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本申请要求2008年7月18日提交的序列号No.61/081,943的美国临时申请的优先 权。
技术领域
本文件涉及抑制病毒感染相关的免疫复合物的形成。例如，本文件提供材料和方 法，其用于抑制登革热(DengueFever，DF)感染中的免疫复合物形成，和用于抑制DF感染包 括登革出血热(DengueHemorrhagicFever，DHF)和登革休克综合征(DengueShock Syndrome，DSS)的抗体依赖性增强作用(antibody-dependent-enhancement，ADE)中的免疫 复合物形成。具体地，本文件涉及通过多肽和其他小分子抑制免疫复合物的形成。
背景
当抗原特异性结合至抗体时激发体液免疫应答。抗体分子和抗原的组合形成小 的、相对可溶性的免疫复合物。抗原可以是外来物质，如病毒或细菌多肽，或者可以是“自身 抗原”如在人体中正常发现的多肽。免疫系统正常地将外来抗原与自身抗原中区别开。然 而，当这一系统崩溃时，可以发生“自身免疫”疾病，从而免疫系统针对身体启动并破坏组织 或器官系统(如同它们是外来物质一样)。较大免疫复合物比小的、较可溶的免疫复合物更 有致病性。抗体分子与抗原的相互作用和抗体分子相互之间的相互作用两者可以导致大 的、相对不可溶的免疫复合物的形成。此类免疫复合物也可来自于无抗原时抗体之间的相 互作用。
抗体可通过包被病毒或细菌防止感染，然而在别的方面它们本身却是相对无害 的。相比之下，当抗体与抗原结合并且所产生的免疫复合物结合至体内某些效应分子时可 以发生器官特异性组织损伤。效应分子如此命名是因为它们实施免疫复合物的致病效应。 通过抑制大的、不可溶的免疫复合物的形成，或通过抑制免疫复合物与效应分子的结合，可 以防止免疫复合物的组织损伤效应。
概述
本文件部分地基于以下发现：具有基于SEQIDNO：2和SEQIDNO：20(本文中也称 为NB-406)所述的氨基酸序列的多肽可以特异性地并且以高亲和力地结合免疫球蛋白分子 的CH2-CH3结构域，从而抑制含有抗体和抗原的不可溶的免疫复合物的形成，并且阻止此类 复合物与效应分子的结合。本文件提供此类多肽、其它CH2-CH3结合化合物、含有该多肽和/ 或化合物的组合物，以及使用该多肽和组合物抑制免疫复合物形成的方法和在治疗病毒感 染中的治疗性用途。
一方面，本文件的特征是一种抑制受试者中免疫复合物形成的方法，该方法包括 向该受试者施用包含纯化多肽的组合物，该多肽包括氨基酸序列(Xaa1)m-Cys-Ala-Xaa2- His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr-(Xaa3)n(SEQIDNO：53)，其中Xaa1是任何氨基 酸，Xaa2是Trp、Tyr或Phe、5-羟色胺酸(5-Hydroxytrphophan，5-HTP)、5-羟色胺(5-HT)或另 一氨基酸衍生物，Xaa3是任何氨基酸，并且m和n独立地为0、1、2、3、4或5，并且其中该免疫复 合物的形成与病毒感染相关。该免疫复合物的形成可与登革热或登革热病毒(DENV)感染的 抗体依赖性增强作用(ADE)相关，或促进DENV感染的增强。该肽可导致DENV感染的临床或组 织学改善。该肽可导致DENV感染的一种或多种组织学特征的改善或延缓DENV感染的一种或 多种组织学特征的发生。该肽可降低DENV感染的ADE。
DENV感染可以是登革出血热(DHF)或登革休克综合征(DSS)。该肽可抑制抗-DENV 异源IgG免疫复合物(IC)与FcγR的结合。该肽可抑制IC的形成，该IC促进DENV感染ADE的免 疫发病。该肽可抑制DENV病毒体与IgGIC的结合。该肽可抑制DENV蛋白(例如，NS1)与IgG免 疫复合物的结合。该肽可抑制TNF-α与IgGIC的结合。该肽可抑制DENV-IgGIC与FcγI、Fc γIIaH131等位基因、FcγIIaR131等位基因、FcγRIIb、FcγRIIc、FcγRIIIa或Fcyγ IIIb的结合。该肽可抑制DENV-IgGIC与mC1q或sC1q的结合。
该多肽可包含末端稳定基团。该末端稳定基团可在该多肽的氨基末端，并且可以 是具有氨基酸序列Xaa-Pro-Pro的三肽，其中Xaa是任何氨基酸(例如，Ala)。该末端稳定基 团可在该多肽的羧基末端，并且可以是具有氨基酸序列Pro-Pro-Xaa的三肽，其中Xaa是任 何氨基酸(例如，Ala)。
该方法还可包括监测该受试者的出血热的一种或多种临床、组织病理学或分子特 征的步骤。出血热的一种或多种临床、组织病理学或分子特征可选自由血小板降低、血浓缩 或FcγR+效应细胞的增加组成的组。
该多肽可包括氨基酸序列Xaa-Pro-Pro-Asp-Cys-Ala-Trp-His-Leu-Gly-Glu- Leu-Val-Trp-Cys-Thr(SEQIDNO：19)，其中Xaa是任何氨基酸。该多肽可包括氨基酸序列 Ala-Pro-Pro-Asp-Cys-Ala-Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr(SEQIDNO：20)。 该多肽可包括氨基酸序列Asp-Cys-Ala-Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr(SEQ IDNO：2)。
除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技 术人员通常理解的相同的意思。尽管与本文描述的那些相似或等同的方法和材料可以用于 实施本发明，下文描述了适当的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利、和其 它参考文献的全文通过引用并入本文。在不一致的情况下，以本说明书包括定义为准。此 外，材料、方法和实施例仅是示例性的，并无限制之意。
本发明的一种或多种实施方案的细节在附图和下述描述中记述。本发明的其它特 征、目的和优点从说明书和从权利要求书中应该是清楚的。
详细描述
本文件提供能够与免疫球蛋白分子的CH2-CH3裂口(cleft)相互作用的多肽和其它 化合物，以致阻断免疫球蛋白与其它分子(例如，效应器或其它免疫球蛋白)的相互作用。还 描述了用于识别这样的多肽和其它化合物的方法，以及含有所述多肽和化合物的组合物和 产品。另外，本文件提供关于应用所述多肽和化合物抑制免疫复合物形成和治疗疾病(例 如，病毒病诸如登革热)的方法，在该疾病中IgG免疫复合物结合效应分子，诸如膜结合的 C1q(mC1q)、可溶性C1q(sC1q)和FcγRs(包括但不限于FcγRI(和FcγRs的同种型)、Fcγ RIIa、FcγRIIb/c、FcγRIIIa、FcγRIIIb和FcRn)。
免疫球蛋白
免疫球蛋白组成在血浆和其它体液中发现的一类蛋白，其表现出抗体活性并且以 高度的特异性结合于其它分子(例如，抗原和某些细胞表面受体)。基于其结构和生物活性， 免疫球蛋白可以分成5类：IgM、IgG、IgA、IgD和IgE。IgG是体内最丰富的抗体种类；该分子呈 现扭曲的“Y”型构型。除了IgMs之外，免疫球蛋白主要由4条肽链组成，所述肽链通过若干链 内和链间二硫键连接。例如，IgGs由2条多肽重链(H链)和2条多肽轻链(L链)组成，其通过二 硫键和非共价键偶联形成具有大约150,000道尔顿的分子量的蛋白分子(Saphire等，″ CrystalStructureofaNeutralizingHumanIgGAgainstHIV-1：ATemplatefor VaccineDesign(中和人IgG抗HIV-1的晶体结构：疫苗设计的模板)，″Science(科学)， 2001，293：1155-1159)。一般IgG分子含有大约4.5个链间二硫键和大约12个链内二硫键 (Frangione和Milstein(1968)J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)33：893-906)。
免疫球蛋白分子的轻链和重链由恒定区和可变区组成(参见，例如，Padlan(1994) Mol.Immunol.(分子免疫学)31：169-217)。例如，IgG1分子的每一条轻链含有可变结构域 (VL)和恒定结构域(CL)。每一条重链具有4个结构域：氨基端可变结构域(VH)，接着是3个恒 定结构域(CH1、CH2和羧基端CH3)。铰链区对应在CH1和CH2结构域之间的柔性接头。用木瓜蛋 白酶消化完整的IgG分子导致在铰合部的蛋白水解断裂，并且产生含有CH2和CH3结构域的Fc 片段，和2条相同的Fab片段，其中每一条Fab片段含有CH1、CL、VH和VL结构域。Fc片段具有补 体结合活性和组织结合活性，而Fab片段具有抗原结合活性。
免疫球蛋白分子可以通过不同区域与其它多肽相互作用。大多数的抗原结合，例 如，通过Fab片段的VL/VH区发生。由于免疫学教义阐述关于Fc受体(FcR)的结合位点存在于 IgG分子的铰链区内(参见，例如，Raghavan和Bjorkman(1996)Annu.Rev.Dev.Biol.(发育生 物学年度评论)12：181-200)，所以也认为铰链区是重要的。然而，更近的证据表明当免疫球 蛋白是单体的(即，非免疫复合的)时，FcR主要与铰链区相互作用。这样的相互作用典型地 涉及Ig分子的位置234-237的氨基酸(Wiens等(2000)J.Immunol.(免疫学杂志)164：5313- 5318)。
免疫球蛋白分子还可以通过CH2-CH3结构域内的裂口与其它多肽相互作用。“CH2- CH3裂口”典型地包括CH2结构域内位置251-255的氨基酸和CH3结构域内位置424-436的氨基 酸。当用于本文时，编号方式涉及完整的IgG分子，如在Kabat等中那样(SequencesofProteinsofImmunologicalInterest(免疫学感兴趣的蛋白序列)，第5版，PublicHealth Service(公共卫生局)，U.S.DepartmentofHealthandHumanServices，Bethesda，MA)。 本领域的那些普通技术人员可以容易地确定其它免疫球蛋白种类中对应的氨基酸。
CH2-CH3裂口是不寻常的，原因在于其特征在于高度的溶剂可及性和突出的疏水特 征二者，这提示暴露的疏水表面的包埋是在这一位点结合的重要驱动力。一旦抗原结合，在 IgGCH2-CH3裂口发生三维变化，这允许某些残基(例如，位置435的组氨酸)变成暴露的并且 可用于结合。在使用对人IgG的Fc区内构象变化敏感的单克隆抗体的研究中发现，在抗原结 合时发生的三维结构变化的直接证据。5个IgG表位通过抗原结合而改变：2个在铰链区之内 和3个在CH2-CH3裂口内(Girkontraite等(1996)CancerBiother.Radiopharm.(肿瘤生物治 疗和放射性药物)11：87-96)。因此，抗原结合对于确定免疫球蛋白是否通过铰链区或Fc CH2-CH3裂口区结合于其它分子可以是重要的。
Fc区可以结合于许多的效应分子和其它蛋白，其包括下列：
(1)FcRn-新生的Fc受体决定抗体分子在基本循环中的半衰期(Leach等，(1996) J.Immunol.(免疫学杂志)157：3317-3322；Gheti和Ward(2000)Ann.Rev.Immunol.(免疫学 年度评论)18：739-766)。由于自身抗体的缩短的半衰期，遗传上缺少FcRn的小鼠免于受到 致病性自身抗体的有害作用(Liu等(1997)J.Exp.Med.(实验医学杂志)186：777-783)。FcRn 与IgGFc的仅有结合位点是IgGFcCH2-CH3裂口，并且已通过3D结构和丙氨酸扫描显示HIS 435对于FcRn与IgGFc的结合是必需的(Shields等(2001)J.Biol.Chem.(生物化学杂志) 276：6591-6604和Martin等(2001)Mol.Cell(分子细胞)，7：867-877)。由于本文描述的肽高 亲和力地结合至CH2-CH3裂口和HIS435，该肽是(免疫复合物化的)IgGFc与FcRn结合的直 接抑制剂。FcRn结合免疫复合物或致病性自身抗体的抑制剂将有效用于治疗涉及致病性自 身抗体和/或免疫复合物的疾病。
(2)FcR-细胞Fc受体提供在体液免疫应答和细胞介导的效应器系统之间的联系 (Hamano等(2000)J.Immunol.(免疫学杂志)164：6113-6119；Coxon等(2001)Immunity(免 疫)14：693-704；Fossati等(2001)Eur.J.Clin.Invest.(欧洲临床研究杂志)31：821-831)。 Fcγ受体对IgG分子是特异性的，并且包括FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb/c和FcγRIIIa/b (及其等位基因、表型和基因型)。这些同种型以不同亲和力结合至单体的和免疫复合的 IgG。
(3)C1q-经典补体途径的第一个成分是C1，其作为3种蛋白，C1q、C1r和C1s的复合 体存在于血清中。当C1q结合于抗原结合的IgG或IgM的Fc区时，激活经典补体途径。尽管C1q 与单个Fc区的结合是微弱的，但是C1q可以与一簇Fc区形成牢固键合。在这一点上C1变得具 有蛋白水解活性。
通过免疫球蛋白Fc区与其它抗体或其它因子(例如，上文所描述的那些)之间的相 互作用的免疫复合物的形成在本文称为“Fc-介导的免疫复合物形成(Fc-mediated inmmunecomplexformation)”或者“免疫复合物的Fc-介导的形成(theFc-mediated formationofanimmunecomplex)”。含有这样的相互作用的免疫复合物被称为“Fc-介导 的免疫复合物”。Fc-介导的免疫复合物可以包括带有或不带有结合的抗原的免疫球蛋白分 子，且典型地包括CH2-CH3裂口-特异性配体，其对于免疫复合的抗体比对于单体抗体具有更 高的亲和力。
纯化的多肽
当用于本文时，“多肽”是任何氨基酸残基链，不考虑翻译后修饰(例如，磷酸化或 糖基化)。本文提供的多肽典型地为10-50个氨基酸的长度(例如，长度为10、11、12、13、14、 15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸)。长度为10-20个氨基酸的多肽(例如，长度为10、11、 12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸)可以是特别有效的。
本文所提供的多肽的氨基酸序列是稍微限定的，但是可以有一些可变性。例如，本 文所提供的多肽典型地包括氨基酸序列Xaa1-Cys-Ala-Xaa2-His-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Leu-Val- Trp-Cys-Xaa6(SEQIDNO：1)，其中由Xaan表示的残基可以表现出可变性。例如，Xaa1可以不 存在或可以为任何氨基酸(例如，Arg或Asp)。Xaa2可以为Phe、Tyr、Trp、5-羟色氨酸(5- HTP)、或Arg。Xaa3可以为任何氨基酸。Xaa4可以为Gly或Ala，而Xaa5可以为Glu或Ala。与Xaa1相同，Xaa6也可以不存在或可以为任何氨基酸。
在一个实施方案中，多肽可以包括氨基酸序列Asp-Cys-Ala-Trp-His-Leu-Gly- Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr(SEQIDNO：2)。备选地，多肽可以包括氨基酸序列Asp-Cys- Ala-Phe-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr(SEQIDNO：3)或Asp-Cys-Ala-Arg- His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr(SEQIDNO：4)。在另一实施方案中，多肽可以包 括氨基酸序列Arg-Cys-Ala-Arg-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr(SEQIDNO：5)、 Arg-Cys-Ala-Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr(SEQIDNO：6)或Arg-Cys- Ala-Phe-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr(SEQIDNO：7)。
在另一实施方案中，多肽可以包括氨基酸序列Cys-Ala-Xaa-His-Leu-Gly-Glu- Leu-Val-Trp-Cys(SEQIDNO：8)，其中Xaa可以为Phe、Tyr、Trp或Arg。例如，本文件提供包 含下述氨基酸序列的多肽：Cys-Ala-Phe-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr(SEQ IDNO：9)、Cys-Ala-Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr(SEQIDNO：10)和Cys- Ala-Arg-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr(SEQIDNO：11)。
为了体内应用，可以通过在氨基端或羧基端添加稳定剂，对本文提供的多肽进行 修饰，以促进多肽在体内的存活。这可以用于这样的情形：在细胞吸收前，肽末端趋向于被 蛋白酶降解。这样的封闭剂可以包括，但不限于，另外的相关的或不相关的肽序列，其可以 附着于多肽的氨基端和/或羧基端残基(例如，附着于氨基端氨基酸的乙酰基或者附着于羧 基端氨基酸的酰胺基)。应用本领域的普通技术人员熟悉的方法，可以在多肽合成过程中通 过化学方法或者通过重组DNA技术获得这样的附着。备选地，封闭剂，诸如焦谷氨酸或其它 本领域已知的分子，可以附着于氨基端和/或羧基端残基，或者氨基端的氨基或羧基端的羧 基可以用不同的结构部分(moiety)替代。
氨基末端的脯氨酸或Xaa-Pro-Pro(例如，Ala-Pro-Pro)序列可以是特别有用的 (参见，例如，WO00/22112)。例如，多肽可包括氨基酸序列Xaa1-Pro-Pro-Cys-Ala-Xaa2- His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr(SEQIDNO：12)，其中Xaa1是任何氨基酸(例如， Ala)，并且Xaa2是Trp、Tyr、Phe或Arg。例如，多肽可包括氨基酸序列Xaa-Pro-Pro-Cys-Ala- Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr(SEQIDNO：13)，Ala-Pro-Pro-Cys-Ala- Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr(SEQIDNO：14)，Xaa-Pro-Pro-Cys-Ala- Arg-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr(SEQIDNO：15)，Ala-Pro-Pro-Cys-Ala- Arg-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr(SEQIDNO：16)，Xaa-Pro-Pro-Cys-Ala- Phe-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr(SEQIDNO：17)，或Ala-Pro-Pro-Cys-Ala- Phe-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr(SEQIDNO：18)。备选地，多肽可包括氨基酸 序列Xaa-Pro-Pro-Asp-Cys-Ala-Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr(SEQID NO：19)，Ala-Pro-Pro-Asp-Cys-Ala-Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr(SEQID NO：20)，Xaa-Pro-Pro-Asp-Cys-Ala-Arg-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr(SEQID NO：21)，Ala-Pro-Pro-Asp-Cys-Ala-Arg-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr(SEQID NO：22)，Xaa-Pro-Pro-Asp-Cys-Ala-Phe-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr(SEQID NO：23)，Ala-Pro-Pro-Asp-Cys-Ala-Phe-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr(SEQID NO：24)，Xaa-Pro-Pro-Arg-Cys-Ala-Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr(SEQID NO：25)，Ala-Pro-Pro-Arg-Cys-Ala-Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr(SEQID NO：26)，Xaa-Pro-Pro-Arg-Cys-Ala-Arg-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr(SEQ IDNO：27)，Ala-Pro-Pro-Arg-Cys-Ala-Arg-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr(SEQ IDNO：28)，Xaa-Pro-Pro-Arg-Cys-Ala-Phe-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr (SEQIDNO：29)，或Ala-Pro-Pro-Arg-Cys-Ala-Phe-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys- Thr(SEQIDNO：30)，其中第一位置的Xaa是任何氨基酸。
本文提供的多肽可在其羧基末端具有Pro-Pro-Xaa(例如，Pro-Pro-Ala)序列。例 如，多肽可包括氨基酸序列
Cys-Ala-Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr-Pro-Pro-Xaa(SEQIDNO： 31)，Cys-Ala-Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr-Pro-Pro-Ala(SEQIDNO：32)， Cys-Ala-Arg-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr-Pro-Pro-Xaa(SEQIDNO：33)，Cys- Ala-Arg-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr-Pro-Pro-Ala(SEQIDNO：34)，Cys-Ala- Phe-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr-Pro-Pro-Xaa(SEQIDNO：35)，Cys-Ala-Phe- His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr-Pro-Pro-Ala(SEQIDNO：36)，Asp-Cys-Ala-Trp- His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr-Pro-Pro-Xaa(SEQIDNO：37)，Asp-Cys-Ala-Trp- His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr-Pro-Pro-Ala(SEQIDNO：38)，Asp-Cys-Ala-Arg- His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr-Pro-Pro-Xaa(SEQIDNO：39)，Asp-Cys-Ala- Arg-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr-Pro-Pro-Ala(SEQIDNO：40)，Asp-Cys- Ala-Phe-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr-Pro-Pro-Xaa(SEQIDNO：41)，Asp- Cys-Ala-Phe-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr-Pro-Pro-Ala(SEQIDNO：42)， Arg-Cys-Ala-Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr-Pro-Pro-Xaa(SEQIDNO： 43)，Arg-Cys-Ala-Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr-Pro-Pro-Ala(SEQID NO：44)，Arg-Cys-Ala-Arg-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr-Pro-Pro-Xaa(SEQID NO：45)，Arg-Cys-Ala-Arg-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr-Pro-Pro-Ala(SEQID NO：46)，Arg-Cys-Ala-Phe-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr-Pro-Pro-Xaa(SEQID NO：47)，或Arg-Cys-Ala-Phe-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr-Pro-Pro-Ala(SEQ IDNO：48)，其中Xaa可以是任何氨基酸。
在一些实施方案中，本文提供的多肽可在SEQIDNO：1所示的序列的氨基末端， SEQIDNO：1所示的序列的羧基末端，或两端都包含额外的氨基酸序列。例如，多肽可含有 氨基酸序列Trp-Glu-Ala-Xaa1-Cys-Ala-Xaa2-His-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Leu-Val-Trp-Cys- Xaa6-Lys-Val-Glu-Glu(SEQIDNO：49)，其中Xaan表示的残基可表现出可变性。对于SEQID NO：1所示的氨基酸序列，Xaa1可以不存在或可以是任何氨基酸(例如，Arg或Asp)；Xaa2可以 是Phe、Tyr、5-HTP、Trp或Arg；Xaa3可以是任何氨基酸；Xaa4可以是Gly或Ala；Xaa5可以是Glu 或Ala；并且Xaa6可以不存在或可以是任何氨基酸。在一个实施方案中，多肽可包括氨基酸 序列Trp-Glu-Ala-Asp-Cys-Ala-Xaa-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr-Lys-Val- Glu-Glu(SEQIDNO：50)，其中Xaa是Arg、Trp、5-HTP、Tyr或Phe。例如，多肽可包括氨基酸序 列Trp-Glu-Ala-Asp-Cys-Ala-Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr-Lys-Val- Glu-Glu(SEQIDNO：51)。
在另一个实施方案中，多肽可由氨基酸序列(Xaa1)m-Xaa2-Cys-Ala-Xaa3-His- Xaa4-Xaa5-Xaa6-Leu-Val-Trp-Cys-(Xaa7)n(SEQIDNO：52)组成，其中Xaa表示的残基可表 现出可变性，并且m和n可以独立地是从0至10的整数(例如，0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)。例 如，Xaa1可以是任何氨基酸；Xaa2可以不存在或可以是任何氨基酸(例如，Arg或Asp)；Xaa3可 以是Phe、Tyr、5-HTP、Trp或Arg；Xaa4可以是任何氨基酸；Xaa5可以是Gly或Ala；Xaa6可以是 Glu或Ala；Xaa7可以是任何氨基酸；并且m和n可以是从0至5(例如，0、1、2、3、4或5)。备选地， 多肽可由氨基酸序列(Xaa1)m-Cys-Ala-Xaa2-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr- (Xaa3)n(SEQIDNO：53)组成，其中Xaa1是任何氨基酸，Xaa2是Phe或Arg、Xaa3是任何氨基酸， 并且m和n独立地是从0至5的整数(例如，0、1、2、3、4或5)。这些实施方案中多肽的实例非限 制性地包括由以下氨基酸序列组成的多肽：Ala-Ala-Ala-Ala-Ala-Asp-Cys-Ala-Arg-His- Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Ala-Ala-Ala-Ala-Ala(SEQIDNO：54)，Ala-Ala-Arg- Cys-Ala-Arg-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr-Ala-Ala(SEQIDNO：55)，或Ala- Ala-Ala-Asp-Cys-Ala-Phe-Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr-Ala-Ala(SEQ IDNO：56)。
本文描述的多肽的氨基酸序列典型地含有两个半胱氨酸残基。含有这些氨基酸序 列的多肽由于在两个半胱氨酸残基之间形成二硫键而能够环化。本领域普通技术人员能 够，例如使用Ellman’s试剂(Ellman’sReagent)确定含有多个半胱氨酸残基的肽是否环 化。在一些实施方案中，这些半胱氨酸残基可以用能形成内酰胺键而不是二硫键的其它天 然或非天然氨基酸残基替代。例如，一个半胱氨酸残基可被天冬氨酸或谷氨酸替代，而另一 个可被鸟氨酸或赖氨酸替代。这些组合中的任一个可以产生内酰胺桥键。通过改变形成内 酰胺桥键的氨基酸，可产生本文提供的多肽，其含有与如果多肽中存在两个半胱氨酸残基 将形成的二硫键大约相等长度的桥键。
本文提供的多肽可含有氨基酸标签。“标签(tag)”通常是短的氨基酸序列，其提供通过与针对标签的抗体的相互作用或通过识别标签的其它化合物或分子检测或纯化的简便方式。例如，标签诸如c-myc、血凝素、多组氨酸或Flag可用于辅助多肽的纯化和检测。作为实例，带有多组氨酸标签的多肽可基于组氨酸残基对镍离子的亲和力(例如，在Ni-NTA柱上)纯化，可通过针对多组氨酸的抗体(例如，5组氨酸(Penta-His)抗体；Qiagen，Valencia，CA)在蛋白质印迹中检测。标签可插入至多肽序列的任何位置，尽管在氨基末端或羧基末端插入是特别有用的。
术语“氨基酸”是指天然氨基酸，非天然氨基酸，和氨基酸类似物，如果其结构允 许，全部为其D和L立体异构体。天然氨基酸包括丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、天冬酰胺 (Asn)、天冬氨酸(Asp)、半胱氨酸(Cys)、谷氨酰胺(Gln)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、组氨 酸(His)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、赖氨酸(Lys)、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、脯 氨酸(Pro)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、和缬氨酸(Val)。非天 然氨基酸包括，但不限于，5-羟色胺酸、铃兰氨酸、2-氨基己二酸、3-氨基己二酸、β-丙氨酸、 氨基丙酸、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、6-氨基己酸、2-氨基庚酸、2-氨基异丁酸、3-氨基异丁 酸、2-氨基庚二酸、2，4-二氨基异丁酸、锁链素、2，2′-二氨基庚二酸、2，3-二氨基丙酸、N-乙 基甘氨酸、N-乙基天冬酰胺、羟基赖氨酸、别-羟基赖氨酸、3-羟基脯氨酸、4-羟基脯氨酸、异 锁链素、别-异亮氨酸、N-甲基甘氨酸、N-甲基异亮氨酸、N-甲基缬氨酸、正缬氨酸、正亮氨 酸、鸟氨酸和六氢吡啶羧酸。
“类似物”是结构与另一个相似但组成稍有差别(如，一个原子被不同元素的原子 替换或存在特别的官能团)的化学化合物。因此，“氨基酸类似物”是结构与天然存在的氨基 酸分子(如典型地在天然多肽中发现的)相似，但组成有差别，从而C-末端羧基，N-末端氨 基，或侧链官能团已被化学修饰为另一个官能团。氨基酸类似物包括天然或非天然氨基酸， 其在其N端氨基或其侧链基团进行可逆或不可逆地化学阻断(blocked)、或修饰，并且包括， 例如，甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸砜、S-(羧甲基)-半胱氨酸、S-(羧甲基)-半胱氨酸亚砜和S- (羧甲基)-半胱氨酸砜。氨基酸类似物可以是天然存在的，或可以是合成制备的。氨基酸类 似物非限制性的实例包括5-羟色胺酸(5-HTP)、天冬氨酸-(β-甲酯)，天冬氨酸的类似物；N- 乙基甘氨酸，甘氨酸的类似物；以及丙氨酸氨甲酰(alaninecarboxamide)，丙氨酸的类似 物。氨基酸和氨基酸类似物的其它实例在Gross和Meienhofer，ThePeptides：Analysis，Synthesis，Biology(肽：分析、合成、生物学)，AcademicPress，Inc.(学术出版社)，纽约 (1983)中列出。
根据氨基酸残基侧链关于多肽主链附近的拓扑化学排列可以描述多肽的立体化 学，其通过氨基酸残基之间的肽键和键合的残基的α-碳原子而定义。另外，多肽主链具有不 同的末端和这样的方向。大多数天然存在的氨基酸为L-氨基酸。天然存在的多肽主要包括 L-氨基酸。
D-氨基酸是L-氨基酸的对映异构体，并且可以形成本文称为“inverso”多肽的肽 (即，对应天然肽但由D-氨基酸而非L-氨基酸组成的肽)。“retro”多肽由L-氨基酸组成，但 是具有氨基酸残基按天然肽序列的反方向组装的氨基酸序列。
天然存在的多肽的“retro-inverso”修饰包括将具有与对应的L-氨基酸相反的α- 碳立体化学的氨基酸(即，D-或D-别-氨基酸)按照与天然多肽序列相反的顺序合成组装。因 此，retro-inverso类似物具有反转的末端和反转的肽键方向，然而其近似地保留了如在天 然肽序列中的侧链的拓扑结构。术语“天然(native)”是指作为对于制备部分或完全的 retro、inverso或retro-inverso类似物的起始序列使用的L-氨基酸的任何序列。
部分retro-inverso多肽类似物是其中只有部分序列反转并且用对映异构氨基酸 残基替代的多肽。由于这样的类似物的反向反转部分具有反转的氨基端和羧基端，侧邻 retro-反向部分的氨基酸残基可以分别用类似侧链的α-取代的偕-二氨基甲烷和丙二酸替 代。备选地，多肽可以为完全的retro-inverso类似物，其中全部序列反转并且用D-氨基酸 替代。
本文件还提供基于多肽的氨基酸序列设计的拟肽(peptidomimetic)化合物。拟肽 化合物是合成的、非肽化合物，其具有基本上与选择的肽的三维构象相同的三维构象(即 “肽模体”)，并且因此可以赋予与选择的肽相同或相似的功能。拟肽化合物可以设计成模拟 本文提供的任何多肽。
具有蛋白酶抗性的拟肽化合物特别有用。并且，拟肽化合物可以具有增加治疗效 用的附加特征，诸如增加细胞渗透性和延长生物半衰期。这样的化合物典型地具有部分或 完全是非肽的主链，但是具有与在拟肽化合物所依据的肽中存在的氨基酸残基的侧链基团 相同或相似的侧链基团。一些类型的化学键(例如，酯、硫酯、硫代酰胺、逆酰胺 (retroamide)、还原羰基、二亚甲基和酮亚甲基(ketomethylene))是本领域已知的在拟肽 化合物构建中用于肽键的有效取代物。
本文描述的多肽和免疫分子之间的相互作用典型地通过免疫球蛋白的CH2-CH3裂 口发生。这样的相互作用通过物理接近发生，并且例如，通过疏水相互作用介导。多肽对于 免疫球蛋白分子的“结合亲和力”是指多肽和免疫球蛋白之间相互作用的强度。结合亲和力 典型地表示为平衡解离常数(Kd)，其以Kd＝koff/kon进行计算，此处koff＝反应的动力学解离 常数，和kon＝反应的动力学缔合常数。Kd表示为浓度，其低Kd值(例如，低于100nM)表示高亲 和力。可以与免疫球蛋白分子相互作用的多肽典型地具有对于免疫球蛋白的CH2-CH3裂口的 至少1μM(例如，至少500nM，至少100nM，至少50nM或至少10nM)的亲和力。
本文提供的多肽可以以基本相等的亲和力结合于与抗原结合的免疫球蛋白分子， 以及单体免疫球蛋白。备选地，本文描述的多肽对于与抗原结合的免疫球蛋白分子可以具 有比对于单体免疫球蛋白更高的结合亲和力(例如，至少10倍，至少100倍，或至少1000倍更 高的结合亲和力)。当抗原结合于Fab区时在免疫球蛋白分子的Fc区内发生的构象变化可能 参与亲和力的差异。结合和未结合的NC6.8Fab(来自鼠单克隆抗体)的晶体结构表明，与其 在未结合的Fab中的位置相比，Fab重链尾在抗原/抗体复合物的晶体中移动了19埃(Guddat 等(1994)J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)236-247-274)。由于在完整的抗体中Fab区的C端 尾与Fc区连接，这一移动(shift)预计将影响CH2-CH3裂口的构象。并且，完整免疫球蛋白的 一些三维结构检验揭示Fab重链和FcCH2-CH3裂口之间的直接的物理联系(Harris等(1997) Biochemistry(生物化学)36：1581-1597；Saphire等(2001)Science(科学)293：1155- 1159)。
单体(即，未结合的)IgG和免疫复合的IgG的CH2-CH3裂口的分子模型揭示单体的Fc CH2-CH3裂口具有封闭的构型(closedconfiguration)，其可以防止与关键氨基酸残基结合 (例如，His435；参见，例如，O’Brien等(1994)Arch.Biochem.Biophys.(生物化学生物物理 学档案)310：25-31；Jefferies等(1984)Immunol.Lett.(免疫学通讯)7：191-194；和West等 (2000)Biochemistry(生物化学)39：9698-9708)。然而，免疫复合的(抗原结合的)IgG具有 更加开放的构型，并且因此更加利于配体结合。例如，RF对于免疫复合的IgG的结合亲和力 比RF对于单体IgG的结合亲和力大得多(Corper等(1997)Nat.Struct.Biol.(自然结构生物 学)4：374；Sohi等(1996)Immunol.(免疫学)88：636)。典型地，相同的情形对于本文提供的 多肽也正确。
由于本文描述的多肽可以结合于免疫球蛋白分子的CH2-CH3裂口，它们可有效用于 阻断其它因子(例如，FcRn、FcR、C1q、组蛋白、MBP、SOD1和其它免疫球蛋白)与免疫球蛋白的 Fc区的相互作用，并且因此可以抑制Fc介导的免疫复合物形成。“抑制”意指与在缺乏本文 提供的多肽的条件下的免疫复合物形成水平相比，在存在所述多肽的条件下的Fc介导的免 疫复合物形成减少。这样的抑制可以在体外(例如，在测试试管中)或在体内(例如，在个体 中)发生。可以应用任何适当的方法评估免疫复合物形成的水平。在本领域内已知许多这样 的方法，并且本文描述了这些方法中的一些。
本文描述的多肽典型地以单体方式以化学计量学上1∶2的IgGFc比肽与免疫球蛋 白分子的CH2-CH3裂口相互作用(即，只与一个免疫球蛋白分子相互作用，并且因此不会将2 个或更多的免疫球蛋白分子结合在一起)。因此，通过多肽的存在排除了通过Fc区与其它免 疫球蛋白分子的相互作用。可以在体外评估Fc介导的免疫复合物形成的抑制，例如，通过在 多肽存在或不存在时，将IgG分子与标记的免疫球蛋白分子(例如，荧光或酶(ELISA)标记的 Fc受体或C1q)一起培养，并且测量结合到免疫复合物中的标记的免疫球蛋白的量进行评 估。如下文所讨论，还可以应用适于检测免疫复合物形成的其它方法。
多肽的制备和纯化
多肽可以通过许多方法生产，其中的许多方法为本领域所公知。通过举例而非限 制的方式，多肽可以通过从天然来源中(例如，从分离的细胞、组织或体液中)提取，通过编 码所述多肽的重组核酸的表达(例如，下文所描述的)，或通过化学合成(例如，通过固相合 成或本领域公知的其它方法，包括用ABI肽合成器合成；AppliedBiosystems(应用生物系 统)，FosterCity，CA)而获得。还描述了用于合成retro-inverso多肽类似物的方法 (Bonelli等(1984)Int.J.PeptideProteinRes.(国际肽蛋白研究杂志)24：553-556；和 Verdini和Viscomi(1985)J.Chem.Soc.PerkinTrans.(化学协会杂志Perkin学报)I：697- 701)，以及用于部分retro-inverso肽类似物的固相合成的一些方法(参见，例如，欧洲专利 号EP0097994)。
本文件提供编码本文所描述的多肽的分离的核酸分子。当用于本文时，“核酸”是 指RNA和DNA，包括cDNA、基因组DNA和合成的(例如，化学合成的)DNA。核酸可以是双链的或 单链的(即，有义和反义单链)。本文中所用涉及到核酸的术语“分离的(isolated)”是指这 样的天然存在的核酸，其不直接毗连这样的2个序列：所述序列是其在其所来源的生物体的 天然存在的基因组中直接毗连的序列(1个在5’端和1个在3’端)。本文中所用涉及到核酸的 术语“分离的”还包括任何非天然存在的核酸序列，其原因在于所述非天然存在的序列不存 在于自然中并且在天然存在的基因组中没有直接毗连的序列。
分离的核酸可以是，例如，DNA分子，条件是在天然存在的基因组中与DNA分子通常 直接毗连的核酸序列之一被移除或不存在。因此，分离的核酸包括，但不限于，不依赖其它 序列作为独立的分子存在的DNA分子(例如，化学合成的核酸、或通过PCR或限制性核酸内切 酶处理产生的cDNA或基因组DNA片段)，以及引入到载体、自主复制的质粒、病毒(例如，逆转 录病毒、慢病毒、腺病毒或疱疹病毒)、或引入到原核或真核的基因组DNA中的DNA。另外，分 离的核酸可以包括工程核酸，诸如重组DNA分子，其为杂交或融合核酸的一部分。例如，在 cDNA文库或基因组文库、或含有基因组DNA限制性内切消化液的凝胶切片内的数百至数百 万其它核酸中存在的核酸不被认为是分离的核酸。
本文件还提供含有本文所描述的核酸的载体。当用于本文时，“载体(vector)”是 一种复制子，诸如质粒、噬菌体、或粘粒，其中可以插入其它DNA片段，以使所插入的片段得 以复制。例如，多肽可使用噬菌体展示产生。本领域技术人员熟知的方法可使用噬菌体展示 产生本文描述的多肽。例如，载体可以是表达载体，其中核苷编码带有起始密码子甲硫氨酸 的本文提供的多肽，其可操作地连接于表达控制序列。当用于本文时，“可操作地连接 (operablylinked)”意指结合到遗传构建体中以便表达控制序列有效地控制目的编码序 列的表达。“表达控制序列(expressioncontrolsequence)”为控制和调节其它DNA序列的 转录和翻译的DNA序列，以及“表达载体(expressionvector)”是包括表达控制序列的载 体，以便转录和翻译结合到载体中的相关的DNA片段。当RNA聚合酶将编码序列转录成mRNA 时，所述编码序列“可操作地连接”并且受到细胞中转录和翻译控制序列的“控制”，该mRNA 然后翻译成由所述编码序列编码的蛋白。
可以应用本领域的技术人员熟知的方法将编码目的多肽的分离的核酸分子亚克 隆到表达载体中，所述表达载体包含相关编码序列和适当的转录/翻译控制信号。参见，例 如，Sambrook等，MolecularCloning：ALaboratoryManual(分子克隆：实验室指南)(第二 版)，ColdSpringHarborLaboratory(冷泉港实验室)，纽约(1989)；和Ausubel等， CurrentProtocolsinMolecularBiology(现代分子生物学方案)，GreenPublishing AssociatesandWileyInterscience，纽约(1989)。如本文所述，表达载体可以用于各种 系统(例如，细菌、酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞)。适宜的表达载体的实例包括，但不限 于，质粒和源自，例如，疱疹病毒、逆转录病毒、痘苗病毒、腺病毒以及腺伴随病毒的病毒载 体。可以商购获得广泛多样的适宜的表达载体和系统，包括pET系列的细菌表达载体 (Novagen，Madison，WI)、腺-X表达系统(Clontech)、Baculogold杆状病毒表达系统 (BDBiosciencesPharmingen，SanDiego，CA)和pCMV-Tag载体(Stratagene，LaJolla， CA)。
编码本文描述的多肽的表达载体可以用于生产多肽。可以用于多肽的小量或大量 生产的表达系统非限制性地包括，微生物，诸如细菌(例如，大肠杆菌(E.coli)和枯草芽孢 杆菌(B.subtilis)，其转化了含有本文提供的核酸分子的重组噬菌体DNA、质粒DNA、或粘粒 DNA；酵母(例如，酿酒酵母(S.cerevisiae))，其转化了含有本发明的核酸分子的重组酵母 表达载体；昆虫细胞系统，其感染了含有本文提供的核酸分子的重组病毒表达载体(例如， 杆状病毒)；植物细胞系统，其感染了含有本文提供的核酸分子的重组病毒表达载体(例如， 烟草花叶病毒)或转化了含有本文提供的核酸分子的重组质粒表达载体(例如，Ti质粒)；或 哺乳动物细胞系统(例如，初级细胞或无限增殖化细胞，诸如COS细胞、CHO细胞、HeLa细胞、 HEK293细胞和3T3L1细胞)，其带有含有源自哺乳动物细胞基因组的启动子(例如，金属硫 蛋白启动子)或源自哺乳动物病毒的启动子(例如，腺病毒后期启动子和巨细胞病毒启动 子)，以及本文提供的核酸分子的重组表达构建体。
当用于本文时，术语“纯化的多肽(purifiedpolypeptide)”是指这样的多肽：其 没有天然存在的负体(counterpart)(例如，拟肽)，或是化学合成的并且因此不被其它多肽 污染，或者是从其天然伴随的其它细胞成分中分离或纯化出来的(例如，其它细胞蛋白、多 聚核苷酸或细胞成分)。典型地，当多肽为至少70干重％，没有与其天然缔合的蛋白和天然 存在的有机分子时，认为其是“纯化的”。因此，纯化的多肽的制剂可以是，例如，至少80干 重％、至少90干重％或至少99干重％的多肽。用于纯化多肽的适合的方法可包括，例如，亲 和层析、免疫沉淀法、大小排阻层析以及离子交换层析。可以通过适当的方法测量纯化的程 度，这些方法包括，但不限于：柱层析、聚丙烯酰胺凝胶或高效液相色谱。
建模、设计和鉴别化合物的方法
本文件提供用于设计、建模和鉴别化合物的方法，所述化合物可以结合于免疫球 蛋白分子的CH2-CH3裂口，并且因此作用为Fc介导的免疫复合物形成的抑制剂。此处，这样的 化合物还叫作“配体(ligands)”。通过这些方法设计、建模或鉴别的化合物典型地可以通过 CH2-CH3裂口与免疫球蛋白分子相互作用，并且典型地对于免疫球蛋白的CH2-CH3裂口具有 至少1μM(例如，至少500nM，至少100nM，至少50nM，或至少10nM)的结合亲和力。所述化合物 对于免疫复合的免疫球蛋白分子通常具有比对于单体免疫球蛋白分子更高的结合亲和力 (例如，至少10倍，至少100倍，或至少1000倍更高的结合亲和力)。
化合物典型地以单体方式与免疫球蛋白分子的CH2-CH3裂口相互作用(即，只与一 个免疫球蛋白分子相互作用，并且因此不会将2个或更多的免疫球蛋白分子结合在一起)。 化合物分子和免疫球蛋白分子之间的相互作用典型地涉及免疫球蛋白的位置252、253、435 和436的氨基酸残基(按照Kabat编号，如前所述)。例如，SEQIDNO：20(NB-406)可具有与 IgGFcMet-252、Ile-253、Ser-254、His-435和Tyr-436的疏水堆积(hydrophobicpacking)， (例如，SEQIDNO：20中Trp-14的吲哚环可与IgGFcHis-435具有疏水相互作用)。IgGFc Asn-434、His-435或Tyr-436的丙氨酸取代可破坏结合(ΔΔG≥1.5kcal/mol)。此外，SEQ IDNO：20Val-13或Trp-14的丙氨酸取代可导致结合的破坏(ΔΔG≥2.0kcal/mol)。
化合物和CH2-CH3裂口之间的相互作用使得所述化合物能够通过阻断其它因子(例 如，Fc：Fc相互作用、FcγRs、FcRn、组蛋白、MBP、MOG、RF、Tau蛋白、α-synuclein、SOD1、TNF和 C1q)与CH2-CH3裂口的结合而抑制Fc介导的免疫复合物的形成。
通过本文提供的方法鉴别的化合物可以是多肽，诸如，例如，本文所描述的那些。 备选地，化合物可以是能够特异性结合于免疫球蛋白分子CH2-CH3裂口的任何适宜类型的分 子。
“建模(modeling)”意指基于三维结构信息和受体-配体相互作用模型对受体-配 体结构/功能进行的定量和/或定性的分析。这包括常规的基于数值的分子动力学和能量最 小化模型、交互式计算机立体图、修饰的分子力学模型、距离几何学和其它基于结构的限制 模型。建模典型地使用计算机进行，并且可以使用已知方法进一步最优化。
设计与已经结合抗原的免疫球蛋白分子CH2-CH3裂口特异性(即，以高亲和力)结合 的配体的方法典型地是基于计算机的，并且包括使用具有能够产生原子模型的程序的计算 机。对于设计可以与FcCH2-CH3裂口相互作用的配体，应用X-射线结晶学数据的计算机程序 是特别有用的。例如，诸如RasMol的程序可以用于产生CH2-CH3裂口的三维模型和/或确定参 与配体结合的结构。诸如INSIGHT(Accelrys，Burlington，MA)、GRASP(AnthonyNicholls， ColumbiaUniversity)、Dock(MolecularDesignInstitute，UniversityofCalifornia atSanFrancisco)和Auto-Dock(Accelrys)的计算机程序允许进一步的处理和引入新结 构的能力。
方法可以包括，例如，给计算机提供位于Fc介导的免疫复合物中的免疫球蛋白分 子CH2-CH3裂口内的氨基酸残基(例如，在裂口的位置252、253、435和436的氨基酸残基)的原 子结构坐标，使用计算机来产生CH2-CH3裂口的原子模型，进一步提供候选化合物的原子结 构坐标和产生最佳定位于CH2-CH3裂口内的化合物的原子模型，并且，如果所述化合物与裂 口位置252、253、435和436的氨基酸残基相互作用，鉴定候选化合物为目的配体。提供给计 算机的数据还可以包括除了在位置252、253、435和436之外的氨基酸残基的原子坐标。“最 佳定位于(optimallypositioned)”意指进行定位以最优化候选化合物和CH2-CH3裂口的位 置252、253、435和436的氨基酸残基之间的疏水性相互作用。
备选地，用于设计具有对于免疫球蛋白分子CH2-CH3裂口的特异结合亲和力的配体 的方法可以利用在其内存中存储裂口的原子模型的计算机。然后，可以将候选化合物的原 子坐标提供给计算机，并且可以产生最佳定位的候选化合物的原子模型。如本文所描述，可 以鉴定候选化合物为具有对于免疫球蛋白分子CH2-CH3裂口的特异结合亲和力的配体，条件 是，例如，所述化合物与裂口的位置252、253、435和436的氨基酸残基相互作用。
此类方法已经显示单体(无抗原结合的)IgGFc在与IgGFcCH2-CH3裂口不同的位 点，诸如较低的铰链区结合(Wines等(2000)J.Immunol.(免疫学杂志)164：5313-5318)，而 免疫复合的(结合抗原的)IgGFc与FcγIIa的结合被IgM类风湿因子(RF-AN)抑制，其已经 通过3D结构显示仅结合至IgGFcCH2-CH3界面裂口(Sohi等(1996)Immunology(免疫学)88： 636-641；和Corper等(1997)NatureStruct.Biol.(自然结构生物学)4(5)：374-381)。可溶 的FcγIIa抑制免疫复合的(而非单体的、非-免疫复合的)IgGFc与RF-AN的结合(Wines等 (2003)Immunol.(免疫学)109：246-254)，并且结合至IgGFcCH2-CH3裂口的抑制剂(诸如本 文描述的肽)抑制免疫复合的(结合抗原的)IgGFc与FcγRs的结合。
还可以应用其它基于结构的设计/建模技术，从本文所述的化合物的结构信息交 互式地设计化合物(参见，例如，Jackson(1997)SeminarsinOncology(肿瘤学讲座)24： L164-172；和Jones等(1996)J.Med.Chem.(医学化学杂志)39：904-917)。
化合物和多肽还可以通过，例如，通过计算机模拟(computermo)鉴定候选化合物 进行鉴定，其空间地并优选地适配(即，以高亲和力)到免疫球蛋白分子的CH2-CH3裂口，然后 关于抑制Fc介导的免疫复合物形成的能力在体外或体内来筛选那些化合物。对于所述体外 和体内筛选适用的方法包括本文所描述的那些。
组合物和产品
本文件提供组合物和产品，其可用于治疗由异常Fc介导的免疫复合物形成(例如， Fc介导的免疫复合物超量生产)引起的病症的方法中。本文提供的多肽、化合物和组合物可 施用给患有病毒感染的受试者(例如，人或其它哺乳动物)并抑制IgGFc与mC1q、sC1q、Fcγ Rs和FcRn的免疫复合，所述病毒感染例如可以通过调节Fc介导的免疫复合物形成而减轻。 典型地，可以给怀疑患有与免疫复合物形成相关的疾病或病症的受试者施用一种或多种多 肽或者化合物。组合物一般含有本文所述的一种或多种多肽和化合物。CH2-CH3结合多肽，例 如，可以处于药用载体或稀释剂中，并且可以按量和周期施用，所述的量和周期将取决于具 体疾病的性质、其严重度和受试者的总体情况而变化。典型地，所述多肽以抑制量(即，以有 效抑制多肽接触的细胞或组织中免疫复合物的产生的量)来施用。本文描述的多肽和方法 还可以预防性地应用，例如，将处于免疫复合物异常或超量生产的风险的受试者(例如，移 植受体)中的免疫反应性减小到最低。
多肽抑制Fc介导的免疫复合物形成的能力可以通过，例如，在治疗之前和之后测 量受试者中免疫复合物的水平进行评估。许多方法可以用于测量组织或生物样品中免疫复 合物水平，其包括本领域公知的那些方法。例如，如果受试者是研究动物，可以通过安乐处 死后的免疫染色评估关节中的免疫复合物水平。还可以通过直接方法，诸如测量血清样品 中的循环免疫复合物的水平，来评估抑制性多肽的效用。备选地，可以应用间接方法来评估 多肽在活的受试者中的效用。例如，可以从免疫介导的疾病的临床改善推断减少的免疫复 合物形成，或其体外或体内模型已经显示出是治疗动脉粥样硬化(Atherosclerosis)的治 疗用途中必需的。
用于配制和后续施用的治疗组合物的方法是为本领域的技术人员公知的。剂量定 量通常取决于要治疗的疾病状态的严重度和反应性，治疗的疗程持续几天到几个月，或者 直到实现治愈或获得疾病状态的减轻。本领域的普通技术人员常规确定最适剂量、给药方 法和重复率。最适剂量可以取决于各多肽的相对潜能(potency)而变化，并且通常可以基于 在体外和体内动物模型中发现有效的EC50进行估算。典型地，剂量为0.01μg-100g/kg体重， 并且可以每天1次或多次、每周2次(biweekly)、每周1次、每月1次或甚至更不经常地给药。 成功治疗后，可能需要让患者经受维持治疗，以防止所述疾病状态的复发。
本文件提供包含本文描述的多肽和/或化合物的药用组合物和制剂。因此，多肽可 以与其它分子、分子结构、或化合物的混合物，诸如，例如，脂质体、聚乙二醇、受体靶点分 子、或者口服、直肠、局部或其它制剂，进行混合、胶囊化、缀合或缔合，用于辅助摄入、分布 和/或吸收。
“药用载体”(本文也叫作“赋形剂”)是用于运送一种或多种治疗化合物(例如， CH2-CH3结合多肽)到受试者的药用溶剂、混悬剂或其它任何药理学惰性赋形剂。药用载体可 以是液体或固体，并且，当其与一种或多种治疗化合物和给出的药用组合物的任何其它成 分组合时，可以考虑计划的施用方式进行选择，以便提供需要的体积、密度(consistency) 和其它相关的转运和化学特性。不与氨基酸有害反应的典型的药用载体包括，通过举例方 式但不限于：水；盐溶液；结合试剂(例如，聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填充剂 (例如，乳糖和其它糖，明胶，或硫酸钙)；滑润剂(例如，淀粉，聚乙二醇或乙酸钠)；崩解剂 (例如，淀粉或羧甲淀粉钠(sodiumstarchglycolate))；以及湿润剂(例如，十二烷基硫酸 钠)。
药用组合物可以通过许多方法施用，其取决于需要的是局部还是全身性的治疗， 以及要治疗的面积。例如，施用可以是局部的(经皮的(transdermal)、舌下的、眼部的、或鼻 内的)；肺部的(例如，通过粉剂或气溶胶剂的吸入或吹入)；口服的；或肠胃外的(例如，通过 皮下、鞘内、心室内、肌内、或腹膜内注射，或者通过静脉内点滴)。施用可以是快速的(例如， 通过注射)或者可以在一段时间内发生(例如，通过缓慢灌输或施用缓慢释放制剂)。对于治 疗中枢神经系统内的组织，可以通过注射或灌输将CH2-CH3结合多肽施用到脑脊髓液中，优 选地和一种或多种能够促进所述多肽穿过血脑屏障的渗透性的药剂一起施用。
用于CH2-CH3结合多肽局部施用的制剂包括，例如，无菌的和非无菌的水性溶液，在 诸如醇类的常规溶剂中的非水性溶液，或者在液态或固态油基(oilbases)中的溶液。这样 的溶液还可以含有缓冲剂、稀释剂以及其它适宜的添加剂。用于局部施用的药用组合物和 制剂可以包括经皮贴片(transdermalpatches)、油膏、洗剂、膏剂、凝胶、滴剂、栓剂、喷雾 剂、液体和粉剂。鼻部喷雾剂特别有效，并且可以通过，例如，喷雾器或其它鼻部喷雾装置进 行施用。通过吸入器的施用也是特别有效的。常规药用载体、水、粉剂或油基、增稠剂等可以 是必要的或是需要的。
用于口服施用的组合物和制剂包括，例如，粉剂或粒剂、处于水或非水性介质中的 混悬液或者溶液、胶囊、香囊或片剂。这样的组合物还可以结合增稠剂、调味剂、稀释剂、乳 化剂、分散辅剂或粘合剂。
用于肠胃外、鞘内或心室内施用的组合物和制剂可以包括无菌的水性溶液，其还 可以含有缓冲剂、稀释剂和其它适当的添加剂(例如，渗透增强剂、载体化合物和其它药用 载体)。
药用组合物包括，但不限于，溶液、乳剂、水性混悬液和含脂质体制剂。这些组合物 可以从各种成分产生，其中所述成分包括，例如，预制的液体、自身乳化固体和自身乳化半 固体。乳剂通常为两相系统，其包括密切混合并且分散在彼此之中的2个不相溶的液相；一 般地，乳剂是油包水(water-in-oil，w/o)或水包油(oil-in-water，o/w)种类。由于其配制 的容易度和溶解、吸收以及生物利用度的功效，乳剂制剂已经广泛地用于口服递送治疗。
脂质体是具有由亲脂性材料形成的膜和可以包含待递送组合物的水性内部的小泡。脂质体可以特别有效，这归因于其在从药物递送的观点上提供的特异性和作用的持续性。脂质体组合物可以由，例如，磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、或二油酰磷脂酰乙醇胺形成。许多亲脂性试剂可以商购，包括Lipofectin(Invitrogen/LifeTechnologies，Carlsbad，CA)和EffecteneTM(Qiagen，Valencia，CA)。
多肽还可包含任何药用盐、酯或者所述酯的盐、或任何其它化合物，所述其他化合 物在施用给包括人在内的动物时，能够(直接地或间接地)提供生物活性代谢物或其残基。 因此，例如，本文件提供多肽的药用盐、前药以及所述前药的药用盐、和其它生物等价物。术 语“前药(prodrug)”是指一种治疗药剂，其以无活性形式制备，并且通过内源酶或其它化学 制剂和/或条件的作用在体内或其细胞内转变成活性形式(例如，药物)。术语“药用盐 (pharmaceuticallyacceptablesalts)”是指本文提供的多肽在生理学上和制药学上可 用的盐(即，保留亲本多肽(parentpolypeptide)的需要的生物活性而没有提供不需要的 毒性作用的盐)。药用盐的实例包括，但不限于，与阳离子(例如，钠、钾、钙或多胺，诸如精 胺)形成的盐；与无机酸(例如，盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸或硝酸)形成的酸式加成盐；以及与 有机酸(例如，乙酸、柠檬酸、草酸、棕榈酸或富马酸)形成的盐。
含有本文提供的多肽的药用组合物还可以结合促进多肽向动物皮肤的有效递送 的渗透增强剂。渗透增强剂可以增强亲脂性和非亲脂性药物穿过细胞膜的扩散。渗透增强 剂可以分类为属于5大类的之一，即，表面活性剂(例如，十二烷基硫酸钠、聚氧乙烯-9-十二 烷基醚和聚氧乙烯基-20-十六烷基醚)；脂肪酸(例如，油酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸和硬 脂酸)；胆盐(bilesalts)(例如，胆酸、脱氢胆酸和脱氧胆酸)；螯合剂(例如，乙二胺四乙酸 二钠、柠檬酸和水杨酸盐)；以及非螯合非表面活性剂(例如，不饱和环状尿素)。备选地，抑 制性多肽可以通过离子电渗疗法递送，其包括带有电荷的经皮贴片以“驱动”多肽通过皮 肤。
本文提供的一些实施方案包括药用组合物，其包含(a)一种或多种多肽，和(b)一 种或多种通过不同机制作用的其它试剂。例如，组合物可以包括消炎药物，其包括但不限于 非类固醇消炎药物和皮质类固醇，以及抗病毒药物，其包括但不限于利巴韦林 (ribivirin)、阿糖腺苷(vidarabine)、阿昔洛韦(acyclovir)和更昔洛韦(ganciclovir)。 其它非多肽试剂(例如，化学治疗试剂)也在本文件的范围内。所述组合的化合物可以一同 或先后使用。
组合物另外可以包含常规存在于药用组合物中的其它辅助成分。因此，所述组合 物还可以包括相容的、药用活性材料，诸如例如，止痒剂、收敛剂、局部麻醉剂或消炎药物、 或者有效用于在物理上配制本文提供的多肽的不同剂量形式的添加材料，诸如染料、调味 剂、防腐剂、抗氧化剂、遮光剂、增稠剂和稳定剂。并且，所述组合物可以与辅剂，例如，滑润 剂、防腐剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、用于影响渗透压的盐、缓冲剂、着色剂、调味剂以及芳 香物质混合。然而，当添加时，这样的材料不应该不适当地妨碍本文提供的组合物内的多肽 成分的生物活性。如要需要，可以将制剂灭菌。
可以按照制药工业中公知的常规技术制备药用制剂，其可以便利地以单位剂量形 式存在。所述技术包括使活性组分(例如，本文提供的CH2-CH3结合多肽)与需要的药用载体 或赋形剂缔合的步骤。典型地，可以通过这样的方式制备所述制剂：均一地并且使活性组分 与液态载体或细碎的固体载体或者两者紧密缔合，然后，如果必要，将产品定型。如果需要， 可以将制剂灭菌，条件是灭菌方法不妨碍制剂中包含的多肽的效力。
本文描述的组合物可以配制成许多可能的剂量形式的任何一种，诸如，但不限于， 片剂、胶囊、液态糖浆、软凝胶、栓剂和灌肠剂。组合物还可以配制成在水性、非水性或混合 介质中的混悬液。水性混悬液还可以包含增加所述混悬液黏度的物质，其包括，例如，羧甲 基纤维素钠、山梨糖醇和/或葡聚糖。混悬液还可以包含稳定剂。
CH2-CH3结合多肽可以与包装材料组合，并且作为用于减少Fc-介导的免疫复合物 形成的试剂盒出售。用于生产产品的成分和方法是公知的。产品可以与前述部分提出的一 种或多种多肽和化合物组合。另外，产品还可以包括，例如，缓冲剂或其它用于减少免疫复 合物形成或监测减少的免疫复合物形成的控制试剂。描述所述多肽怎样有效用于减少Fc- 介导的免疫复合物形成的说明书可以包含在这样的试剂盒中。
登革热
登革热是世界上最流行的蚊传播的病毒疾病，在热带地区有超过25亿人处于感染 风险中。登革热主要通过居住于城市中的埃及伊蚊(Aedesaegypti)(其也称为埃及伊蚊 (Stegomyiaaegypt))传播到人，该蚊也传播黄热病病毒。第二次世界大战时期的消灭黄热 病的运动在目标地区有控制登革热(Dengue)的额外益处。然而，在过去三十年中，这些运动 的停止和热带地区快速的城市化使得登革热再度出现。
登革热病毒(DENV)有四种血清型，每种能够感染同一个人。登革热感染可以使无 症状的，或导致一系列症状，其范围包括使人虚弱的发热到可能致命的登革出血热(DHF)和 登革休克综合征(DSS)。大约1％的登革热病例发展成DHF。
通过以下方式产生了登革热体内模型：使用人CD34+造血干细胞来异种移植新生 RAG2-/-γc-/-小鼠，导致从头(denovo)产生人适应性免疫系统的主要功能细胞 (Kuruvilla等(2007)Virol.(病毒学)369：143-152)。为评价对于DENV感染的易感性，人源 化小鼠通过DEN-2血清型进行攻击。在感染小鼠中检测到持续达3周的病毒血症，病毒滴度 达106.3RNA拷贝/ml，并且也注意到登革热的发热特征。此外，抗体捕获ELISA(为了评价人 抗-登革热抗体的存在)在感染后两周显示抗-登革热IgM，其后在6周显示IgG。也发现有些 感染小鼠的血清能够中和登革热病毒。
巨噬细胞在登革热发病机制中是重要的，但DENV感染的起始似乎在巨噬细胞参与 之前。特别地，已经显示对于DENV感染树突状细胞(DC)比单核细胞或巨噬细胞10倍更易感 (permissive)。在皮肤和皮下组织中也存在肥大细胞，预期其在蚊叮咬后不久接触登革热 病毒体(Viron)。除了DC和血液单核细胞和巨噬细胞之外，肥大细胞易受抗体-增强的登革 热病毒感染的影响，产生许多炎症介质(例如，IL-1、IL-6和CCL5)。参与抗体-增强的肥大细 胞登革热病毒感染的FcRs似乎是FcγRIIa/b。如本文中实施例2中的表3所示，SEQIDNO： 20大约90％的有效阻断免疫复合物与FcγRIIa/b的结合。因此，诸如此类的多肽在DC、肥大 细胞、巨噬细胞和单核细胞中对DENV感染的ADE具有显著影响。
循环免疫复合物(Circulatingimmunecomplexes，CIC)在DHF的免疫发病中也发 挥作用。基于CIC对IgG-包被的乳胶颗粒通过C1q的凝集反应的抑制活性，已经在DHF患者的 血清中检测到CIC(Agnello等(1970)Immunol.(免疫学)19：909-919；和Agnello等(1971) J.Exp.Med.(实验医学杂志)134：228-241)。这种乳胶技术提供了简单的半定量的方法，其 可证明DHF的早期过程中患者的血清中存在IC(Ruangjirachuporn等(1979) Clin.Exp.Immunol.(临床实验免疫学)36：46-53)。此外，大拉吉细胞(Rajicell)免疫荧光 法(Theophilopoulos(1976)J.Clin.Invest.(临床研究杂志)57：169-82)已经显示大尺寸 的CIC在DHF的晚期产生。通过使用拉吉细胞吸附去除这些复合物降低了或消除了在拉吉细 胞免疫荧光测定以及在乳胶技术中的反应性。因此，这些研究确认DHF血清中的登革热抗 原-抗体复合物和拉吉细胞表面之间反应的特异性。此外，已经显示含有病毒的IC在DHF患 者的退热期持续存在。
如在本文实施例3中讨论的，失活的DENV2病毒体(DENV-2病毒株16681)可贪婪地 结合异源、非-DENV-相关的、过氧化物酶-抗-过氧化物酶免疫复合物。基于结构分析(Zhang 等(2004)Structure12：1607-1618)，贪婪结合(avidbinding)的一个可能原因是DENV包 膜蛋白结构域III可能负责同源和异源IgG免疫复合物结合。第二弱IC结合蛋白是非-结构 蛋白1(non-structuralprotein1，NS1)，其大量释放到DENV感染个体的血清中，并且也存 在于DENV病毒体本身内部和DENV感染的细胞表面上。在下述实施例6中显示了DENVNS1结 合非-DENV相关免疫复合物(PAP-IC)的结果，以及通过NB406(SEQIDNO：20； APPDCAWHLGELVWCT)抑制NS1结合IC的结果。此外，实施例2中的表3显示SEQIDNO：20超过 90％地抑制FcyRIIa或FcyRIIb与免疫复合的IgGFc的结合，表明SEQIDNO：20可消除DC中 由低于中和DENV抗体滴度(sub-neutralizingDENVantibodytiters)导致的ADE。
应用CH2-CH3结合多肽来抑制Fc-介导的免疫复合物形成的方法
CH2-CH3结合多肽可以用于Fc-介导的免疫复合物(IC)形成的体外测定。例如，所述 方法有效用于评估CH2-CH3裂口-结合多肽阻断Fc-介导的IC形成的能力。体外方法可以包 括，例如，在本文提供的多肽存在和不存在的情况下，将免疫球蛋白分子(例如，抗原结合的 免疫球蛋白分子)和效应器分子(例如，mC1q、sC1q、FcRs和FcRn或其它抗体)接触，并且确定 每份样品中IC形成的水平。IC形成的水平可以通过，例如，具有考马斯兰或银染色的聚丙烯 酰胺凝胶电泳，或者通过共免疫沉淀进行评估。所述方法为本领域的普通技术人员所知，并 可用于测试候选多肽或化合物抑制与例如传染性病毒病相关的IC形成的能力。
本文提供的方法还可用来抑制受试者中的IC形成，和通过抑制Fc-介导的IC形成 来治疗受试者中的传染性病毒病。这样的方法可包括，例如，给受试者施用任何本文描述的 多肽，或含有任何本文描述的多肽的组合物，该受试者患有或处于患有或发生传染性病毒 病(例如登革热)的风险中。例如，一种方法可包括给个体施用含有包括氨基酸序列Cys- Ala-Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr(SEQIDNO：10)的多肽的组合物。备选 地，一种方法可包括给受试者施用包含下列氨基酸序列的多肽：Asp-Cys-Ala-Trp-His- Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr(SEQIDNO：2)，Xaa-Pro-Pro-Asp-Cys-Ala-Trp-His- Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr(SEQIDNO：19；其中Xaa是任何氨基酸)或Ala-Pro- Pro-Asp-Cys-Ala-Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr(SEQIDNO：20)。
在一些实施方案中，当病毒病是登革热时，可施用多肽以抑制IC形成，该IC形成与 登革热或DENV感染的ADE相关，或促进DENV感染的增强。该多肽可以，例如，导致DENV感染的 临床或组织学(histiological)改善，导致DENV感染的一种或多种组织学特征的改善或延 缓其发生，和/或降低DENV感染(例如，DENV感染如DHF或DSS)的ADE。在一些情况下，该多肽 能抑制抗-DENV异源IgGIC与FcγR的结合，抑制IC的形成，该IC促进DENV感染ADE的免疫发 病，抑制DENV病毒体与IgGIC的结合，抑制DENV蛋白(例如，NS1)与IgG免疫复合物的结合，抑 制TNF-α与IgGIC的结合，抑制DENV-IgGIC与FcγI、FcγIIaH131等位基因、FcγIIa R131等位基因、FcγRIIb、FcγRIIc、FcγRIIIa或FcyγIIIb的结合，和/或抑制DENV-IgG IC与mC1q或sC1q的结合。
本发明将在下述实施例中进一步描述，所述实施例不限制权利要求中描述的本发 明的范围。
实施例
用于测定配体与CH2-CH3裂口结合的体外测定法.
已经应用包括酶联免疫吸附测定(ELISA)的体外测定法来证明本文描述的多肽和 化合物对免疫复合的IgGFc与免疫介导因子(诸如FcRs：(FcγRI、FcγIIa、FcγRIIb/c、Fc γRIIIa/b)、FcRn、mC1q和sC1q)结合的(竞争性)抑制。参见，例如本文的实施例，以及美国 专利公号20070225231和20070276125，以及PCT公开号WO2007/030475。标准的试剂和ELISA 试剂盒有效用于减少成本并且增加实验的重复性。
在标准的ELISA中，将抗原免疫吸附到塑料微孔上。适当封闭和洗涤后，将具有针 对抗原的特异性的初级抗体添加到微孔中。再洗涤一次后，将针对初级抗体并且与诸如辣 根过氧化物酶(HRP)的酶标记物缀合的二级抗体添加到微孔中。在另一洗涤循环后，添加适 当的酶底物。如果形成抗原与初级抗体与二级抗体/HRP缀合物，缀合的酶催化与底物的比 色化学反应，其用微量培养板读数仪(microplatereader)或分光光度计读数。通过标准化 抗原和二级抗体/HRP缀合物的水平，确定初级抗体(可变的)的效价(titer)。在标准的 ELISA系统中，初级抗体通过其位于Fab臂中的互补决定区(CDR)与抗原结合。同样地，二级 抗体/HRP缀合物通过其CDRFab区与初级抗体结合。由于HRP缀合到二级抗体的Fc区，直接 的Fc结合非常有限或者被消除了。
由于这一原因，已应用“反式ELISA”技术来评估Fc区与结合于免疫复合的IgGFc 的配体的结合。在反式ELISA中，所述酶(例如，HRP)没有共价缀合到二级抗体的Fc部分。相 反地，应用预制的过氧化物酶-兔(或小鼠)抗-过氧化物酶IgG的免疫复合物(“PAP”复合 物)。在这种方法中，HRP用作抗原，同时也用作酶标记物，但是不封闭Fc区。在反式ELISA系 统中，FcCH2-CH3裂口结合配体(例如，纯化的人C1q)结合于微孔平板上。在不存在竞争者 时，PAP复合物结合于固定的配体，并且在HRP和其底物之间的反应产生信号。抑制PAP与固 定的配体结合的多肽和化合物减少这种信号。
实施例1-C1q结合的抑制：
将2μl的兔抗-过氧化物酶(SigmaChemicalsProductP7899)与50μl的过氧化 物酶(Sigma-AldrichP6782)在1ml的蒸馏水中混合形成PAP复合物。PAP(100μl)与100μl的 肽预先温育1小时，100μl与100μl的肽或人C1q(QuidelCorp.)预先温育1小时。将C1q/PAP 和肽/PAP混合物(100μl)与C1q包被的培养板一起温育30分钟。洗涤后，将培养板与ATBS (QuidelCorp.)温育15分钟，并在405nm读数。结果在表1中显示。
表1
APPDCAWHLGELVWCT(SEQIDNO：20)导致C1q结合的最大抑制，几乎等于C1q本身。 肽APPCARHLGELVWCT(SEQIDNO：16)给出次最好的结果。
实施例2-通过SEOIDNO：20抑制FcR与PAP-IC的结合
一旦应用C1q测定法建立起反式ELISA方法，应用FcγIIa、FcγIIb和FcγIII代替 C1q重新设计测定法。将高度纯化的FcγIIa、FcγIIb和FcγIII(R&DSystems， Minneapolis，MN)免疫吸附到塑料微孔上。在将FcγR反式ELISA系统最优化之后，应用本文 提供的多肽进行简单的竞争性抑制实验，以研究其对于免疫复合物与纯化的FcγR结合的 抑制能力。
将Falcon微量滴定板用高度纯化的FcγIIa、FcγIIb和FcγIII的1∶10稀释液包 被，并且温育24小时。洗涤该板，然后用5XBSA封闭溶液(AlphaDiagnosticInternational (国际阿尔法诊断)，SanAntonio，德克萨斯)封闭24小时。如实施例1的描述形成PAP免疫复 合物。PAP(100μl)与100μl的肽预先温育1小时。将PAP/肽混合物添加到FcR包被的培养板上 并温育1小时。洗涤后，将培养板与ABTS底物(QuidelCorp.)温育15分钟并且在450nm读数。 结果在表2中显示。
表2
肽APPDCAWHLGELVWCT(SEQIDNO：20)似乎导致对FcR与PAP结合的最大总体抑制， 其次是肽DCAWHLGELVWCT(SEQIDNO：2)。
重复了对于SEQIDNO：20的实验。Costar微量滴定板用高度纯化的FcγIIa(His 131等位基因akaH161)、FcγIIb和FcγIIIb的1∶10稀释液包被，并且温育24小时。洗涤该 板，然后用10mg/ml的BSA封闭溶液封闭24小时。如实施例2的描述形成PAP免疫复合物。PAP (100μl)与100μl的肽预先温育1小时。将PAP/肽混合物添加到FcγR包被的培养板上并温育 1小时。洗涤后，将培养板与ABTS底物温育15分钟并且在450nm读数。结果在表3中显示。
表3
*注：(H131等位基因)
因此，SEQIDNO：20抑制所有三种主要类别的Fc受体(FcγI、FcγIIa/FcγIIb和 FcγIII)与可溶性PAP免疫复合物的结合。
实施例3-失活的DENV2病毒体(virons)结合非-DENV免疫复合物
使用ELISA包被缓冲液(AlphaDiagnosticInternational(国际阿尔法诊断))在 4℃将大约1ng的DENV2(病毒株16681；MicrobixCorp.)包被至Costar微量滴定板24小时。 24小时后，通过ELISA洗涤溶液(QuidelCorp.)洗涤该板五次，并通过高度纯化的BSA封闭1 小时。洗涤五次后，PAPIC与DENV-包被的微量滴定板温育1小时。1小时后，通过Quidel ELISA洗涤溶液再洗涤该板五次，然后与ABTS(ImmunochemCorp.)温育20分钟。OD405nm越高， DENV不相关的免疫复合物(PAP-IC)与DENV2(16681)病毒体的结合越高。结果在表4中显示。
表4
因此，DENV2(16681)病毒体贪婪地结合非-DENV-相关的免疫复合物，使得在DENV 流行地区的非DENV，IC+个体中的DENVADE成为可能。
实施例4-DENV-IgG-IC与FcγIIa包被的培养板的结合的抑制
高度纯化的重组人FcγIIa(R&DSystems)在4℃使用ELISA包被缓冲液(Alpha DiagnosticInternational(国际阿尔法诊断))免疫吸附到塑料微孔板(Costar微量滴定 板(CostarMicrotiterplates))上24小时。24小时后，通过ELISA洗涤溶液(Quidel Corp.)洗涤该板五次，通过高度纯化的BSA封闭1小时，并洗涤五次。人抗-DENV2IC如下形 成：使失活的DENV-2病毒体(病毒株16681，MicrobixCorp.)与来自于DENV恢复期个体的中 和多克隆、混合的(pooled)、亲和纯化的IgG(Calbiotech登革热IgGELISA； Cat.No.DE050G4)结合。测试DENV-IgG-IC的1∶250和1∶500系列稀释液(ADE在1∶250至1∶500 的血清稀释液中最明显)的结果，该测试是对于DENV-IgG-IC与huFcγRIIa包被的微量滴定 孔结合的抑制。使用huFcγRIIa包被的孔与1∶250稀释的DENV-IgG-IC且不含抑制剂，1∶250 稀释的DENV-IgG-IC且含SEQIDNO：20，1∶500稀释的DENV-IgG-IC且不含抑制剂，以及1∶ 500稀释的DENV-IgG-IC且含SEQIDNO：20的结果显示于表5。
表5
因此，SEQIDNO：20显示了显著的抑制IC(其包含失活的DENV2(病毒株16681)- 抗-DENV多克隆恢复期IgG-IC)结合FcγIIa包被的培养板的能力。DENV-抗-DENV(异源的) 多克隆恢复期IgG-IC与FcγIIa的结合被认为是导致登革热感染的ADE的主要免疫机制，并 且是导致更严重的、可能危及生命的DHF/DSS的主要原因，这使得SEQIDNO：20成为用于治 疗和/或预防DHF/DSS的候选治疗物。
实施例5-非-DENVIC(PAP-IC)与DENVNS1的结合的抑制
高度纯化的重组DENV(100μg登革热病毒重组NS1；ProspecTech)在4℃使用ELISA 包被缓冲液(AlphaDiagnosticInternational(国际阿尔法诊断)，SanAntonio，德克萨 斯)免疫吸附到塑料微孔板(Costar微量滴定板(CostarMicrotiterplates))上24小时。 24小时后，通过ELISA洗涤溶液(QuidelCorp)洗涤该板五次，通过高度纯化的BSA封闭1小 时，并再洗涤五次。PAPIC在不存在肽或与SEQIDNO：20一起温育一小时。一小时后，该板 通过QuidelELISA洗涤溶液洗涤五次，然后与ABTS(ImmunochemCorp.)温育20分钟。OD405nm越高，DENV不相关的免疫复合物(PAP-IC)与DENVNS1蛋白的结合越高。结果在表6中显示。
表6
因此，SEQIDNO：20显示了显著的抑制包含IC的PAP-IC与重组DENVNS1包被的板 结合的能力。
实施例6-通过SEOIDNO：20抑制PAP-IC结合TNFα包被的板
高度纯化的重组TNF-α(Sigma-Aldrich)在4℃使用ELISA包被缓冲液(Alpha DiagnosticInternational(国际阿尔法诊断))免疫吸附到塑料微孔板(Costar微量滴定 板(CostarMicrotiterplates))上24小时。24小时后，通过ELISA洗涤溶液(QuidelCorp) 洗涤该板五次，通过高度纯化的BSA封闭1小时，并洗涤五次。PAPIC在不存在肽条件下或与 肽SEQIDNO：20一起温育一小时。一小时后，该板通过QuidelELISA洗涤溶液洗涤五次，然 后与ABTS(Immunochem，Corp.)温育20分钟。OD405nm越高，观察到越高的TNF-α不相关的免疫 复合物(PAP-IC)与TNF-α的结合。结果在表7中显示。
表7
因此，SEQIDNO：20显示了显著的抑制包含IC的PAP-IC与重组TNFα包被的板结合 的能力。
实施例7-在DENV(2)感染的体内小鼠模型中证明ADE
上文描述的RAG2-/-γc-/-(RAG-hu)登革热病毒小鼠模型提供了独特的研究工 具，用于解决许多关于登革热病毒感染和免疫性的重要和适时问题(Kuruvilla等.(2007) Virology(病毒学)369：143-152。RAG-hu小鼠通过异源DENVIgG(即DENV1的中和IgG；该血 清可来自于任何DENV异源中和DENV感染，诸如DENV1IgG和DENV2传染性病毒体或DENV2IgG 和DENV1传染性病毒体)被动免疫。例如，小鼠通过抗-DENV1IgG被动免疫，然后接种致死剂 量的(例如)DENV2病毒。具有序列APPDCAWHLGELVWCT(SEQIDNO：20)或XPPDCAWHLGELVWCT (SEQIDNO：19)的肽从DENV感染时起，以(例如)每日剂量1mg/kg，10mg/kg，100mg/kg和1, 000mg/kg腹膜内(i.p.)施用。总体临床体征、温度等每日监测。每日进行对于DENVNS1或 DENV复制和DENVNS1IC和DENV-IC存在的血清ELISA或RT-PCR。每日处死一个小组的DENV 感染的垂死(morbund)小鼠，除了上述的DENV复制的测量之外，检查血小板计数、HCT/PCV、 AST/ALT值。为对比的目的，处死等量的DENV感染的、APPDCAWHLGELVWCT(SEQIDNO：20)处 理的小鼠并如上所述进行检查。研究结束时，进行所有的免疫学谱(immunological profiles)和尸体剖检，包括多种DENV易感组织的活组织检查。ADEDENV感染的小鼠的最终 分析与ADEDENV感染的、SEQIDNO：20处理的小鼠进行对比。
其它实施方案
应该理解尽管已经结合其详细描述对本发明进行了描述，前述描述意欲举例说明 而非限制本发明的范围，其由附加的权利要求的范围定义。其它方面、优点和修改在下述权 利要求的范围内。