含血凝素或神经氨酸酶多肽序列的任何片段，或血凝素或神经氨酸酶多肽片段，优选产生特异性结合本发明全长多肽的抗体的片段。在各种实施方式中，本发明的分离或重组多肽与任何上述多肽的约300个毗连氨基酸残基基本相同。在另一个实施方式中，本发明所包括的分离或重组多肽中包含与任何上述多肽中相互毗连的至少约350个氨基酸；至少约400个氨基酸；至少约450个氨基酸；至少约500个氨基酸；至少约520个氨基酸；至少约550个氨基酸；至少约559个氨基酸；至少约565个氨基酸；或至少约566个氨基酸基本相同的氨基酸序列。在一些实施方式中，多肽序列(如本文“序列”所列举的)包含少于565、559等等个氨基酸。在此类实施方式中，较短的列举多肽任选含有少于565、559等等个氨基酸。在另一实施方式中，本发明多肽任选包括融合蛋白、有前导序列的蛋白、前体多肽、有分泌信号或定位信号的蛋白、或有表位标签如E-标签或His表位标签的蛋白。在其它实施方式中，本发明包括的多肽含有与至少一条上述多肽具有至少85％，至少90％，至少93％，至少95％，至少98％，至少98.5％，至少99％，至少99.2％，至少99.4％，至少99.6％，至少99.8％，或至少99.9％序列相同性的序列。本发明血凝素序列能同时含有具有未修饰或修饰 的多碱性切割位点(从而使病毒在鸡蛋中生长)的序列。血凝素多肽序列SEQ ID NOS:11、13、15、17、19、27、29、31、39、41或43含有内源性氨基端信号肽序列，然而，本发明血凝素多肽序列也含有血凝素多肽的成熟(氨基端信号肽已切割)形式。利用本领域任何数种方法可常规测定并预测任何流感病毒株的任何血凝素多肽序列的切割位点。
在其它方面，本发明包括具有上文所列举的一种或多种多肽或其片段的组合物。本发明也包括与多克隆抗血清特异性结合的多肽，所述多克隆抗血清抗含有至少一种上文所述氨基酸序列或其片段的抗原。此类对上述多肽具有特异性的抗体也是本发明的特点。本发明的多肽任选具有免疫原性。
本发明也包括免疫原性组合物，该免疫原性组合物含有一种或多种上文所述免疫有效量多肽，以及对个体给予生理上可接受载体中的任何上述免疫有效量多肽以产生对抗流感病毒的保护性免疫应答的方法。
此外，除了含有此类免疫有效量的重组流感病毒的免疫原性组合物之外，本发明还包括含有上述一种或多种多肽或多核苷酸的重组流感病毒。通过给予生理上可接受载体中的此类重组免疫病毒以刺激个体免疫系统产生抗流感病毒的保护性免疫应答的方法也是本文的一部分。
在另一方面，本发明包括分离或重组核酸，所述分离和重组核酸选自：多核苷酸序列SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:21至SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:33至SEQ ID NO:38，或SEQ ID NO:45(或其互补序列)，编码多肽SEQ ID NO:11至SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:27至SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:39至SEQ ID NO:44(或其互补多核苷酸序列)的任何多核苷酸序列，在高度严谨条件下与上述任何多核苷酸序列全长基本杂交的多核苷酸序列，和包含此类多核苷酸序列的全部或片段的多核苷酸序列，其中优选编码血凝素或神经氨酸酶多肽或血凝素或神经氨酸酶多肽片段的序列。本发明也包括分离或重组核酸，所述分离或重组核酸编码的氨基酸序列与上述核酸编码的任何多肽至少约300个氨基酸基本相同，或与上述核酸编码的多肽至少约350个氨基酸；至少约400个氨基酸；至少约450个氨基酸；至少约500个氨基酸；至少约502个氨基酸；至少约550个氨基酸；至少约559个氨基酸；至少约565个氨基酸；至少约566个氨基酸基本相同。此外，在氨基酸长度少于如566、565、559等 的情况下(参见例如，“序列”)，应理解的是长度任选小于566、565、559等。本发明也包括上述任何编码血凝素或神经氨酸酶多肽、或一种或多种血凝素或神经氨酸酶多肽的一个或多个片段的核酸。本发明的其它方面包括编码多肽(任选血凝素或神经氨酸酶多肽)的分离或重组核酸，其序列与上述至少一种多核苷酸具有至少98％相同性，至少98.5％相同性，至少99％相同性，至少99.2％相同性，至少99.4％相同性，至少99.6％相同性，至少99.8％相同性，或至少99.9％相同性。本发明还包括通过突变或重组一种或多种上述多核苷酸序列而产生的编码血凝素或神经氨酸酶多肽的分离或重组核酸。本发明的多核苷酸序列能优选包括，如前导序列、前体序列或表位标签序列或类似物中的一种或多种，并可任选编码融合蛋白(如，具有一种或多种其它序列)。
在另一些实施方式中，本发明包括含有上述两种或多种核酸的组合物(如，包含至少约2、5、10、50或更多种核酸的文库)。可任选通过切割(如，机械切割、化学切割或利用限制性核酸内切酶/RNA酶/DNA酶酶解等)一种或多种上述核酸生产此类组合物。本发明的其它组合物包括，如在三磷酸脱氧核糖核苷酸和热稳定性核酸聚合酶的存在下将一种或多种上述核酸孵育产生的组合物。
本发明还包括含有至少一种上述核酸或其切割或扩增片段或其产物的细胞。此类细胞可任选表达此核酸编码的多肽。本发明的其它实施方式包括含有任何上述核酸的载体(如质粒、粘粒、噬菌体、病毒、病毒片段等)。此类载体任选包括表达载体。本发明优选的表达载体包括但不限于：含有pol I启动子和终止子序列的载体或使用pol I和pol II启动子“polI/polII启动子系统”的载体(如Zobel等，Nucl.Acids Res.1993，21:3607；US20020164770；Neumann等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1999，96:9345；Fodor等，J.Virol.1999，73:9679；和US20030035814)。被此类载体转化的细胞也在当前发明的范围内。
在一些实施方式中，本发明包括含有一种或多种上述核酸(如编码血凝素和/或神经氨酸酶的核酸)或其一种或多种片段的病毒(如流感病毒)。包含此类病毒的免疫原性组合物也是本发明的一部分。此类病毒能包含重配病毒，如6:2重配病毒(如，含有来自一种或多种供体病毒的6个基因编码区和来自一种或多种任选含有血凝素和/或神经氨酸酶的上述核苷酸序列(或其一种或多种片段) 的2个基因编码区)。本发明的重配病毒(任选活病毒)可包含一种或多种如冷敏感、冷适应性或减毒的供体病毒。例如，重配病毒可包含如A/Ann Arbor/6/60，PR8等。本发明的重配病毒可排除A/Ann Arbor/6/60。本发明的一个优选实施方式是重配流感病毒，其中病毒为6:2重配流感病毒并包含来自A/Ann Arbor/6/60的6个基因编码区以及编码选自SEQ ID NO:11-20、SEQ ID NOS:27-32和SEQ ID NOS:39-44的多肽的2个基因编码区。在一个备选实施方式中，本发明的重配流感病毒包括6:2重配流感病毒，其中所述病毒含有来自除A/Ann Arbor/6/60外的一种或多种供体病毒的6个基因编码区以及编码选自SEQ ID NOS:11-20、SEQ ID NOS:27-32和SEQ ID NOS:39-44的多肽的2个基因编码区。在另一备选实施方式中，本发明的重配流感病毒包含6:2重配流感病毒，其中所述病毒含有来自除A/Ann Arbor/6/60外的一种或多种供体病毒的6个基因编码区以及来自任何大流行流感病毒株的HA或NA多肽的2个基因编码区。在允许核酸表达的条件下在合适的培养基中培养含有流感病毒的宿主细胞制造重组流感病毒并从一种或多种宿主细胞或培养基中分离重组流感病毒的方法也是本发明的一部分。
在本文其它实施方式中，本发明包括免疫有效量的含有上述任何重组流感病毒的免疫原性组合物。其它实施方式包括通过给予免疫有效量的任何上述重组流感病毒(任选在生理上有效的载体中)刺激免疫个体免疫系统产生对抗流感病毒的保护性免疫应答的方法。
本发明的其它方面包括在允许核酸表达的条件下在合适的培养基中培养上述任何宿主细胞从而产生分离或重组多肽以及从一种或多种宿主细胞或细胞生长培养基中分离多肽的方法。
免疫原性组合物也是本发明特征。例如，包含任何一种或多种上述多肽和/或核酸以及任选赋形剂(如药学上可接受的赋形剂)或一种或多种药学上可接受给药组分的免疫原性组合物。本发明的免疫原性组合物也能包含任何一种或多种上述病毒(如，与一种或多种药学上可接受的给药组分一起)。
通过对个体给予有效量的任何上述病毒(或免疫原性组合物)在个体中产生免疫原性反应的方法也在本发明范围内。此外，通过给予一定量的一种或多种上述病毒(或免疫原性组合物)以有效产生对抗病毒感染的免疫原性反应，从 而在个体中预防或治疗病毒感染(如病毒性流感)也在本发明范围内。此类治疗的个体包括哺乳动物(如人)。此类方法也包括对个体体内给药以及对个体的一种或多种细胞体外或离体给药。此外，此类方法还包括给予含有病毒和药学上可接受的赋形剂的组合物，以一定量给予个体从而有效预防或治疗病毒感染。
在其它方面，本发明包括含有编码一种或多种大流行流感病毒株血凝素和/或神经氨酸酶多肽的核酸序列以及编码一种或多种A/Ann Arbor/6/60多肽的核酸序列的组合物。此外，本发明包括含有编码一种或多种大流行流感病毒株血凝素和/或神经氨酸酶多肽的核酸序列以及编码一种或多种PR8或A/Ann Arbor/6/60多肽的核酸序列的组合物。此类序列能包括本文“序列”所列举的那些。此外，本发明的优选实施方式包括含有编码一种或多种大流行流感病毒株血凝素和/或神经氨酸酶多肽的核酸序列以及在6:2重配株中编码所选主体(backbone)病毒株的核酸序列的组合物。此类组合物优选包括选自本文“序列”中编码血凝素和神经氨酸酶的序列以及主体病毒株，其中主体病毒株为PR8或A/Ann Arbor/6/60。本发明也包括如上所述的此类组合物，其中血凝素包含修饰的多碱性切割位点。本发明也包括含有上述组合物的减毒的活流感疫苗。
参照附图和附录阅读以下详述后，将完全明白本发明的这些和其它目的和特征。
附图简要说明
图1：显示对VN/1203/2004的HA基因进行工程改造修饰，以移除多碱性切割位点。
图2：显示鼻内给予H5N1ca重配病毒在鸡内不复制的结果。
图3：显示H5N1/AA ca候选疫苗对小鼠不致死。
图4：显示1997和2004H5N1ca重配病毒在小鼠体内复制受限。
图5：显示重配的H5N1/AA ca流感病毒在小鼠肺部复制受限。
图6：显示小鼠单次鼻内疫苗给药后得到血清HAI Ab滴度。
图7：显示小鼠单次鼻内疫苗给药后得到血清中和Ab滴度。
图8：显示H5N1ca重配病毒在用50、500或5000LD₅₀野生型H5N1病毒的致死性刺激中保护小鼠。
图9：显示对同源和异源H5N1刺激病毒在小鼠肺部复制的保护功效。
图10：显示对同源和异源H5N1刺激病毒在小鼠上呼吸道复制的保护功效。
图11：显示在小鼠中2004H5N1ca疫苗对抗高剂量(10₅TCID₅₀)同源或异源H5N1wt病毒刺激的保护功效。
图12：显示在小鼠中1997和2003H5N1ca疫苗对抗高剂量(10₅TCID₅₀)同源或异源H5N1野生型病毒刺激的保护功效。
图13：显示在小鼠中2004H5N1ca疫苗对抗低或高剂量(10₅TCID₅₀)同源H5N1野生型病毒刺激的保护功效。
图14：显示对A/Netherland/219/03HA的HA基因进行工程改造修饰，以移除多碱性切割位点。
图15：H5N1ca疫苗在小鼠中引发血清中和抗体的滴度。在每一剂量疫苗给药前(放血前(prebleed))和28天后收集血清；未检测到的滴度指定值为10。
图16：H6ca病毒在雪貂中减毒。*肺EID₅₀/g；鼻甲PFU/g。鼻内接种10⁷TCID₅₀，感染后第3天收集组织。
图17：H6ca疫苗在雪貂中的免疫原性。
图18(a)和18(b)：H6ca疫苗在雪貂中的功效。在肺部(a)和鼻甲(b)内检测病毒滴度。疫苗：单次给药7log₁₀PFU。刺激：7log₁₀PFU；刺激后三天。
图19：H7N3BC04ca病毒在雪貂中减毒。接种物：0.5mL10⁷TCID₅₀鼻内接种。在感染后第3天收集组织。
图20：H7N3BC2004ca在小鼠中具有免疫原性。a：抗ck/BC/CN-6/04wt的血清中和抗体滴度的倒数几何均值。b：p<0.05(曼恩-惠特尼U检验)(Mann-Whitney U-test)，与感染28天后的中和滴度相比。。
图21(a)-21(i)：小鼠体内H7N3BC04ca有效对抗H7病毒的致死刺激。对抗50LD₅₀A/ck/BC/CN-7/04致死刺激的功效：单次免疫四周后(a)，单次免疫八周后(b)，或两次免疫八周后(2次给药相隔四周)(c)。对抗50LD₅₀A/NL/219/03致死刺激的功效：单次免疫四周后(d)，单次免疫八周后(e)，或两次免疫八周后(2次给药相隔四周)(f)。对抗50LD₅₀A/tk/Eng/63致死刺激的功效：单次免疫四周后(g)，单次免疫八周后(h)，或两次免疫八周后(2次给药相隔四周)(i)。
图22(a)和(b)：H7N3BC04ca疫苗在小鼠中有效。8周时在(a)鼻甲和(b)肺部测定病毒滴度。
图23(a)和(b)：H9N2G9/AA ca在雪貂中减毒。在(a)鼻甲和(b)肺部测定病毒滴度。
图24(a)和(b)：H9N2ca疫苗在小鼠中的功效。
图25：健康成人中H9N2G9/AA ca的复制高度受限。
图26：健康成人中对10^7.0TCID₅₀H9N2G9/AA ca的HI抗体应答。
图27：健康成人中H5N1VN2004A/AA ca的复制高度受限。
图28：健康成人中对10^6.7TCID₅₀VN2004A/AA ca的HI抗体应答。
发明详述
本发明包括流感血凝素和神经氨酸酶多肽和多核苷酸序列，以及包含此类序列的载体、组合物等和其使用方法。本发明的其它特点在此详述。
定义
除非另有说明，本文所用的一切技术和科学术语与本发明所属技术领域一般技术人员通常理解的含义相同。下列定义作为对本领域定义的补充，并指导本发明，并不需要归因于任何相关或不相关的场合，如任何共有的专利或申请。尽管任何与本发明所述类似或等同的方法和材料可用于实践测试本发明，但本文描述了优选的材料和方法。因此，本文所用术语仅出于描述特定实施方式的目的，而不是限制本发明。
除非另有清楚指示，本说明和附加权利要求所使用的单数形式“一种”、“一个”和“那”包括其复数形式。因此，例如，提及“一个病毒”包括多数病毒；提及“一种宿主细胞”包括宿主细胞的混合物。
依照上下文，“氨基酸序列”是氨基酸残基的聚合物(蛋白质、多肽等)或代表氨基酸聚合物的字符串。
依照上下文，术语“核酸”、“多核苷酸”、“多核苷酸序列”和“核酸序列”指单链或双链脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物、嵌合体或其类似物。如本文所用术语任选包括天然产生核苷酸的类似物的聚合物，其具有天然核苷酸的本质属性，能够与单链核酸以与天然产生核苷酸(如肽核酸)类似的方式杂 交。除非另有指示，本发明特定的核酸序列不仅包括明确指示的序列，还任选包括互补序列。可从任何指定多核苷酸序列确定给定核酸或互补多核苷酸序列(如，互补核酸)。
术语“核酸”或“多核苷酸”也包含任何单体单位的物理字符串，能与核苷酸串对应，包括核苷酸聚合物(如，典型的DNA或RNA聚合物)、PNA、修饰的寡核苷酸(如，含有溶液中非典型生物学RNA或DNA的寡核苷酸，如2’-O-甲基寡核苷酸)等。核酸可以是单链或双链。
“亚序列”是整条序列的任何部分，直至并包含完整序列。通常，亚序列短于全长序列。“独特亚序列”指未在先前测定的任何流感多核苷酸或多肽序列中发现的亚序列。
关于多肽的术语“变体”指与参考序列比较改换了一个或多个氨基酸的氨基酸序列。变体能具有“保守”变换，其中替换的氨基酸具有相似结构或化学性质，如用异亮氨酸替换亮氨酸。或者，变体能具有“非保守”变换，如，用色氨酸替换甘氨酸。相似的小变化也可包括氨基酸缺失或插入或两者均有。利用本领域熟知计算机程序可指导测定哪些氨基酸残基可被替换、插入或缺失而不破坏生物学或免疫学活性，例如，DNASTAR软件。保守取代的例子也在本文有所描述。
术语“基因”广泛用于指任何具有生物学功能的核酸。因此，基因包括编码序列和/或其表达所需的调节序列。术语“基因”应用于特定的基因组序列，以及该基因组序列编码的cDNA或mRNA。
基因也包括非表达核酸区段，例如，形成其它蛋白的识别序列的区段。非表达调节序列包括“启动子”和“增强子”，调节蛋白如转录因子与其结合，导致毗邻或相近序列的转录。“组织特异性”启动子或增强子是在特定组织类型或细胞类型中调节转录的启动子或增强子。
如上下文所指示，“基因表达”或“核酸表达”指将DNA转录为RNA(任选包括RNA的修饰，如剪接)、将RNA翻译为多肽(可能包括后续多肽修饰，如，翻译后修饰)，或同时转录和翻译。
“开放阅读框”或“ORF”是DNA或RNA(如基因)的可能翻译阅读框架，它可被翻译成为多肽。即，开放框架不被终止密码子打断。然而，值得注意的 是术语ORF未必表示该多核苷酸实际翻译为多肽。
术语“载体”指在生物体、细胞或细胞组件间增殖和/或转移核酸所采用的方法。载体包括质粒、病毒、噬菌体、前病毒(pro-virus)、噬菌粒、转座子、人工染色体等，它们自我复制并能整合进入宿主细胞的染色体。载体也可为裸露RNA多核苷酸、裸露DNA多核苷酸、在同一链内含有DNA和RNA的多核苷酸、多聚赖氨酸偶联的DNA或RNA、肽偶联的DNA或RNA、脂质体偶联的DNA或类似物质，它们不进行自主复制。在许多但非全部的一般实施方式中，本发明的载体是质粒。
“表达载体”是能够促进掺入其中的核酸表达及复制的载体，如质粒。通常，要表达的核酸“可操作性的连接于”启动子和/或增强子，并受启动子和/或增强子的转录调节控制。
“双向表达载体”特征在于两个供选启动子从位于两个启动子之间的核酸的相反方向出发，因此可从两个方向起始表达，导致如正(+)或有义链和负(-)或反义链RNA的转录。
“多肽”是含有两个或多个氨基酸残基(如肽或蛋白)的聚合物。聚合物任选包含修饰如糖基化等。多肽的氨基酸残基可为天然或非天然的，并且可为未取代、未修饰、取代或修饰的。
在本发明的上下文中，术语“分离的”指生物学材料，如病毒、核酸或蛋白，基本脱离通常伴随的或天然产生的环境相互作用的组分。分离的生物学材料任选包含在天然环境中未发现与该生物学材料伴随的其它材料，如细胞或野生型病毒。例如，若材料在其自然环境中，如细胞，可将材料置于细胞内未发现此材料的环境位置(如基因组或遗传元件)。例如，如果通过非天然产生的方法将其引入基因组(如载体，如质粒或病毒载体，或扩增子)中非该核酸本来的座位时，该天然产生的核酸(如编码序列、启动子、增强子等)就成为分离的。此类核酸也称作“异源”核酸。例如，分离的病毒是所处环境(如，细胞培养体系或纯化自细胞培养物)并非野生型病毒的本来环境(如感染个体的鼻咽腔)的病毒。
当术语“嵌合”或“嵌合物”涉及病毒时，表明该病毒包括源自一种以上亲本病毒株或来源的遗传和/或多肽组分。同样，术语“嵌合”或“嵌合物”涉 及病毒蛋白时，表明该蛋白包括源自一种以上亲本病毒株或来源的多肽组分(即氨基酸亚序列)。
术语“重组体”指该材料(如核酸或蛋白)由人干涉被人工地或合成地(非天然)改变。可在该材料的天然环境或状态，或将材料从中移出，进行改变。详细说，例如，当通过重组核酸的表达产生流感病毒时，该流感病毒是重组的。例如，“重组核酸”是通过将核酸重组产生的，例如，通过克隆、DNA重排或其它步骤，或通过化学或其它诱变产生的；“重组多肽”或“重组蛋白质”是通过重组核酸的表达产生的；“重组病毒”，如，重组流感病毒是通过重组核酸的表达产生。
当术语“重配”涉及病毒时，表明该病毒包含源自一种以上亲本病毒株或来源的遗传和/或多肽组分。例如，7:1重配株包含源于第一个亲本病毒的7个病毒基因组区段(或基因区段)以及一个补充性病毒基因组区段，如，编码本发明血凝素或神经氨酸酶的区段。6:2重配株包含6个基因组区段，最常见的来自第一亲本病毒的6个内部基因以及两个补充区段，如，来自不同亲本病毒的血凝素和神经氨酸酶。
当术语“引入”涉及异源或分离的核酸时，指将核酸掺入真核或原核细胞中，其中核酸可被掺入到细胞的基因组中(如染色体、质粒、质体或线粒体DNA)转化为自主复制子，或者瞬时表达(如转染mRNA)。该术语包含此类方法如“感染”、“转染”、“转化”和“转导”。在本发明的上下文中，可使用多种方法将核酸引入细胞中，包括电穿孔、磷酸钙沉淀、脂质介导的转染(脂转染)(lipofection)等。
术语“宿主细胞”指含有异源核酸如载体，并支持核酸的复制和/或表达的细胞。宿主细胞可以是原核细胞如大肠杆菌(E.coli)，或真核细胞如酵母、昆虫、两栖类、鸟类或哺乳动物细胞，包括人细胞。示范性宿主细胞可包括例如Vero(非洲绿猴肾)细胞、BHK(幼仓鼠肾)细胞、原代鸡肾(PCK)细胞、Madin-Darby狗肾(MDCK)细胞、Madin-Darby牛肾(MDBK)细胞、293细胞(如293T细胞)和COS细胞(如COS1、COS7细胞)等。
流感病毒的“免疫有效量”是足以提高个体(如人)自身对随后接触流感病毒产生免疫应答的用量。可检测诱导免疫水平，如通过检测中和分泌和/或血清抗 体的量，如通过空斑中和、补体固定、酶联免疫吸附或微中和实验来检测。
对抗病毒的“保护性免疫应答”指经过疾病防护的个体后续暴露于和/或被此类流感病毒感染时，个体(如人)展示的免疫应答。在一些例子中，流感病毒(如天然循环)仍能引起感染，但不能引起严重感染。通常，保护性免疫应答使得宿主产生血清和分泌抗体水平可检测到，所述宿主产生血清和分泌抗体能体外和体内中和同一病毒株和/或亚组的病毒(也可能为不同的、非疫苗株和/或亚组)。
本文所用“抗体”为包含一个或多个完全或部分由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片段编码的多肽的蛋白。认可的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及无数免疫球蛋白可变区基因。轻链分为κ或λ。重链分为γ、μ、α、δ或ε，进而分别定义了免疫球蛋白类型IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。典型的免疫球蛋白(抗体)结构单位包含四聚体。每一四聚体由两对同样的多肽链对组成，每对具有一条“轻”链(约25kD)和一条“重”链(约50-70kD)。每一条链的N末端定义了约100-110个或更多氨基酸的可变区，它们主要负责抗原识别。术语轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)分别指这些轻链和重链。抗体以免疫球蛋白的形式或以不同肽酶消化产生的明确的数个片段的形式存在。因此，例如，胃蛋白酶在绞链区二硫连接以下消化抗体产生F(ab)'2，F(ab)'2是Fab二聚体，本身是通过二硫键与VH-CH1连接的轻链。在缓和条件下还原F(ab)'2打断绞链区的二硫连接从而将(Fab')2二聚体转化成为Fab'单体。Fab'单体实质上是具有部分绞链区的Fab(参见《基础免疫学》(Fundamental Immunology)，W.E.Paul编，纽约瑞文出版社(Raven Press)(1999)，其中有关于其它抗体片段更详细的描述)。既然通过消化完整抗体定义不同的抗体片段，熟练技术人员意识到可通过化学或重组DNA方法全新合成此Fab'片段。因此，本文所用术语抗体包含抗体或通过完整抗体修饰的或使用重组DNA方法全新合成的片段。抗体包括，如，多克隆抗体、单克隆抗体、多链或单链抗体，单链抗体包括单链Fv(sFv或scFv)抗体，其中可变的重链和可变的轻链连接在一起(直接或通过肽接头)，形成连续多肽，以及人源化或嵌合抗体。
流感病毒
本发明的多肽和多核苷酸，如SEQ ID NO：1-45，为流感HA和NA序列的变体。通常，流感病毒由含区段化单链RNA基因组的内部核蛋白核心以及由基质蛋白排列成的外部脂蛋白包膜组成。流感病毒基因组由8段线性(-)链核糖核酸(RNA)和6个内部核心多肽组成，所述核糖核酸编码免疫原性血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)蛋白，所述内部核心多肽是：核衣壳核蛋白(NP)；基质蛋白(M)；非结构蛋白(NS)；和3个RNA聚合酶(PA、PB1、PB2)蛋白。复制过程中，基因组RNA在宿主细胞核中转录成为(+)链信使RNA和(-)链基因组cRNA。8个基因组区段中的每一个都包装成为核糖核蛋白复合物，其中除了RNA外还含有NP和聚合酶复合物(PB1、PB2和PA)。
流感通常分为甲型流感和乙型流感。每一甲型流感和乙型流感病毒均含有8段具负极性的单链RNA。甲型流感基因组编码11个多肽。区段1-3编码3个多肽，组成RNA-依赖性RNA聚合酶。区段1编码聚合酶复合物蛋白PB2。剩下的聚合酶蛋白PB1和PA分别由区段2和区段3编码。此外，某些流感株的区段1编码小蛋白PB1-F2，由PB1编码区内的另一阅读框产生。区段4编码在感染过程中参与细胞粘附和进入的血凝素(HA)表面糖蛋白。区段5编码与病毒RNA关联的主要结构组分，核衣壳核蛋白(NP)多肽。区段6编码神经氨酸酶(NA)包膜糖蛋白。区段7编码两个基质蛋白M1和M2，它们由差异剪接的mRNA翻译。区段8编码两个非结构蛋白NS1和NS2，它们由另路剪接的mRNA变体翻译。乙型流感的8个基因组区段编码11个蛋白。三个最大的基因编码RNA聚合酶的组分PB1、PB2和PA。区段4编码HA蛋白。区段5编码NP。区段6编码NA蛋白和NB蛋白。蛋白质NB和NA均由顺反子mRNA的交叠阅读框翻译而来。乙型流感的区段7也编码两个蛋白：M1和BM2。最小区段编码两个产物：NS1翻译自全长RNA，而NS2翻译自剪接mRNA变体。
流感病毒疫苗
本文的序列、组合物和方法主要但非只关于产生流感病毒疫苗。历史上，首先使用选择或基于经验预测的相关株的病毒株在含胚鸡蛋中产生流感病毒疫苗。最近，在一种批准的减毒温度敏感型主株中合并所选血凝素和/或神经氨酸酶抗原产生重配病毒。在鸡蛋中将病毒培养物传代数次后，回收病毒并任选灭活病毒，如使用甲醛和/或β-丙内酯灭活(或用于减毒的活疫苗)。因此，将认 识到HA和NA序列(如，SEQ ID NO：1-45)在构建流感疫苗时尤其有用。本发明包括含有大流行流感株HA和/或NA序列的病毒/疫苗(包括其中HA序列含有修饰的多碱性切割位点，如本文所述修饰)；并包括其中病毒/疫苗含有ca主体如A/AA/6/60或PR8主体。
在细胞培养物中生产重组和重配疫苗的尝试受阻的原因是一些批准用于疫苗生产的病毒株无法在标准细胞培养条件下有效生长。然而，发明人和同事先前的工作提供了一种在培养物中产生重组和重配病毒的载体系统及方法，因此，使快速生产对应一种或多种所选抗原性病毒株的疫苗成为可能，如，A或B株，不同亚型或亚株等，如，含有本文HA和/或NA序列。参见，用于生产流感病毒的多质粒系统(Multi-Plasmid System for the production of Influenza virus)，2002年10月23日提交的美国申请号60/420,708，2003年4月25日提交的美国申请号10/423,828，以及2004年5月24日提交的美国申请号60/574,117。通常，将培养物维持于恒温器控制的恒温(使温度不超过35℃)、湿度和CO₂控制系统中，如细胞培养箱。通过将对应主流感病毒的基因组区段的载体子集与源于感兴趣病毒株的补充区段(如，本文HA和/或NA抗原性变体)联合引入，易于获得重配流感病毒。通常，基于需给药疫苗相关所需特性选择主病毒株。例如，用于疫苗生产，如，用于减毒的活疫苗生产，主供体病毒株可选自减毒表型、冷适应和/或温度敏感型。如本文其它部分及美国专利申请号10/423,828等所释，本发明的不同实施方式使用A/Ann Arbor(AA)/6/60流感株作为“主体”，在其基础之上加上HA和/或NA基因(如本文所列的那些序列等)来创造所需重配病毒。因此，例如，在6:2重配株中，2个基因(即NA和HA)来自于期望对之产生免疫原性反应的流感株，而其它6个基因来自于Ann Arbor株，或其它主体病毒株，等。Ann Arbor病毒的冷适应性、减毒和温度敏感属性很有用。当然，应当被意识到的是本文中的HA和NA序列能够与数种其它病毒基因或病毒类型发生重配(如数种不同“主体”，如PR8等，其包含出现于重配株的其它流感基因，即非HA和非NA基因)。
本文中的不同实施方式可包含用于大流行流感的具有本文HA和/或NA序列的减毒活疫苗。此类疫苗通常包含如SEQ ID NO：11-20、27-32或39-44的HA和/或NA序列，或SEQ ID NO：1-10、21-26、33-38或45的对应编码 核苷酸序列。疫苗病毒株(如重配株)在鸡蛋中生长造成的一个问题是禽类病毒株(它可能涉及大流行)能杀死生产疫苗的鸡蛋，因此通过使用传统(非质粒拯救)重配株生产难以操作、制造等。因为此类禽病毒株能引起人类流感及可能大流行因此对其很感兴趣。因此，使用质粒拯救系统产生/操作流感重配株及大流行病毒株，如不同的禽类序列(如本文HA和NA序列)，是急需的，也是本发明的特色。然而，应当意识到的是当前序列也可能用于非质粒或传统的系统。
水禽(以及其它种类)能被15个血凝素(HA)和9个神经氨酸酶(NA)亚型的甲型流感病毒感染。这种鸟类作为存储库可将新流感亚型引入人群并造成大流行。2003年荷兰禽类H7N7甲型流感病毒感染人以及早些时候香港和中国禽类H5N1和H9N2病毒感染人的发现引发了对这些(以及其它)亚型有引起大流行可能的关注。因此，需要疫苗保护人受到甲型禽流感病毒的感染。对抗人流感病毒的减毒甲型流感病毒活疫苗最近在美国得到许可。参见如上。此类疫苗为重配的H1N1和H3N2病毒，其中A/Ann Arbor(AA)/6/60(H2N2)冷适应性(ca)病毒的内部蛋白基因使重配病毒具有AA ca病毒冷适应、减毒和温度敏感的表型(即从非Ann Arbor病毒株得到血凝素和神经氨酸酶基因的那些)。将经典遗传重配和基于质粒的反向遗传学技术应用于产生含有来自甲型流感病毒(H4-H14亚型)的禽类血凝素和神经氨酸酶基因以及来自AA ca病毒的6个内部基因区段的重配病毒。此类重配病毒是本发明的特色。参见下列HA和NA基因序列。因为AA ca病毒相关表型出现在重配病毒中，因此这些病毒具有在候选疫苗中需要的生物学性质。产生并评价这些作为疫苗种病毒的重配病毒是大流行准备的重要步骤。预计临床试验能确定此类减毒活的大流行疫苗的安全性、感染性以及免疫原性。本发明的其它实施方式包括含有来自禽类和猪的大流行抗原性基因HA和/或NA的重配病毒(如疫苗中使用的那些)、除本文列举外的大流行病毒株，以通过质粒拯救重配(如，重配A/Ann Arbor6/60(即，A/AA/6/60)和PR8等)生产大流行疫苗。也包括构建和使用此类病毒和疫苗的方法。本文所用“大流行病毒株”定义为不在人群中流动的流感毒株A病毒亚型，由疾病控制中心(Centers for Disease Control)或世界卫生组织(World Health Organization)宣布或通常为科学领域所承认为大流行菌株。
在本文的不同实施方式中，抗原性序列(如HA序列)以及病毒和来自此类 病毒的疫苗含有修饰的多碱性切割位点。一些高致病性禽大流行流感病毒株在血凝素序列内包含多个碱性氨基酸切割位点。参见例如，Li等，J.of Infectious Diseases，179:1132-8，1999。在本发明的典型实施方式中，与产生目前序列的野生型序列相比，此类切割位点的序列经过修饰或更改(如，使其不能切割或减少了切割等)。因为野生型序列切割位点的不同序列，在不同病毒株中此类修饰/更改是不同的。例如，通常，本文序列中移除(与wt相比)成熟H5的位置326-329上的4个多碱性残基(RRKK)。参见“序列”。在各种实施方式中，可通过多种方式修饰多碱性切割位点(这些均包含于本发明范围内)。例如，一次可移除多碱性切割位点的一个氨基酸(如，移除一个R，移除两个R，移除RRK，或移除RRKK)。此外，切割位点直接上游的氨基酸残基也可被移除或更改(如，R变为T等)；切割位点直接下游的氨基酸编码核苷酸也同样可被修饰。参见例如，图1所示切割位点的修饰。此外，流感病毒血凝素多肽序列含有氨末端信号肽序列，因此，本发明的血凝素多肽序列包含血凝素多肽的成熟(氨基末端信号肽切割)形式以及血凝素的预切割形式。利用本领域任何数种方法可常规检测任何流感株的任何血凝素多肽序列的切割位点。
应用于任选包含当前序列的病毒(通常用于疫苗或疫苗生产)的术语“温度敏感型”、“冷适应性”和“减毒的”为本领域所熟知。例如，对甲型流感株而言，术语“温度敏感型”(ts)表明与33℃相比病毒在39℃时表现出100倍甚至更多的减弱，或者对乙型流感株而言，与33℃相比，在37℃时表现出100倍甚至更多的减弱。术语“冷适应性”(ca)表明病毒在25℃时生长为其在33℃的100倍之内，而术语“减毒”(att)表明病毒在雪貂的上呼吸道内复制但未在其肺组织中检测到，并且不在动物中引起流感样疾病。应理解，病毒具有中间表型，即病毒在39℃(对A株病毒)或37℃(对B株病毒)展现的减弱小于100倍，或在25℃时生长为33℃生长的100倍以上(如200倍内、500倍内、1000倍、少于10,000倍)，和/或与上气道相比，在雪貂肺中生长减弱(即部分减毒)和/或在动物中减弱的流感样疾病，也是有用的病毒并可与本文的HA和NA序列联用。
再次，任选将本发明的HA和NA序列用于生产重配病毒或用于重配病毒(和/或在其它ts、cs、ca和/或att病毒和疫苗)。然而，值得注意的是本发明中 的HA和NA序列等不限于特定疫苗组合物或生产方法，因此基本能用于使用病毒株特异性HA和NA抗原的任何疫苗类型或疫苗生产方法(如SEQ ID NO：11-20、27-32或39-44或编码特定HA和NA抗原的对应核苷酸，如SEQ ID NO：1-10、21-26、33-38或45中的任何)。
FluMist^TM
如前文所提到的，存在数种流感疫苗类型的例子。示范性流感疫苗是FluMist^TM，它是保护儿童和成人免受流感疾病侵袭的活减毒疫苗(Belshe等(1998)减毒、冷适应性、三价、鼻内流感病毒活疫苗在儿童中的功效(The efficacy of live attenuated，cold-adapted，trivalent，intranasal influenza virus vaccine in children)N Engl J Med338:1405-12；Nichol等(1999)减毒、鼻内流感病毒活疫苗在健康的有工作成年人中的有效性：随机对照试验(Effectiveness of live，attenuated intranasal influenza virus vaccine in healthy，working adults：a randomized controlled trial)JAMA282:137-44)。典型的优选实施方式中，本发明的方法和组合物优选适应/用于FluMist^TM疫苗生产。然而，应当被本领域熟练技术人员了解的是本文的序列、方法、组合物等也可用于生产相似或者甚至不同的病毒疫苗。
FluMist^TM疫苗病毒株包含起源于病毒株(如野生型病毒株)的HA和NA基因区段，疫苗还包含六个来自共有主供体病毒(MDV)的基因区段，即PB1、PB2、PA、NP、M和NS。因此本文的HA序列是不同的FluMist^TM制剂的一部分。FluMist^TM的甲型流感毒株的MDV(MDV-A)是在持续低温下在原代鸡肾组织培养物中连续传代野生型A/Ann Arbor/6/60(A/AA/6/60)病毒株所得(Maassab(1967)流感病毒在25摄氏度下的适应和生长特性(Adaptation and growth characteristics of influenza virus at25degrees C)Nature213:612-4)。MDV-A在25℃下有效复制(ca，冷适应性)，但在38℃和39℃下生长受限(ts，温度敏感)。此外，该病毒在感染雪貂的肺部不复制(att，减毒)。ts表型被认为通过限制除呼吸道最冷区域外病毒的复制使疫苗具有减毒性。该性质的稳定性已在动物模型及临床试验中展现。与化学诱变产生的流感株ts表型相反，MDV-A的ts特性不随在感染仓鼠中传代而回复也不在儿童的流出分离物中回复(近期的一篇综述，参见Murphy和Coelingh(2002)开发和使用减毒的冷适应 性甲型流感和乙型流感病毒活疫苗的原理(Principles underlying the development and use of live attenuatedcold-adapted influenza A and B virus vaccine)Virus Immunol15:295-323)。
在超过20,000个成人和儿童中进行关于12种分离6:2重配株的临床研究表明这些疫苗是减毒、安全有效的(Belshe等(1998)减毒、冷适应性、三价、鼻内流感病毒活疫苗在儿童中的功效(The efficacy of live attenuated，cold-adapted，trivalent，intrenasal influenza vaccine in children)N Engl J Med338:1405-12；Boyce等(2000)通过鼻内途径给予健康成年人的含佐剂和不含佐剂的亚基流感疫苗的安全性和免疫原性(Safety and immunogenicity of adjuvanted and unadjuvanted subunit influenza vaccine administered intranasally to healthy adults)Vaccine19:217-26；Edwards等(1994)用于预防甲型流感的冷适应性和灭活疫苗的随机对照试验(A randomized controlled trial of cold-adapted and inactivated vaccine for the prevention of influenza A disease)J Infect Dis169:68-76；Nichol等(1999)减毒、鼻内流感病毒活疫苗在健康的有工作成年人中的有效性：随机对照试验(Effectiveness of live，attenuated intranasal influenza vaccine in healthy，working adults：a randomized controlled trial)JAMA282:137-44)。携带MDV-A六个内部基因和野生型病毒两个HA和NA基因区段的重配病毒(即，6:2重配株)一向保持ca、ts和att表型(Maassab 等(1982)在雪貂中评价冷适应性流感疫苗(Evaluation of a cold-recombinant influenza vaccine in ferrets)J.Infect.Dis.146:780-900)。
使用乙型流感病毒株生产此类重配病毒要困难一些，然而，近期工作(参见例如，生产流感病毒的多质粒系统，2002年10月23日提交的美国申请号60/420,708，2003年4月25日提交的美国申请号10/423,828以及2004年5月24日提交的美国申请号60/574,117)展示了一个完全来自克隆cDNA的用于产生乙型流感病毒的八质粒系统。用于产生减毒甲型和乙型流感活病毒的方法适用于疫苗制剂，如为人熟知的用于鼻内给药的活病毒疫苗制剂。
前述系统和方法可用于在细胞培养物中快速生产重组和重配的甲型和乙型流感病毒，包括适合用作疫苗的病毒，包括减毒的活疫苗，如合适鼻内给药的疫苗。本发明中的序列(如，核苷酸序列SEQ ID NO：1-10、21-26、33-38 或45及核苷酸序列编码的对应氨基酸SEQ ID NO：11-20，27-32或39-44)、方法等任选与先前工作涉及的，例如用于疫苗生产的重配流感病毒一起或联合使用，以生产疫苗用病毒。
用于预防性疫苗给药的方法和组合物
如上所述或除了用于生产FluMist^TM疫苗外，本发明还可用于其它疫苗制剂。通常，本发明重组和重配病毒(如，包含多核苷酸SEQ ID NO:1-10、21、23-26、33-38或45或多肽SEQ ID NO:11-20、27-32或39-44，或其片段的病毒)可以免疫有效量并在合适载体赋形剂中预防性给药以刺激对于一种或多种流感病毒株的特异性免疫应答，这些流感病毒株由HA和/或NA序列决定。通常，载体或赋形剂为药学上可接受的载体或赋形剂，如灭菌水、盐水溶液、缓冲盐水溶液、右旋糖水溶液、甘油水溶液、乙醇或其组合。根据本领域确定的实验方法能够有效制备此类溶液并确保无菌、pH、等渗和稳定性。通常，选择载体或赋形剂以尽量减少过敏和其它不需要的反应，并适合于特定的给药途径，如皮下、肌肉内、鼻内等。
本发明的一个相关方面提供了刺激个体免疫系统产生对抗流感病毒的保护性免疫应答的方法。在方法中，用在生理上可接受载体中的重组流感病毒(如，含有本发明HA和/或NA分子)的免疫有效量、本发明多肽的免疫有效量和/或本发明核酸的免疫有效量进行给药。
通常，以足以刺激对一种或多种流感病毒株(即，本发明的HA和/或NA病毒株)应答的量给予本发明的流感病毒。优选给予流感病毒引起对此类病毒株的保护性免疫应答。本领域熟练技术人员了解引起对于一种或多种流感病毒株的保护性免疫应答的剂量和方法。参见例如，USPN5,922,326；Wright等，Infect.Immun.37:397-400(1982)；Kim等，Pediatrics52:56-63(1973)；和Wright等，J.Pediatr.88:931-936(1976)。例如，每剂量提供约1-1000HID₅₀(人有效剂量)，即约10⁵-10⁸pfu(空斑形成单位)流感病毒进行给药。通常，根据如年龄、身体条件、体重、性别、饮食、给药时间和其它临床因素在范围内调整剂量。全身给予预防性疫苗制剂，如利用针和注射器或无针装置进行皮下或肌肉内注射。或者鼻内给予疫苗制剂，通过滴剂、大颗粒气溶胶(大于约10微米)，或喷入上呼吸道。尽管上述任何途径均引起保护性系统免疫应答，但鼻内给药的另 一益处是引起流感病毒进入位置的黏膜免疫。对于鼻内给药，经常优选减毒活病毒疫苗，如，减毒、冷适应性和/或温度敏感型重组或重配流感病毒。参见上文。尽管优选单次给药刺激保护性免疫应答，但也可通过相同或不同途径给予额外剂量，以达到所需预防效果。
通常，在疫苗中的本发明减毒重组流感(病毒)充分减毒，因此感染症状，至少严重感染症状不会在大多数减毒流感病毒免疫的(或由于另外因素感染的)个体中发生。在一些例子中，减毒流感病毒仍能够产生轻度疾病症状(如轻度上呼吸疾病)和/或传染未接种疫苗的个体。然而，其毒性充分消减，因此并不会在接种或随机宿主体内发生严重的下呼吸道感染。
或者，利用含有本文序列的流感病毒离体或体内靶向树突细胞刺激免疫应答。例如，使树突细胞暴露于足够量的病毒足够长的时间以使树突细胞捕获流感抗原。然后利用标准静脉内移植方法将该细胞转移到要接种的个体中。
尽管优选单次给药刺激保护性免疫应答，但也可通过相同或不同途径给予额外剂量，以达到所需预防效果。例如在婴幼儿中，也许需要多次给药引发足够水平的免疫。为了维持足够水平对抗野生型流感感染的防护，可在整个儿童期持续间隔给药。同样，对重复或严重流感感染尤其易感的成人，例如，健康工作者、护工、幼年儿童的家庭成员、老年人以及心肺功能受损的个体也许需要多次免疫以建立和/或维持保护性免疫应答。可监测诱导免疫的水平，如通过测定分泌和血清抗体的量，并且根据需要调整剂量和重复接种以引发并维持所需水平的保护。
任选地，预防性给予流感病毒的制剂也含有一种或多种佐剂，以提高对流感抗原的免疫应答。合适的佐剂包括：完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、皂苷、矿物凝胶如氢氧化铝、表面活性物质如溶血卵磷脂、复合多元醇、聚阴离子、肽、油或烃乳剂、卡介苗(BCG)，短小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)和合成佐剂QS-21。
根据需要，流感病毒的预防性疫苗给药可与一种或多种免疫刺激分子偶联操作。免疫刺激分子包括具有免疫刺激、免疫增效和预刺激活性的各种细胞因子、淋巴因子和趋化因子，如白介素(如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-12、IL-13)；生长因子(如粒细胞-巨噬细胞(GM)-集落刺激因子(CSF))；和其它免疫刺激分 子，如巨噬细胞炎症因子、Flt3配体、B7.1、B7.2等。免疫刺激分子可在与流感病毒同样的制剂中给药，或者独立给药。可用蛋白(如本发明的HA和/或NA多肽，如SEQ ID NO：11-20、27-32或39-44中任何一个)或含有编码蛋白的核酸的表达载体(如SEQ ID NO：1-10、21-26、33-38或45任何一个)给药以产生免疫刺激效应。
上述方法可用于通过体外、离体或体内将含有编码治疗或预防有效的HA和/或NA多肽(或肽)或HA和/或NA RNA(如反义RNA或核酶)的异源多核苷酸的本发明载体引入靶细胞群，以便治疗性和/或预防性治疗疾病或失调，通常是流感。通常，编码感兴趣多肽(或肽)或RNA的多核苷酸可操作性连接于合适的调节序列，如上文名为“表达载体”和“附加表达原件”部分所述。任选地，可将一种以上异源编码序列插入单一载体或病毒。例如，除了编码治疗或预防有效的活性HA和/或NA多肽或HA和/或RNA的多核苷酸外，该载体还可包含其它治疗性或预防性多肽，如抗原、共刺激分子、细胞因子、抗体等和/或标记物等。
尽管利用特定亚组的特定病毒株的减毒流感病毒接种个体能诱导对于不同病毒株和/或亚组的交叉防护，如果需要可利用来自至少两个病毒株的减毒流感病毒(如各自代表不同的亚组)接种个体。此外，疫苗组合可任选包括大流行疫苗(如对抗大流行株如各种禽类病毒株(参见例如，本文序列)或其它大流行病毒株的疫苗)和非大流行病毒株的混合物。疫苗混合物(多重疫苗)能包含来自人病毒株和/或非人(如禽类和人类等)流感株的组分。同样，本发明的减毒流感病毒疫苗能任选与诱导对抗其它感染剂的保护性免疫应答的疫苗组合。
本发明的多核苷酸
本领域众所周知流感病毒HA和NA多核苷酸区段包含编码区(编码ORF)和非编码区(NCR)，以及HA和NA编码序列的5’和3’。这些NCR的一个例子是SEQ ID NO:1-9所示NCR(ORF外部)。同样知道的是可制造这些NCR的引物以利于扩增流感病毒整个HA和NA区段。(参见例如，Hoffmann等，Arch Virol.2001年12月；146(12)：2275-89)。此外，还知道流感的HA和NA的NCR可增加所得重配株的效率。因此，这些NCR的多核苷酸序列(包括片段及其变体(如至少约60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少约91％ 或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约98.5％、或至少约98.7％、或至少约99％、或至少约99.1％、或至少约99.2％、或至少约99.3％、或至少约99.4％、或至少约99.5％、或至少约99.6％或至少约99.7％、或至少约99.8％、或至少约99.9％相同))在本发明的范围之内。当扩增任何大流行病毒株HA和NA区段时，可制造并使用多核苷酸引物与HA和NA NCR的保守区(在相关病毒株中保守)结合，以便扩增(如通过RT-PCR)。在一个实施方式中，本发明的HA和NA多核苷酸包含大流行病毒株HA和NA序列的NCR和ORF(包括片段及其变体(如至少约60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少约91％或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约98.5％、或至少约98.7％、或至少约99％、或至少约99.1％、或至少约99.2％、或至少约99.3％、或至少约99.4％、或至少约99.5％、或至少约99.6％或至少约99.7％、或至少约99.8％、或至少约99.9％相同))。在另一个实施方式中，本发明的HA和NA多核苷酸不包含NCR，但包含大流行病毒株HA和NA序列(如SEQ ID NO：1-9)的ORF(包括片段及其变体(如至少约60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少约91％或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约98.5％、或至少约98.7％、或至少约99％、或至少约99.1％、或至少约99.2％、或至少约99.3％、或至少约99.4％、或至少约99.5％、或至少约99.6％或至少约99.7％、或至少约99.8％、或至少约99.9％相同))。
本发明的HA和NA多核苷酸，如SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:21至SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:33至SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:45及其片段，可任意用于产生数种不同能力(capacity)，作为用于上述疫苗的备选或补充。本文所述其它示范性用途仅出于说明目的而非为了限制实际使用范围。本文也描述构建、纯化和鉴定核苷酸序列的不同方法。在一些实施方式中，含有本发明一种或多种多核苷酸序列的核酸易于用作监测不同环境中对应或相关核酸的探针，这些环境包括例如，核酸杂交实验，如为了寻找和/或鉴定感染其它种属或在不同流感爆发中(等)的同源流感变体(如，与本文序列同源等)。 探针可为DNA或RNA分子，如基因组的限制性片段或克隆DNA、cDNA、PCR扩增产物、转录子和寡核苷酸，并且长度可从短至约10个核苷酸的寡核苷酸到长至超过1kb甚至更长的全长序列或cDNA。例如，在一些实施方式中，本发明的探针包括所选的多核苷酸序列或亚序列，如选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：10、SEQ ID NO:21至SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:33至SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:45或其互补序列。或者，使用上述指定序列之一变体的多核苷酸序列作为探针。最通常的，此类变体包含一个或数个保守核苷酸变化。例如，选择数对(或数套)寡核苷酸，其中两个(或更多)多核苷酸序列彼此保守性变异，其中一个多核苷酸序列完全对应第一个变体或，且其它多核苷酸序列完全对应剩余变体。此类寡核苷酸探针对尤其有用，如，用于特异性杂交实验以探测多态性核苷酸或探测同源性流感HA和NA变体，如与当前HA和NA序列同源的变体，感染其它种属或在不同流感爆发(时间和/或地理上不同)中出现的变体。在其它应用中，选择更离散的探针即选择至少约91％(或约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约98.5％、约98.7％、约99％、约99.1％、约99.2％、约99.3％、约99.4％、约99.5％或约99.6％或多于约99.7％、约99.8％、约99.9％或更多)相同的探针。
本发明的探针，例如衍生自本文序列的序列，根据本领域常规步骤也可用于识别其它有用的多核苷酸序列。在一套实施方式中，如上所述，用一个或多个探针筛选产物表达文库或染色体区段文库(如表达文库或基因组文库)以鉴别包含与本文序列的一个或多个探针序列相同或序列显著相似的克隆，即变体、同源物等。应被理解的是除了如文库筛选的物理方法外，计算机辅助的生物信息学手段，如BLAST和其它序列同源性搜索算法等，也能用于鉴定相关多核苷酸序列。以此方式鉴定的多核苷酸序列也是本发明特征。
任选通过本领域熟练技术人员熟知的数种方法生产寡核苷酸探针。最典型的是，利用熟知的合成方法，如Beaucage和Caruthers(1981)Tetrahedron Letts 22(20):1859-1862所述固相亚磷酰胺三酯方法，如使用自动合成仪或如Needham-Van Devanter等(1984)Nucl Acids Res，12:6159-6168所述制造。也可定制寡核苷酸或从本领域技术人员熟知的商品来源订购。当需要纯化寡核苷酸时，一般进行非变性(nature)丙烯酰胺凝胶电泳或通过阴离子交换HPLC，如 Pearson和Regnier(1983)J Chrom255:137-149所述。可根据Maxam和Gilbert(1980)在Grossman和Moldave(编)纽约科学出版社，《酶学方法》(Methods in Enzymology)65:499-560所述化学降解方法来验证合成寡核苷酸的序列。也可方便从多个熟练技术人员所知的商业来源订购定制的寡核苷酸。
在其它情况下，如关于表达本发明多核苷酸和多肽的细胞或生物体(如，带有包含本发明序列病毒的那些)，方便使用多肽、肽或抗体探针。例如，源于本发明任何氨基酸序列(如SEQ ID NO：11-20、SEQ ID NO：27-32、SEQ ID NO:39-44)的分离或重组多肽、多肽片段和肽和/或由本发明多核苷酸序列，如选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：21至SEQ ID NO：26、SEQ ID NO:33至SEQ ID NO:38以及SEQ ID NO:45编码的多肽或多肽片段易于用于鉴定和分离噬菌体展示文库、组合文库、多克隆血清等中的抗体。本发明的多肽片段包含肽或多肽，其氨基酸序列包含本发明HA或NA多肽的氨基酸序列(如SEQ ID NO：11-20、SEQ ID NO：27-32和SEQ ID NOS：39-44)的至少5个毗连氨基酸残基，或至少10个毗连氨基酸残基，或至少15个毗连氨基酸残基，或至少20个毗连氨基酸残基，或至少25个毗连氨基酸残基，或至少40个毗连氨基酸残基，或至少50个毗连氨基酸残基，或至少60个毗连氨基酸残基，或至少70个毗连氨基酸残基，或至少80个毗连氨基酸残基，或至少90个毗连氨基酸残基，或至少100个毗连氨基酸残基，或至少125个毗连氨基酸残基，或至少150个毗连氨基酸残基，或至少175个毗连氨基酸残基，或至少200个毗连氨基酸残基，或至少250个毗连氨基酸残基，或至少350个，或至少400个，或至少450个或至少500个，或至少550个毗连氨基酸残基。本发明的实施方式中优选编码特异性与所述多肽结合的所述多肽片段和抗体的多核苷酸。
对任何多肽序列或亚序列，如SEQ ID NO：11至SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：27至SEQ ID NO：32和/或SEQ ID NO：39至SEQ ID NO：44，和/或本发明多核苷酸序列，如SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：21至SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：33至SEQ ID NO：38和SEQ ID NO:45编码的多肽序列或亚序列特异的抗体同样具有作为评价细胞或组织中表达产物的探针的价值。此外，抗体尤其适用于在组织阵列，细胞、组织或生物体中， 如被未知流感病毒或类似感染的生物体中，原位评价含有氨基酸亚序列的蛋白质(如本文给出的那些)或由本发明多核苷酸序列(如选自本文所示的那些)编码的蛋白质的表达。可用检测试剂直接标记抗体，或用特定抗体的重链恒定区(即同种型)特异性第二抗体进行标记以便间接检测。下文提供了关于产生特异性抗体的另外的细节。
诊断实验
可在诊断实验中使用本发明的核酸序列检测样品中的流感病毒(和/或血凝素和/或神经氨酸酶)、检测血凝素样和/或神经氨酸酶样序列、利用如选自本文序列的化学合成或重组的多核苷酸片段检测流感临床分离物中病毒株差异。例如，可将含有至少10-20个核苷酸的血凝素和/或神经氨酸酶序列片段用作引物以使用本领域熟知聚合酶链反应(PCR)(如逆转录PCR)方法扩增核酸，或者用作核酸杂交实验中的探针以检测临床标本中的靶遗传物质，如流感RNA。
本发明的探针，如本文给定的那些独特亚序列，根据本领域常规步骤也能用于鉴定其它有用的多核苷酸序列(如鉴定其它流感株)。在一套优选实施方式中，使用如上所述的一个或多个探针筛选表达产物文库和克隆病毒核酸文库(即，表达文库或基因组文库)以鉴定包含与本文序列相同或具有显著相同性的序列的克隆。然后这些鉴定的序列各自可用于制造探针，包括如上所述的成对或成套的变体探针。应被理解的是除了如文库筛选的物理方法外，计算机辅助的生物信息学手段，如BLAST和其它序列同源性搜索算法等，也能用于鉴定相关多核苷酸序列。
本发明的探针在用于检测细胞、组织或其它生物样品(如鼻腔洗液或支气管灌洗液)中流感病毒的存在或测定其相同性中尤其有用。例如，本发明的探针有助于测定生物样品，如个体(如人个体)或模型系统(如培养细胞样品)是否暴露于或已经被流感或特定流感株感染。检测所选探针与源于(或分离自)生物样品或模型系统的核酸的杂交情况可指示是否暴露于或受到探针多核苷酸选自的病毒(或相关病毒)的感染。
应当被理解的是探针设计受到目的应用的影响。例如，在单一实验，如单一DNA芯片中，检测数个等位基因特异性探针靶点相互作用时，需要所有的探针具有相近的解链温度。因此，调整探针的长度使阵列上所有探针的解链温 度接近相同(应当被理解的是当不同探针的GC含量不同时，需要使不同探针长度不同以达到特定的T_m)。尽管解链温度是探针设计中首先考虑的因素，但可任选使用其它因素进一步调整探针构建，如选择抗引物自身互补等。
载体，启动子和表达系统
本发明包括整合本文一个或多个核酸序列的重组构建物。此类构建物任选包括载体，例如质粒、粘粒、噬菌体、病毒、细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)等，其中正向或反向插入本发明一个或多个多核苷酸序列，如包含SEQ ID NO：1至SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:21至SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:33至SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:45中任何一个或其亚序列等的多核苷酸序列。例如，插入的核酸能包含含有至少一个本发明多核苷酸序列的全部或一部分的病毒染色体序列或cDNA。在一个实施方式中，构建物还包括与序列操作性连接的调节序列，包括例如启动子。本领域技术人员知道大量合适的载体和启动子，并可商业购得。
本发明的多核苷酸可包含于数种适合产生正义或反义RNA，以及任选地产生多肽(或肽)表达产物(如，本发明血凝素和/或神经氨酸酶分子或其片段)的载体中。此类载体包括染色体、非染色体和合成DNA序列，如SV40衍生物；细菌质粒；噬菌体DNA；杆状病毒；酵母质粒；衍生自质粒和噬菌体DNA的组合，病毒DNA如牛痘、腺病毒、禽痘病毒、狂犬病毒、腺病毒、腺伴随病毒、逆转录病毒等(如pCDL)。可使用任何能够将遗传物质引入细胞并且能够在相关宿主中复制(如果需要的话)的载体。
在表达载体中，感兴趣的HA和/或NA多核苷酸序列物理排布接近并朝向合适的转录控制序列(如启动子，任选地，一个或多个增强子)以指导mRNA合成。也就是说，感兴趣的多核苷酸序列可操作性连接于合适的转录控制序列。此类启动子的例子包括：LTR或SV40启动子、大肠杆菌lac或trp启动子、噬菌体λP_L启动子及其它知道可控制原核或真核细胞或其它病毒中基因表达的启动子。
数种启动子可用于表达载体中，以调节流感病毒基因组区段转录。在某些实施方式中，使用巨细胞病毒(CMV)DNA依赖性RNA聚合酶II(Pol II)启动子。如果需要如条件控制表达，可替换使用其它可在特定条件下、或特定组织和细 胞中，诱导DNA转录的启动子。可用数种病毒和哺乳动物，如人的启动子，或者根据预期特定应用分离。例如，获自动物和人病毒基因组的候选启动子包括此类启动子，如腺病毒(如腺病毒2)、乳头瘤病毒、乙肝病毒、多瘤病毒以及猿病毒40(SV40)和不同逆转录病毒的启动子。哺乳动物启动子包括肌动蛋白启动子、免疫球蛋白启动子、热休克启动子等。
任选地，可通过包含增强子序列增强转录。增强子通常较短，如，10-500bp，它是与启动子配合作用以增加转录的顺式作用DNA原件。从哺乳动物基因(血红蛋白、弹性蛋白酶、清蛋白、甲胎蛋白和胰岛素)和真核细胞病毒中分离了许多增强子序列。可将增强子序列剪接到载体中异源编码序列的5'或3'位置，但通常插入启动子的5'位点。通常，选择启动子和其它转录增强序列(若需要)以优化异源DNA在引入宿主细胞中的表达(Scharf等(1994)热应力启动子和转录因子(Heat stress prompter and transcription factors)Results Probl Cell Differ20:125-62；Kriegler等(1990)组装增强子、启动子和剪接信号以控制转移基因的表达(Assembly of enhancers，promoter,and splice signals to control expression of transferred gene)Methods in Enzymol185：512-27)。任选地，为了启动转录，扩增子也可包含核糖体结合位点或内部核糖体进入位点(IRES)。
本发明的载体也包含终止转录和稳定mRNA所需的序列，如聚腺苷酸化位点或终止序列。此类序列一般位于真核或病毒DNA或cDNA非翻译区的5'末端，偶尔位于3'末端。在一个实施方式中，SV40聚腺苷酸化信号序列能提供双向聚腺苷酸化位点，它从启动(-)链病毒基因组复制的PolI启动子隔离了(+)链mRNA分子的转录。
此外，如上所述，表达载体任选包含一个或多个选择性标记物基因以提供用于筛选转化宿主细胞的表型特征，除了以前列出的基因，诸如二氢叶酸还原酶或新霉素抗性等标记物可用于真核细胞培养物的选择。
含有如上所述的合适核酸序列以及合适的启动子或控制序列的载体，可用于转化允许蛋白表达的宿主细胞。虽然本发明的载体可在细菌细胞中复制，但最经常需要将其引入哺乳动物细胞，如Vero细胞、BHK细胞、MDCK细胞、293细胞、COS细胞等用于表达。
如其它地方所述，在各种实施方式中，本文HA和NA序列可包含于参与 质粒拯救重配的质粒之中。参见例如，2002年10月23日提交的美国申请号60/420,708；2004年5月24日提交的60/574,117；2003年4月25日提交的10/423,828；2004年6月12日提交的60/578,962；和2004年6月24日提交的10/870,690以及US20020164770，纳入本文作为参考。例如，本发明优选的表达载体包括但不限于：含有pol I启动子和终止子序列的载体或使用pol I和pol II启动子“polI/polII启动子系统”的载体(如，Zobel等，Nucl.Acids Res.1993，21:3607；US20020164770；Neumann等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1999，96:9345；Fodor等，J.Virol.1999，73:9679；和US20030035814)。产生的重配株可包含HA和NA基因与排列在一起的来自A/Ann Arbor/6/60供体病毒株(和/或其衍生物及修饰形式)、PR8供体病毒株主体、A/Leningrad/17供体病毒株主体的6个其它流感基因。其它主体病毒株在如20040137013和20030147916中有描述，纳入本文作为参考。
其它表达元件
最常见的，编码流感病毒HA和/或NA蛋白的基因组区段包含其表达、包括翻译为功能性病毒蛋白质所必需的任何其它序列。在其它情况下，可使用编码病毒蛋白如HA和/或NA蛋白的小基因或其它人工构建物。再次，在此类情况下，常常需要包括有助于异源编码序列有效翻译的特定起始信号。这些信号能包括如，ATG起始密码子和相邻序列。为了保证整个插入子的翻译，将起始密码子插入到病毒蛋白正确的阅读框中。外源性转录原件和起始密码子可为不同来源，天然和合成均可。在所用细胞系统中包含合适的增强子可增强表达效率。
如果需要，可将编码其它表达原件如信号序列、分泌或定位序列等的多核苷酸序列掺入载体中，通常与感兴趣的多核苷酸序列在同一阅读框内，以便(例如)使多肽靶向表达于所需细胞隔室、膜或细胞器中，或指导多肽分泌至周质空间或细胞培养基中。本领域技术人员了解此类序列，包括分泌前导肽、细胞器靶向序列(如核定位序列、ER驻留信号、线粒体转运序列序列)，膜定位/锚定序列(如终止转运序列、GPI锚定序列)等。
当需要翻译本发明核酸序列编码多肽时，其它翻译特异性起始信号可提高翻译效率。这些信号能包括，如，ATG起始密码子和相邻序列、IRES区等。 在一些情况下，例如，含有掺入本发明多核苷酸序列(如在本文序列中)、翻译起始密码子和相关序列元件的编码序列的全长cDNA分子或染色体区段与感兴趣多核苷酸序列同时插入合适的表达载体。在这些情况下，通常无需其它翻译控制信号。然而，当仅插入多肽编码序列或其部分的情况下，常常提供外源性翻译控制信号，包括如ATG起始密码子用于相关序列的表达。将起始密码子置于合适的阅读框中以保证感兴趣多核苷酸序列的转录。外源性转录原件和起始密码子的来源可以不同，天然和合成均可。通过包含对所用细胞体系合适的增强子可增强表达效率(参见例如，Scharf D.等(1994)Results Probl Cell Differ20:125-62；Bittner等(1987)Methods in Enzymol153:516-544)。
生产重组病毒
利用重组反向遗传学手段可遗传工程改造并回收负链RNA病毒(参见例如，Palese等的USPN5,166,057)。起初此类方法用于工程改造病毒基因组(Luytjes等(1989)Cell59:1107-1113；Enami等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA92:11563-11567)并被成功应用于各种区段化和非区段化负链RNA病毒，如狂犬病病毒(Schnell等(1994)EMBO J.13：4195-4203)；VSV(Lawson等(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA92：4477-4481)；麻疹病毒(Radecke等(1995)EMBO J.14:5773-5784)；牛瘟病毒(Baron和Barrett(1997)J.Virol.71：1265-1271)；人副流感病毒(Hoffman和Banerjee(1997)J.Virol.71：3272-3277；Dubin等(1997)Virology235:323-332)；SV5(He等(1997)Virology237:249-260)；犬瘟病毒(Gassen等(2000)J.Virol.74:10737-44)；和仙台(Sendai)病毒(Park等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：5537-5541；Kato等(1996)Genes to Cells 1:569-579)。本领域技术人员将熟悉这些制造含本发明HA和NA序列流感病毒的方法及类似方法。根据此类方法制造的重组流感病毒就像含有本发明的一种或多种核酸和/或多肽的重组流感病毒一样，也是本发明的特点。
细胞培养和表达宿主
本发明也涉及引入(转导、转化和转染)本发明载体的宿主细胞，和利用重组技术产生本发明的多肽。利用本发明载体，如表达载体遗传学工程改造宿主细胞(即转导、转化或转染)。如上所述，载体可为质粒、病毒颗粒、噬菌体等的形式。合适的表达宿主的例子包括：细菌细胞，如大肠杆菌(E.coli)、链霉菌 (Streptomyces)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)；真菌细胞，如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)和粗糙链孢霉(Neurospora crassa)；或昆虫细胞如果蝇(Drosophila)和草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)。
最常见的，使用哺乳动物细胞培养本发明的HA和NA分子。流感病毒复制的合适宿主细胞包括，如Vero细胞、BHK细胞、MDCK细胞、293细胞和COS细胞，包括293T细胞、COS7细胞或类似细胞。通常，使用一定比例如1:1的两种上述细胞系的共培养物，如MDCK细胞和293T或COS细胞，以提高复制效率。通常，在标准商品化培养基中培养细胞，如在添加血清(如10％胎牛血清)的杜氏改良的易购氏培养基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)，或在无血清培养基中，在保持中性缓冲pH(如pH在7.0-7.2)的受控湿度和CO₂浓度下培养。任选地，培养基包含阻止细菌生长的抗生素，如青霉素、链霉素等，和/或补充营养物，如L-谷胺酰胺、丙酮酸钠、非必需氨基酸等，以及利于促进生长特性的其它补充剂，如胰蛋白酶、β-巯基乙醇等。
工程改造的宿主细胞可在根据激活启动子、选择转化子或扩增插入多核苷酸序列的需要改良的营养培养基中培养。如温度、pH等培养条件通常为所选用于表达的特定宿主细胞先前培养所使用的条件，并为本领域熟练技术人员所熟悉并在本文引用的参考文献中，包括如，Freshney(1994)《动物细胞培养，基本技术手册》(Culture of Animal Cells，a Manual of Basic Technique)，第3版，纽约韦利-李斯出版社(Wiley-Liss)及其引用文献。其它有用的参考文献包括，如，Paul(1975)《细胞和组织培养》(Cell and Tissue Culture)，第5版，爱丁堡利文斯顿出版社；Adams(1980)《生物化学与分子生物学实验室技术-生化学家细胞培养》(Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Cell Culture for Biochemists)，Work和Burdon编，阿姆斯特丹埃斯威尔出版社。关于体外产生流感病毒尤感兴趣的组织培养步骤的其它细节包括，如Merten等(1996)在细胞培养物中生产流感病毒用于疫苗制备(Production of Influenza virus in cell cultures for vaccine preparation)Cohen和Shafferman编《设计和生产疫苗的新策略》(Novel Strategies in Design and Production of Vaccine)，出于所有目的将其整体纳入本文。此外，易于通过常规实验确定并且本领域技术人员熟 知此类步骤适合本发明的改变。
用于生产流感病毒(如具有本发明HA和/或NA序列)的细胞能在含血清或无血清培养基中培养。在一些情况下，如用于制备纯化病毒时，尤其需要细胞在无血清条件下生长。可小规模培养细胞，如，少于25ml培养基，培养管或瓶中或在大瓶中震荡培养，在滚瓶中培养，或在培养瓶、瓶或反应器培养物中的微载体珠上(如，DEAE-右旋糖苷微载体珠，如灰鹤和朗更公司的多玛萨尔(Dormacell，Pfeifer and Langen)；弗洛实验室公司的超级珠(Superbead，Flow Laboratories)；苯乙烯共聚三甲胺珠，如希尔莱克斯、所咯希尔、安阿伯(Hillex，SoloHill，Ann Arbor))上培养。微载体珠是为每体积贴壁细胞培养物提供更大表面积的小球(直径范围为100-200微米)。例如一升培养基能包含2千万个微载体珠，这些珠提供了超过8000平方厘米的生长表面。商业病毒生产，如为了生产疫苗，经常需要在生物反应器或发酵罐里培养细胞。生物反应器容积从1升至超过100升，如，Cyto3生物反应器(奥斯莫里卡公司，明尼苏达州明内通卡市(Osmonics，Minnetonka，MN))；NBS生物反应器(新不伦瑞克科学公司，新泽西州埃迪逊市(New Brunswick Scientific，Edison，NJ))；来自布朗生物技术国际公司(布朗生物技术公司，德国迈尔苏金(B.Braun Biotech，Melsungen，Germany))的实验室和商业规模的生物反应器。
不考虑培养体积，在本发明的许多所需方面，重要的是保持培养物合适温度以保证利用温度依赖的多质粒系统(参见例如，用于生产流感病毒的多质粒系统，2002年10月23日提交的美国申请号60/420,708，2003年4月25日提交的美国申请号10/423,828以及2004年5月24日提交的美国申请号60/574,117)有效回收重组和/或重配流感病毒并加热病毒溶液进行过滤等。通常使用调节器，如自动调温装置或其它感受并维持细胞培养体系和/或其它溶液温度的设备以确保合适时期(如病毒复制等)温度处于正确水平。
在本文的一些实施方式中(如其中从载体区段制造重配病毒)，根据本领域熟知的将异源核酸引入细胞的方法将含有流感基因组区段的载体引入(如转染)宿主细胞，这些包括例如，磷酸钙共沉淀、电穿孔、显微注射、脂转染和使用聚胺转染试剂的转染。例如，可将载体，如质粒转染入宿主细胞，如COS细胞、293T细胞或COS或293T细胞和MDCK细胞的混合物，根据制造商指导 手册利用聚胺转染试剂TransIT-LT1(密如斯公司(Mirus))生产重配病毒等。因此，在一个实施例中，用160μl培养基(优选无血清培养基)稀释的约2μlTransIT-LT1将每一载体各约1μg引入一群宿主细胞中，总体积是200μl。在室温下将DNA:转染试剂混合物孵育45分钟然后加入800μl培养液。将转染混合物加入宿主细胞，通过本领域熟练技术人员所熟知的其它方法培养细胞。因此，为了在细胞培养物中生产重组或重配病毒，将各自掺入8个基因组区段(如本发明PB2、PB1、PA、NP、M、NS、HA和NA)的载体与约20μl TransIT-LT1混合并转染进入宿主细胞。任选地，在转染前用无血清培养基如Opti-MEM I替换含血清的培养基，并孵育4-6小时。
或者，可使用电穿孔将此类掺入流感基因组区段的载体引入宿主细胞。例如，根据下述步骤利用电穿孔将掺入甲型流感或乙型流感病毒的质粒载体引入Vero细胞。简要说，如生长于含10％胎牛血清(FBS)的改良易购氏培养基(Modified Eagle’s Medium(MEM))的约5x10⁶Vero细胞重悬于0.4ml OptiMEM中并置于电穿孔杯中。将体积多至25μl的20微克DNA加入杯中的细胞，轻拍以温和混匀。根据厂商指导手册进行电穿孔(如，连接电容延长器(Capacitance Extender Plus)的伯乐基因脉冲仪II)，300伏，950微法拉，恒定时间28-33毫秒。轻拍细胞混匀并在电穿孔后约1-2分钟直接在杯中加入含10％FBS的0.7mlMEM。将细胞转移至标准6孔组织培养板的两个含2ml MEM，10％FBS的孔中。洗涤电击杯回收任何剩余细胞并将洗涤悬液在两孔间平分。终体积约为3.5mL。然后在允许病毒生长的条件下，如对于冷适应性病毒株在33℃，孵育细胞。
在哺乳动物宿主细胞中，可使用数种表达系统，如基于病毒的系统。当使用腺病毒作为表达载体时，任意将编码序列连接到含晚期启动子和三重前导序列的腺病毒转录/翻译复合物中。插入病毒基因组非必需E1和E3区将得到在感染宿主细胞中能表达感兴趣多肽的活病毒(Logan和Shenk(1984)Proc NatlAcad Sci81:3655-3659)。此外，可使用转录增强子，如劳氏肉瘤病毒(RSV)增强子增加在哺乳动物宿主细胞中的表达。
可任选能调节插入序列的表达或以所需方式加工表达蛋白的宿主细胞株。此类蛋白修饰包括但不限于：乙酰化、羧基化、糖基化、磷酸化、脂化和酰基 化。将前体形式切割为成熟形式的蛋白翻译后加工对于正确的插入、折叠和/或功能有时重要。此外，在宿主细胞中的位置(如在细胞表面)也很重要。不同的宿主细胞，如COS、CHO、BHK、MDCK、293、293T、COS7等，对于此类转录后活动具有特定的细胞机器和特有机制，可对细胞进行选择以保证当前引入外来蛋白的正确修饰和加工。
对于本发明多核苷酸或其亚序列编码的重组蛋白的长期高产率生产而言，任选使用稳定表达系统。例如，利用含病毒来源的复制或内源性表达原件和选择性标记物基因的表达载体转化稳定表达本发明多肽的细胞系。例如，在引入载体之后，在富集培养基中培养细胞1-2天后转移至选择性培养基中。选择性标记物的目的是产生选择抗性，它的存在允许成功表达引入序列的细胞生长和恢复。因此，如源于单一细胞类型的稳定转化抗性细胞团可利用适合细胞类型的合适组织培养技术扩增。
可在适合表达和从细胞培养物中回收编码蛋白的条件下任意培养被编码本发明多肽的核苷酸序列转化的宿主细胞。对表达所述蛋白的细胞进行分选、分离和/或纯化。根据序列(如取决于编码膜滞留信号或其它的融合蛋白)和/或使用的载体，重组细胞产生的蛋白或其片段可为分泌的、膜结合的或胞内滞留的。
本发明核酸对应的表达产物也能在非动物细胞，如植物、酵母、真菌、细菌等中产生。除了Sambrook，Berger和Ausubel(参见下文)以外，关于细胞培养的细节可参见Payne等(1992)《在液体系统中的植物细胞和组织培养》(Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems)约翰韦利森出版公司(John Wiley&Sons，Inc.)，纽约；Gamborg和Phillips编(1995)《植物细胞、组织和器官培养；施普林格实验室基本方法手册》(Plant Cell，Tissue and Organ Culture；Fundamental Methods Springer Lab Manual)，施普林格弗莱格公司(Springer-Verlag)(纽约柏林海德尔堡)和Atlas和Parks编《微生物培养基手册》(The Handbook of Microbiological Media)(1993)CRC出版社，佛罗里达州伯克莱屯(Boca Raton，FL)。
在细菌系统中，根据表达产物的用途目的可选择数种表达载体。例如，当生产抗体需要大量多肽或其片段时，优先使用指导易于大量表达纯化蛋白的载体。此类载体包括但不限于：多功能大肠杆菌克隆和表达载体，如 BLUESCRIPT(司查塔基公司(Stratagene))，其中感兴趣的编码序列，如含有本文那些序列等的编码序列，可连接入载体并与β-半乳糖苷酶的氨基端翻译起始甲硫氨酸和后续7个残基的序列在同一读框内，产生有催化活性的β半乳糖苷酶融合蛋白；pIN载体(Van Heeke和Schuster(1989)J Biol Chem264:5503-5509)；pET载体(威斯康星麦迪逊的诺华基公司(Novagen，Madison WI))等。同样，在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，可使用数种含有组成型或诱导型启动子如α因子、醇氧化酶和PGH的载体产生所需表达产物。参见Ausubel，同上，和Grant等，(1987)；《酶学方法》(Methods in Enzymology)153:516-544的综述。
核酸杂交
可使用比较性杂交鉴定本发明的核酸(如SEQ ID NO：1-10、SEQ ID NO：21-26、SEQ ID NO:33-38、SEQ ID NO:45)，包括本发明核酸的保守性变异。比较性杂交法是区别本发明核酸的优选方法。此外，在高、超高和超超高严谨性条件下与如本文所示代表的核酸杂交的靶核酸是本发明的特色。此类核酸的例子包括与给定核酸序列相比包含一个或数个沉默或保守性核酸取代的核酸。
当测试靶核酸与探针杂交程度至少相当于完全配合互补靶点的一半时，称此测试靶核酸与探针核酸特异性杂交，即，靶点与探针杂交的信噪比至少为与完全配合互补序列的一半，后者的信噪比至少为观察到任何不配合靶核酸的杂交信噪比的约5倍-10倍。
通常在溶液中，当核酸结合时发生“杂交”。数种已知明了的物理化学力，如氢键、溶剂斥力、碱基堆积等引起核酸杂交。核酸杂交的数种实验方案为本领域所熟知。核酸杂交的详尽指南参见Tijssen(1993)《生物化学和分子生物学实验室技术-核酸探针杂交》(Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes)第一部分第二章，“杂交原则概述与核酸探针实验策略”(“Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays,”(埃斯威尔出版社，纽约)，以及下述Ausubel，Sambrook和Berger和Kimmel。Hames和Higgins(1995)《基因探针1》(Gene Probes1)牛津大学出版社IRL出版社，牛津，英格兰(Hames和Higgins1)以及Hames和Higgins(1995)《基因探针2》(Gene Probes2)牛津大学出版社 IRL出版社，牛津，英格兰(Hames和Higgins2)提供了合成、标记、检测和定量测定DNA和RNA包括寡核苷酸的详细内容。
在Southern或Northern印迹中滤纸上有多于100个互补残基的互补核酸杂交的严谨性杂交条件的一个例子是42℃，含1mg肝素的50％福尔马林杂交过夜。严谨性洗涤条件的例子包含0.2x SSC在65℃洗涤15分钟(参见Sambrook 下文中SSC缓冲液和其它核酸杂交参数的描述)。通常在高严谨性洗涤之前进行低严谨性洗涤以去除探针信号背景。低严谨性洗涤的例子是2x SSC在40℃洗涤15分钟。通常，在特定杂交实验中观察到信噪比比无关探针信噪比高5倍(甚至更高)表明检测到了特异性杂交。
杂交以后，通过一系列的洗涤去除未杂交核酸，其严谨性根据需要结果可进行调整。低严谨性条件(如使用高盐和低温)增加灵敏度，但会造成非特异性杂交信号和高背景信号。高严谨性条件(如使用低盐和接近T_m的高温)降低背景信号，通常主要是留下特异性信号。参见Rapley，R.和Walker，J.M.编，《分子生物学方法手册》(Molecular Biomethods Handbook)(Humana出版公司，1998)。
核酸杂交实验如Southern和northern杂交上下文中的“严谨杂交洗涤条件”取决于序列，并在不同的环境参数下“严谨杂交洗涤条件”也不同。核酸杂交的详尽指南参见Tijssen(1993)，同上以及Hames和Higgins，1和2。对于任何测试核酸的严谨杂交和洗涤条件可凭经验测定。例如，在确定高严谨杂交和洗涤条件时，逐渐增加杂交和洗涤条件(如通过增加杂交或洗涤中的温度、降低盐浓度、增加去污剂浓度和/或增加有机溶剂，如福尔马林的浓度)直至满足选择的一套标准。例如，逐渐增加杂交和洗涤的条件直至探针与互补靶点完美配合，其信噪比是观察到的探针与不配合靶点杂交信噪比的5倍。
通常，在特定杂交实验中，信噪比是观察到无关探针的至少2倍(或更高，如，至少5倍、10倍、20倍、50倍、100倍或更高)表明检测到特异性杂交。本发明的上下文中检测到两个序列至少发生严谨杂交表明与本文序列表提供了本发明的核酸具有相对强的结构相似性。
所选择的“非常严谨”条件等于特定探针的热解链点(Tm)。Tm是50％测试序列与完美配合探针杂交时的温度(在确定离子强度和pH的条件下)。出于 本发明的目的，在确定离子强度和pH的条件下，通常选择低于特定序列T_m5℃的“高度严谨的”杂交和洗涤条件(如下文注明，高严谨度条件也是相等同的术语)。可在严谨或高度严谨条件下鉴别与感兴趣核苷酸序列相接近或相同的靶序列(如“探针”)。低严谨性条件适合互补性较差的序列。
“超高严谨性”杂交和洗涤条件是提高杂交和洗涤条件的严谨性直至探针与互补靶点完美配合，其信噪比是观察到的探针与不配合靶点杂交信噪比的至少10倍。在此条件下与探针杂交的信噪比相当于完美配合互补靶核酸一半的靶核酸被称作在超高严谨条件下与探针结合。
在测定严谨或高度严谨的杂交(或甚至更严谨的杂交)和洗涤条件时，逐渐增加杂交和洗涤条件(如，通过增加杂交或洗涤中的温度、降低盐浓度、增加去污剂浓度和/或增加有机溶剂如甲酰胺的浓度)，直至满足所选一套标准。例如，逐渐增加杂交和洗涤条件，直至含有本发明一个或多个多核苷酸序列，如选自本文给定的序列或独特亚序列(如SEQ ID NO：1-10、21-26、33-38、SEQ ID NO:45)的探针和/或互补多核苷酸序列，与完美配合互补靶点(再次，含有本发明一个或多个选自本文给定的序列或亚序列和/或其互补多核苷酸序列的核酸)结合，根据需要，信噪比至少为观察到的非配合靶点(如含有一个或多个选自提交时公共数据库(如Genbank)中的已知流感序列的序列或亚序列的多核苷酸序列，和/或其互补多核苷酸序列)杂交的2倍(任选5倍、10倍或100倍或更多倍)。
利用本发明的多核苷酸或其亚序列，可获取新颖靶核酸；此类靶核酸也是本发明的特点。例如，此类靶核酸包含在严谨条件下与对应本发明多核苷酸SEQ ID NO：1-10、21-26、33-38、45的独特寡核苷酸探针杂交的序列)。
同样，通过逐渐增加相关杂交实验的杂交和/或洗涤条件可确定甚至更高水平的严谨性。例如，增加杂交和洗涤的严谨性直至与探针与完美配合互补靶核酸结合的信噪比至少为任何非配合靶核酸杂交的10倍、20倍、50倍、100倍或500倍甚至更高。特定信号取决于相关实验中使用的标记，如荧光标记、比色标记、放射性标记等。在此条件下与探针杂交的信噪比相当于完美配合互补靶核酸一半的靶核酸被称作在超超高严谨条件下与探针结合，并且也是本发明的特点。
如果核酸编码的多肽基本相同，那么在严谨条件下彼此不杂交的核酸仍有可能基本相同，例如当使用遗传密码允许的最大密码子简并性创建核酸拷贝时。
感兴趣生物分子的克隆、诱变和表达
描述应用于本发明的分子生物学方法技术如克隆、突变、细胞培养等的文本包括Berger和Kimmel，《分子克隆技术指南，酶学方法》(Guide to Molecular Cloning Techniques，Methods in Enzymology)第152卷科学出版社公司，加州圣地亚哥(Berger)；Sambrook等，《分子克隆-实验室手册》(Molecular Cloning-A Laboratory Manual)(第三版)，第1-3卷，冷泉港实验室，冷泉港，纽约2000(“Sambrook”)和《新编分子生物学实验方案》(Current Protocols in Molecular Biology)，F.M.Ausubel等编，格林出版联合公司(Greene Publishing Associates，Inc)和约翰韦利森出版公司(John Wiley&Sons，Inc.)合资的最新实验方案公司(从2002年补充)(“Ausubel”))。这些文本描述了诱变、使用载体、启动子和其它关于如HA和/或NA分子等产生的相关话题。
本发明任选使用不同类型的诱变，如生产和/或分离本发明新颖的或新分离的HA和/或NA分子和/或进一步修饰/诱变多肽(如，HA和NA分子，如SEQ ID NO：11-20或27-32或39-44)。它们包括但不限于定点诱变、随机点突变、同源重组(DNA重排)、利用含尿嘧啶的模板进行诱变、寡核苷酸定向诱变、硫代磷酸酯修饰的DNA诱变、利用缺口双链体DNA诱变等。其它合适的方法包括点错配修复、利用修复缺陷宿主株进行诱变、限制性选择和限制性纯化、缺失诱变、全基因合成诱变、双链打断修复等。本发明也包括诱变，如涉及嵌合构建物的诱变。在一个实施方式中，可由天然产生分子或改变或诱变的天然产生分子的信息，如序列、序列对比、物理性质、晶体结构等指导诱变。
上述文本和例子以及下列公开物(及其引用文献)都描述了这些步骤：Sieber，等，Nature Biotechnology，19:456-460(2001)；Ling等，DNA诱变方法：概览(Approaches to DNA Mutagenesis：an overview)，Anal Biochem254(2)：157-178(1997)；Dale等，利用硫代磷酸酯方法进行寡核苷酸定向随机诱变(Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the phosphorothioate method)，Methods Mol Biol57:369-374(1996)；I.A.Lorimer，I.Pastan，Nucleic Acids Res 23，3067-8(1995)；W.P.C.Stemmer，Nature 370，389-91(1994)；Arnold，非常态环境下的蛋白质工程(Protein engineering for unusual environments)，Current Opinion in Biotechnology 4:450-455(1993)；Bass等，具有新DNA结合特异性的突变Trp阻抑物(Mutant Trp repressors with new DNA-binding specificities)，Science 242:240-245(1988)；Fritz等，突变的寡核苷酸定向构建：不进行体外酶反应的缺口双链体DNA方法(Oligonucleotide-directed construction of mutation：a gapped duplex DNA procedure without enzymatic reactions in vitro)，Nucl Acids Res 16：6987-6999(1988)；Kramer等，在缺口双链体DNA方法中用于寡核苷酸定向构建突变的改良的酶促体外反应(Improved enzymatic in vitro reactions in the gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed construction of mutation)，Nucl Acids Res 16：7207(1988)；Sakamar和Khorana，牛杆体外节鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(转导蛋白)的α亚基的基因的总合成和表达(Total synthesis and expression of a gene for the a-subunit of bovine rod outer segment guanine nucleotide-binding protein(transducin))，Nucl Acids Res 14：6361-6372(1988)；Sayers等，基于硫代磷酸酯的寡核苷酸定向诱变中的Y-T核酸外切酶(Y-T Exonucleases in phosphorothioate-based oligonulcleotide-directed mutagenesis)，Nucl Acids Res 16:791-802(1988)；Sayers等，溴乙锭存在下通过限制性核酸外切酶的反应对含硫代磷酸酯的DNA进行链特异性切割(Strand specific cleavage of phosphorothioate-containing DNA by reaction with restriction endonucleases in the presence of ethidium bromide)，(1988) Nucl Acids Res 16：803-814；Carter，改进的利用M13载体的寡核苷酸定向诱变(Improved oligonucleotide-directed mutagenesis using M13 vector)，Methods in Enzymol 154：382-403(1987)；Kramer和Fritz 通过缺口双链体DNA进行突变的寡核苷酸定向构建(Oligonucleotide-directed construction of mutation via gapped duplex DNA)，Methods in Enzymol 154:350-367(1987)；Kunkel，《核酸和分子生物学》(Nucleic Acids and Molecular Biology)中的《寡核苷酸定向诱变的效率》(The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis)(Eckstein，F.和Lilley，D.M.J.编，施普林格弗莱格公司，柏林)(1987)；Kunkel等，不进行表型选择的快速有 效的定点诱变(Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection)，Methods in Enzymol154，367-382(1987)；Zoller和Smith，寡核苷酸定向诱变：利用两种寡核苷酸引物和一种单链DNA模板的简单方法(Oligonucleotide-directed mutagenesis：a simple method using two oligonucleotide primers and a single-stranded DNA template)，Methods in Enzymol154:329-350(1987)；Carter，定点诱变(Site-directed mutagenesis)，Biochem J237:1-7(1986)；Eghtedarzadeh和Henikoff，使用寡核苷酸产生大缺失(Use of oligonucleotides to generate large deletions)，Nucl Acids Res14：5115(1986)；Mandecki，大肠杆菌质粒中寡核苷酸定向的双链断裂修复：定点诱变方法(oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli：a method for site-specific mutagenesis)，Proc Natl Acad Sci USA，83:7177-7181(1986)；Nakamaye和Eckstein，通过硫代磷酸酯基团抑制核酸内切酶NciI切割和它在寡核苷酸定向诱变中的应用(Inhibition of endonuclease NciI cleavage by phosphorothioate groups and its application to oligonucleotide-directed mutagenesis)，Nucl Acids Res14：9679-9698(1986)；Wells等，氢键形成在稳定枯草杆菌蛋白酶的过渡态中的重要性(Importance of Hydrogen-bond formation in stabilizing the transition state of subtilisin)，Phil Trans R Soc Lond A317：415-423(1986)；Botstein和Shortle，体外诱变的方案和应用(Strategies and applications of in vitro mutagenesis)，Science 229:1193-1201(1985)；Carter等，改进的利用M13载体的寡核苷酸定向诱变(Improved oligonucleotide site-specific mutagenesis using M13Vector)，Nucl Acids Res13：4431-4443(1985)；等，通过小规模‘鸟枪’基因合成进行寡核苷酸定向诱变(oligonucleotide-directed mutagenesis by microscale 'shot-gun'gene synthesis)，Nucl Acids Res13：3305-3316(1985)；Kunkel，不进行表型选择的快速有效的定点诱变(Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection)，Proc Natl Acad Sci USA82:488-492(1985)；Smith ，体外诱变(In vitro mutagenesis)，Ann Rev Genet19:423-462(1985)；Taylor等，在限制性酶反应中使用硫代磷酸酯修饰的DNA制备带切口的DNA(The use of phosphorothioat-modified DNA in restriction enzyme reactions to prepare  nicked DNA)，Nucl Acids Res13：8749-8764(1985)；Taylor等，利用硫代磷酸酯修饰的DNA高频快速产生寡核苷酸定向突变(The rapid generation of oligonucleotide-directed mutaiton at high frequency using phosphorothioate-modified DNA)，Nucl Acids Res13：8765-8787(1985)；Wells 等，盒诱变：在确定位点产生多个突变的有效方法(Cassette mutagenesis：an efficient method for generation of multiple mutation at defined sites)，Gene34:315-323(1985)；Kramer等，进行寡核苷酸定向突变构建的缺口双链体DNA方法(The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction)，Nucl Acids Res12：9441-9456(1984)；Kramer等，点错配修复(Point Mismatch Repair)，Cell38:879-887(1984)；Nambiar等，核糖核酸酶S蛋白编码基因的总合成和克隆(Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein)，Science223：1299-1301(1984)；Zoller和Smith，考虑到M13载体中的DNA片段的寡核苷酸定向诱变(oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragment cloned into M13vector)，Methods in Enzymol100:468-500(1983)；以及Zoller和Smith，利用M13衍生载体进行寡核苷酸定向诱变：在任何DNA片段中产生点突变的有效的普通方法(oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-derived vector：an efficient and general procedure for the production of point mutation in any DNA fragment)，Nucl Acids Res10:6487-6500(1982)。上述方法的其它细节可在《酶学方法》(Methods in Enzymol)第154卷中找到，其中也描述了有关不同诱变、基因分离、表达和其它方法的有用问题解决控制方法。
用于如本发明诱变如将本发明HA和/或NA分子文库进行突变或更改的寡核苷酸通常根据Beaucage和Caruthers，Tetrahedron Letts22(20)：1859-1862，(1981)所述固相亚磷酰胺三酯方法化学合成，如利用自动合成仪，如Needham-VanDevanter等，Nucleic Acids Res，12:6159-6168(1984)所述。
此外，基本上任何核酸均可通过数种商业来源定制或标准订购，如中部认证试剂公司(The Midland Certified Reagent Company)(mcrc@oligos.com)、大美国基因公司(The Great American Gene Company)(www.genco.com)、快速基因公司(ExpressGen Inc.)(www.expressgen.com)、欧普龙技术公司(Operon Technologies Inc.)(加州阿拉米达(Alameda，CA))及其它来源。同样，也可从任何数种资源定制肽和抗体，如(派普肽金尼克公司)(PeptidoGenic)(pkim@ccnet.com)、HTI生物产品公司(HTI Bio-products，Inc .)(www.htibio.com)、BMA生物医学有限公司(BMA Biomedicals Ltd.)(英国)、生物合成公司(Bio.Synthesis，Inc.)及其它。
本发明也涉及含有本发明HA和/或NA分子或其它多肽和/或核酸，如SEQID NO:1-45的宿主细胞和生物体。利用本发明载体遗传工程改造宿主细胞(如转化、转导或转染)，本发明载体可以是(例如)克隆载体或表达载体。载体可为，例如，质粒、细菌、病毒、裸露多核苷酸或偶联多核苷酸的形式。通过以下标准方法将载体引入细胞或微生物：电穿孔(参见，From等，Proc Natl Acad SciUSA82，5824(1985)、病毒载体感染、小珠或颗粒基质内部或表面具有核酸的颗粒高速弹道穿透(Klein等，Nature327，70-73(1987))。Berger，Sambrook和Ausubel提供了数种合适的转化方法。参见上文。
本发明可利用数种已知在细菌细胞中引入靶核酸的方法，它们均可用于本发明。这些方法包括：将受体细胞和含DNA的细菌原生质体融合、电穿孔、微粒轰击、用病毒载体感染等。可使用细菌细胞扩增含本发明DNA构建物质粒的数目。细菌生长至对数期，可利用本领域已知数种方法分离细菌中的质粒(参见例如Sambrook)。此外，用市售的各种试剂盒纯化细菌质粒(参见例如，来自法玛西亚生物技术公司的EasyPrep^TM，FlexiPrep^TM；来自丝材特基因公司的StrataClean^TM；以及凯杰公司的QIAprep^TM)。进一步操作分离并纯化的质粒产生其它质粒，用于转染细胞或掺入相关载体以感染生物体。典型的载体包含转录、翻译终止子和转录、翻译起始序列，以及用于调节特定靶核酸表达的启动子。载体任选包含普通表达盒，表达盒含有至少一个独立终止序列，允许表达盒在真核、原核或两者中(如穿梭载体)复制的序列以及原核和真核系统的选择性标记。载体可在原核、真核或任选两者中复制和整合。参见，Giliman和Smith，Gene8:81(1979)；Roberts，等，Nature，328:731(1987)；Schneider，B.等，Protein Expr Purif6435:10(1995)；Ausubel，Sambrook，Berger(所有同上)。用于克隆的细菌和噬菌体目录由ATCC提供，如，《ATCC细菌和噬菌体目录》(The ATCC Catalogue of Bacteria and Bacteriophage)(1992)Gherna等(编)ATCC 发行。其它测序、克隆及分子生物学其它方面基础步骤以及其理论探讨可参见Watson等(1992)重组DNA(Recombinant DNA)第二版(科学美国人图书公司)(Scientific American Books)，纽约。如上所述。在上文有关流感病毒疫苗生产的章节及其引用文献中阐述了用于本文序列的其它载体。
多肽生产和回收
在转导合适的宿主细胞系或细胞株并使其生长至合适细胞密度后，利用合适方法诱导所选启动子(如，改变温度或化学诱导)，将细胞再培养一段时间。在一些实施方式中，可从培养基中回收分泌的多肽产物，如分泌融合蛋白形式中的HA和/或NA多肽。在其它实施方式中，细胞产生含本发明HA和/或NA多肽的病毒颗粒。或者，可离心收集细胞，通过物理或化学方法破碎细胞并保留所得粗提物进一步纯化。可使用任何方便方法破碎表达蛋白所使用的真核或微生物细胞，包括反复冻融、超声、机械破碎或使用细胞裂解试剂或其它方法，本领域熟练技术人熟知这些方法。此外，可使用表达本发明HA和/或NA多肽产物的细胞而不将多肽从细胞中分离。在此种情况下，本发明多肽可任选表达于细胞表面并因此可用细胞表面结合抗体等检测(如通过具有HA和/或NA分子或其片段的融合蛋白等形式)。此类细胞也是本发明的特点。
可通过本领域熟知的任何方法从重组细胞培养物中回收并纯化表达的多肽，包括硫酸铵或或乙醇沉淀、酸抽提、阴离子或阳离子交换色谱、磷酸纤维素色谱、疏水相互作用色谱、亲和色谱(如使用本领域熟练技术人员指导的任何标签系统)、羟基磷灰石色谱和凝集素色谱。根据需要可在完成成熟蛋白构型的过程中使用蛋白质重折叠步骤。也可以在最终纯化步骤中使用高效液相色谱(HPLC)。除了本文注明的参考文献外，本领域熟知数种纯化方法，包括如下文献列出的那些：Sandana(1997)《蛋白的生物分离》(Bioseparation of proteins)，科学出版公司(Academic Press，Inc.)和Bollag等(1996)《蛋白方法(第二版)》(Protein Methods，2^nd Edition)韦利李斯公司，纽约(Wiley-Liss，NY)；Walker(1996)《蛋白实验手册》(The Protein Protocols Handbook)Humana出版公司，纽约，Harris和Angal(1990)《蛋白纯化应用：方法实践》(Protein purification application:A practical approach)牛津IRL出版公司，牛津，英格兰(Press at Oxford，Oxford，England)；Harris和Angal《蛋白纯化方法：方法实践》(Protein PurificationMethods：A Practical Approach)牛津IRL出版公司，牛津，英格兰(Press at Oxford，Oxford，England)；Scopes(1993)《蛋白纯化：原理和实践(第三版)》(Protein Purification：Principles and Practice3^rd Edition施普林格佛莱格公司，纽约(Springer Verlag，NY)；Janson和Ryden(1998)《蛋白纯化：原理、高分辨率方法及其应用(第二版)》(Protein Purification：Principles，High Resolution Methods and Applications，韦利-VCH公司，纽约(Wiley-VCH，NY)；和Walker(1998)CD-ROM上的蛋白实验方法(Protein Protocols on CD-ROM)休曼出版公司(Humana Press)，纽约。
在病毒中生产本发明表达多肽时，病毒通常从感染(转染)细胞生长的培养基中回收。通常，在浓缩流感病毒前澄清粗培养基。一般的方法包括超滤、硫酸钡吸附和洗脱以及离心。例如，来自感染培养物的粗培养基首先离心澄清，如1000-2000x g离心足够长的时间以去除细胞碎片和其它大颗粒物质，如离心10-30分钟。任选的，离心澄清培养基上清使流感病毒成团，如15,000x g离心约3-5小时。接下来将病毒团块重悬于合适的缓冲液，如STE(0.01M Tris-HCl；0.15M NaCl；0.0001M EDTA)或磷酸缓冲盐水(PBS)pH7.4中，在蔗糖(60％-12％)或酒石酸钾(50％-10％)中密度梯度离心病毒。连续梯度或步进梯度均可，如12％-60％的4个12％步长的蔗糖梯度。以一定速度和时间进行梯度离心，所用时间足以使病毒浓缩于可见条带中用于回收。或者，对于多数大规模商用，用分带离心转头以连续模式从密度梯度中淘选病毒。其它在组织培养物中制备流感病毒的足以指导技术人员的细节参见Nicholson等(编)《流感教科书》(Textbook of Influenza)第324-332页的Furminger.《疫苗生产》(Vaccine Production)；Cohen和Shafferman(编)《设计和生产疫苗的新策略》(NovelStrategies in Design and Production of Vaccine)第141-151页Merten等(1996)《从细胞培养物中制生产用于制备疫苗的流感病毒》(Production of influenza virus incellcultures for vaccine preparation)，以及美国专利号5,690,937。需要的话可将回收病毒在作为稳定剂的蔗糖磷酸谷氨酸(SPG)存在下存储于-80℃。
或者，可使用无细胞转录/翻译系统产生包含本文给定序列如SEQ ID NOS：11-20或27-32或39-44的氨基酸序列或亚序列，或由本发明多核苷酸序列如SEQ ID NOS：1-10或21-26或33-38或45编码的氨基酸序列或亚序列的 多肽。可购得数种合适的体外转录和翻译系统。体外转录和翻译实验方案的通用指南参见Tymms(1995)《体外转录和翻译实验方案：分子生物学方法》(In vitroTranscription and Translation Protocols：Methods in Molecular Biology第37卷，加兰出版公司，纽约(Garland Publishing，NY)。
此外，多肽或其亚序列，如含抗原性肽的亚序列，可通过手工或自动化系统合成，如利用固相技术直接进行肽合成(参见，Stewart等(1969)《固相肽合成》(Solide-Phase Peptide Synthesis)，WH佛理茫公司，旧金山(WH Freeman Co，San Francisco)；Merrifield J(1963)J Am Chem Soc85:2149-2154)。示例性的自动化系统包括应用生物系统(Applied Biosystems)431A肽合成仪(珀金爱尔默公司，加州福斯特城(Perkin Elmer，Foster City，CA)。根据需要可以分别合成亚序列，并用化学方法组合提供全长多肽。
修饰氨基酸
本发明表达多肽能含一个或多个修饰氨基酸。修饰氨基酸存在的优势在于，例如，(a)增加多肽血清半衰期，(b)降低/增加多肽抗原性，(c)增加多肽存储稳定性等。例如，在重组生产的翻译时或翻译后(如，在哺乳动物细胞表达时N-X-S/T基序的N连接糖基化)或通过合成手段(如，通过PEG化)进行氨基酸修饰。
修饰的氨基酸的非限制性例子包括糖基化的氨基酸、硫酸化氨基酸、异戊烯基化(如法尼基化、牻牛儿基牻牛儿基化)氨基酸、乙酰化氨基酸、酰基化氨基酸、PEG化氨基酸、生物素化氨基酸、羧化氨基酸、磷酸化氨基酸等，以及与脂部分或其它有机衍生物质偶联的修饰氨基酸。文献中遍布足以指导技术人员进行氨基酸修饰的参考内容。示例性的实验方案参见Walker(1998)《CD-ROM上的蛋白实验方案》(Protein Protocols on CD-ROM)休曼出版社(Human Press)，新泽西州托瓦它(Towata，NJ)。
融合蛋白
本发明也提供融合蛋白，该融合蛋白含有本发明序列(如SEQ ID NO：11-20、27-32和39-44示例的编码HA和/或NA多肽的序列)或其具有如免疫球蛋白(或其部分)、GFP(绿色荧光蛋白)编码序列或其它类似标记物的片段。编码此类融合蛋白的核苷酸序列是本发明另一方面。本发明的融合蛋白任选用于， 如，与本发明非融合蛋白类似的应用(包括，如，治疗、预防、诊断、实验等本文所述的应用)。除了与免疫球蛋白序列和标记序列融合，本发明蛋白也可任选与用于分选融合蛋白和/或使融合蛋白靶向特定细胞类型、区域等的序列融合。
抗体
本发明的多肽能用于生产本文给定多肽和/或本发明多核苷酸(如本文所示的那些及其保守性变体)编码多肽的特异性抗体。上述提及多肽的特异性抗体可用于如诊断和治疗目的，如关于靶多肽的活性、分布和表达。
可通过本领域熟知方法产生本发明多肽的特异性抗体。此类抗体能包括但不限于：多克隆、单克隆、嵌合、人源化、单链、Fab片段和Fab表达文库产生的片段。
抗体生产所用多肽无需生物学活性(如，无需全长功能性血凝素或神经氨酸酶)。然而，多肽或寡肽必须具有抗原性。用于诱导特异性抗体的肽通常具有至少4个氨基酸的序列，常常至少5个或10个氨基酸。多肽的短臂可与另一蛋白，如钥孔血蓝素及抗嵌合分子的抗体融合。
本领域技术人员了解数种制造多克隆和单克隆抗体的方法，这些方法适合生产本发明多肽和/或本发明多核苷酸序列编码多肽的特异性抗体。参见例如，Coligan(1991)《新编免疫学实验方案》(Current Protocols in Immunology)纽约韦利/格林公司(Wiley/Greene，NY)；Paul(编)(1998)《基础免疫学第四版》(Fundamental Immunology，Fourth Edition)，Lippincott-Raven，Lippincott Williams和Wilkins；Harlow和Lane(1989)《抗体：实验室手册》(Antibody：A Laboratory Manual)，纽约冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Press，NY)；Stites等(编)《基础和临床免疫学(第四版)》(Basic and Clinical Immunology(4th ed.))，兰格医学出版公司，加州洛斯阿尔托斯(Lange Medical Publications，Los Altos，CA)及其引用文献；Goding(1986)《单克隆抗体：原理和实践(第二版)》(Monoclonal antibody：Principles and Practice(2d ed.))科学出版社，纽约(Academic Press，New York，NY)；Kohler和Milstein(1975)Nature256：495-497。其它合适的抗体制备技术包括在噬菌体或类似载体中选择重组抗体文库。参见，Huse等(1989)Science246：1275-1281；和Ward等(1989)Nature341： 544-546。特异性单克隆和多克隆抗体和抗血清结合的K_D，如至少约0.1μM，至少约0.01μM或更好，并且，通常至少约0.001μM或更好。
对于某种治疗性应用，需要人源化抗体。制备嵌合(人源化)抗体的方法参见美国专利5,482,856。人源化和其它抗体生产和工程改造技术的其它细节参见Borrebaeck(编)(1995)《抗体工程第二版》(Antibody Engineering，2^nd Edition)佛理茫和公司，纽约(Borrebaeck)(Freeman and Company，NY(Borrebaeck))；McCafferty等(1996)《抗体工程，实践方法》(Engineering，A Practical Approach)，IRL牛津出版社，牛津，英格兰(McCafferty)(IRL at Oxford Press，Oxford，England(McCafferty))以及和Paul(1995)《抗体工程手册》(Engineering Protocols)休曼出版社，纽约(Paul)(Humana Press，Towata，NJ(Paul))。其它特定步骤的细节可参见Ostberg等(1983)，Hybridoma2：361-367，Ostberg，美国专利号4,634,664,和Engelman等，美国专利号4,634,666。
由免疫反应性定义多肽
由于本发明多肽提供了多种新的多肽序列(如含有HA和NA分子的多肽序列)，因此多肽也提供了可在如免疫学实验中被识别的新结构特点。因此生产能特异性结合本发明多肽的抗血清以及此类抗血清结合的多肽也是本发明的特点。
例如，本发明包括能够与抗体或抗血清特异性结合或者对抗体或抗血清具有特异免疫反应性的多肽(如，HA和NA分子)，其中抗体或抗血清所抗免疫原包含选自一个或多个本文给定序列(如，SEQ ID NO：11-20、27-32和39-44)等的氨基酸序列。为了减少与其它同源物的交叉反应，用提交时公共数据库中的HA和/或NA分子如“对照”多肽对抗体或抗血清进行消减。当其它对照序列对应核酸时，产生由核酸编码的多肽并用于抗体/抗血清消减目的。
在一个典型形式中，免疫实验使用的多克隆抗血清是用含一个或多个对应本文序列(如SEQ ID NO：11-20、27-32和39-44)等或其亚序列(即占所提供全长序列的至少约30％)的一种或多种多肽产生的。起源于当前序列的一套潜在多肽免疫原下文统称为“免疫原性多肽”。任意选择所得抗血清使其对对照血凝素和/或神经氨酸酶同系物具有低交叉反应性，并且在免疫实验使用多克隆抗血清之前通过免疫吸附消除与一种或多种对照血凝素和神经氨酸酶同系物的 交叉反应性。
为了生产免疫实验中所用抗血清，按照本文所述生产一种或多种免疫原性多肽并纯化。例如，能在重组细胞中产生重组蛋白质。按照标准小鼠免疫实验方案(参见例如，Harlow和Lane(1988)《抗体：实验室手册》(Antibody，A Laboratory Manual)，冷泉港出版公司(Cold Spring Harbor Publications)，纽约)，用免疫原性蛋白和标准佐剂如弗氏佐剂免疫纯系小鼠(用于本实验的原因是由于该小鼠遗传背景基本相同导致结果更具重现性)，上述文献中包含关于可用于测定特异性免疫反应性的抗体产生、免疫实验形式及条件的标准描述。其它抗体参考资料和讨论可在本文中找到，并可用于利用免疫反应性定义多肽。或者，将源于本文公开序列的一种或多种合成或重组的多肽与载体蛋白偶联，并用作免疫原。
收集多克隆血清，并在免疫实验中测定抗免疫原性多肽的滴度，例如，使用在固体支持物上固定一种或多种免疫原性蛋白的固相免疫实验。选择滴度为10⁶或更高的多克隆抗血清，汇集并用对照血凝素和/或神经氨酸酶多肽消减以产生消减、汇集的已知滴度的多克隆抗血清。
在比较性免疫实验中检测消减、汇集的已知滴度多克隆抗血清抗对照同系物的交叉反应性。在此比较性实验中，使用差异性结合条件检测消减的已知滴度多克隆抗血清，已知滴度抗血清与免疫原性多肽结合的信噪比至少比结合对照同系物信噪比高5-10倍。即，通过加入非特异性竞争物如清蛋白或脱脂奶粉和/或调整盐条件、温度和或其它来调整结合反应的严谨性。在接下来的实验中使用这些结合条件，以测定测试多肽(与免疫原性多肽和/或对照多肽对比的多肽)是否特异性与汇集的消减多克隆抗血清结合。具体说，在差异性结合条件下，测试多肽比对照受试同源物信噪比高2-5倍，且信噪比是免疫原性多肽的至少约1/2，与已知受体相比与免疫原性多肽具有显著结构相似性，因此是本发明的多肽。
在另一个实施例中，用竞争结合形式的免疫实验检测受试多肽。例如，利用对照多肽免疫吸附将交叉反应抗体从汇集抗血清混合物中去除。然后将免疫原性多肽固定于固体支持物上，随后接触消减、汇集的抗血清。将受试蛋白加入实验，以竞争结合汇集、消减的抗血清。与固定蛋白相比，受试蛋白竞争结 合汇集、消减的抗血清的能力与加入实验的免疫原性多肽竞争结合的能力(免疫原性多肽与固定的免疫原性多肽有效竞争结合汇集的抗血清)作比较。使用标准计算方法计算受试蛋白的交叉反应百分数。
在平行实验中，任选测定对照蛋白竞争结合汇集、消减的抗血清的能力，与免疫原性多肽竞争结合抗血清的能力作比较。再次使用标准计算方法计算受试蛋白的交叉反应百分数。当受试蛋白交叉反应百分数是对照多肽的至少5-10倍或受试多肽的结合大约在免疫原性多肽结合范围内，则称受试多肽特异性结合汇集、消减的抗血清。
通常，可在如本文所述比较任何多肽与免疫原性和/或对照多肽的竞争结合免疫实验中使用免疫吸附并汇集的抗血清。为了进行比较，免疫原性、受试和对照多肽分别进行宽浓度范围实验，并用标准技术测定每一多肽抑制50％消减抗血清结合固定对照、受试或免疫原性多肽的多肽量。如果竞争实验中结合所需受试多肽的量小于所需免疫原性多肽量的两倍，则称受试多肽特异性结合免疫原性蛋白的抗体，只要该量至少是比对照多肽的约5-10倍。
作为特异性的另一测定，任选用免疫原性多肽(而非对照多肽)完全免疫吸附汇集抗血清，直至检测到所得免疫原性多肽消减、汇集的抗血清很少或没有结合于免疫吸附中使用的免疫原性多肽。然后测试该完全免疫吸附抗血清与受试多肽的反应性。若观察到很少或没有反应(即，不超过完全免疫吸附抗血清结合免疫原性多肽信噪比的2倍)，则受试多肽特异性结合于免疫原性蛋白产生的抗血清。
核酸和多肽序列变体
如本文所述，本发明提供核酸多核苷酸序列和多肽氨基酸序列，如血凝素和神经氨酸酶序列，以及包含所述序列的组合物和方法。本文公开所述序列的例子(如SEQ ID NO：1-45)。然而，本领域技术人员将意识到本发明提供的这些序列并不限制本发明，并且本发明也提供许多具有本文所述功能的相关和非相关的序列，如编码HA和/或NA分子的序列。
技术人员也将意识到本发明包括许多所公开序列的变体。例如，本发明包括所公开序列通过保守性变异产生的功能相同的序列。如果核酸多核苷酸序列的变体能与至少一条公开序列杂交，那么该变体也应该包括在本发明中。本发 明也包括通过如标准序列比对技术确定的本文公开序列的独特亚序列。
沉默变异
由于遗传密码的简并性，可任选产生任何编码本发明多肽和/或病毒的多种核酸序列，其中一些与本文HA和NA核酸和多肽序列具有较低水平的序列相同性。下文提供了详细遗传密码的密码子表，可在许多生物学和生化教科书中找到。
表1
密码子表

密码子表显示许多氨基酸可由一种以上密码子编码。例如，密码子AGA、AGG、CGA、CGC、CGG和CGU均编码精氨酸。因此，在本发明核酸的每个编码精氨酸的密码子位置，可用上述任何对应密码子改换密码子而并不改变编码的多肽。应当理解的是RNA序列中的U对应DNA序列中的T。
此类“沉默变异”是下文讨论的“保守修饰变化”的一种。技术人员认识 到核酸中的每一密码子(除了ATG，通常是甲硫氨酸的唯一密码子，以及TTG，通常是色氨酸的唯一密码子)均能通过标准技术修饰以编码功能相同的多肽。因此，多肽编码核酸的每一沉默变异均隐含于任何所述序列中。因此本发明隐含的提供了编码本发明多肽的每一和每个可能的变化，可通过选择基于可能密码子选择的组合产生。根据标准的三联体遗传密码产生这些应用于编码本发明血凝素或神经氨酸酶多肽的核酸序列的组合(如，表1所列，或本领域常用的)。考虑在序列以及遗传密码的基础上提供并描述了本文每个核酸的所有此类变化。技术人员完全能够利用本文方法进行这些沉默取代。
保守性变异
由于遗传密码的简并性，“沉默取代”(即不引起所编码多肽改变的核酸序列中的取代)是本发明的每个编码氨基酸序列的核酸序列的暗含特点。同样，在氨基酸序列中的一个或一些氨基酸中的“保守性氨基酸取代”则是利用具有高度相似性的不同氨基酸进行的取代，也被鉴定为与如本文公开的构建物具有高度相似性。每一公开序列的此类保守性变异是本发明的特点。
特定核酸序列的“保守性变异”指那些编码相同或基本相同的氨基酸序列的核酸，或不编码氨基酸序列但序列基本相同的核酸，参见下文表2。技术人员将认识到改变、加入或删除编码序列中单一氨基酸或小部分氨基酸(通常小于5％、更通常少于4％、3％、2％或1％)的个别的取代、删除或增加为“保守性修饰的变异”，其中改变导致氨基酸的删除、增加或化学相似性氨基酸的取代。因此，本发明所列举的多肽序列的“保守性变异”包括多肽序列中小百分数的氨基酸被具有相同保守取代基的保守性选择氨基酸所取代，所述小百分数通常小于5％，更通常小于4％、3％、2％或1％。最后，加入不改变核酸分子编码活性的序列，如加入非功能性序列，也是基本核酸的保守性变异。
表2--保守取代基团