技术领域
本申请涉及药物制剂领域，更具体地，涉及一种纳豆激酶口服乳剂及其制备方法和灌装有所述乳剂的胶囊。
背景技术
1、纳豆激酶简介
纳豆(natto)源自古代中国，是一种大豆经纳豆菌发酵而成的食品。唐朝时，纳豆由鉴真大师传入日本，其首先在寺庙得到发展，并逐渐风靡日本民间，在日本人的餐桌上占有重要的位置。20世纪80年代，在美国从事血栓研究的Hiroyuki Sumi(须见洋行)用人工血栓板对各种天然产物进行大量筛选，以寻找新的抗血栓物质。一次偶然的尝试，他发现纳豆具有极强的溶解人工血栓的能力，在进行深入研究后，终于从纳豆的粘性物质中分离出一种能够溶解血栓的丝氨酸蛋白酶，并命名为纳豆激酶(Nattokinase，NK)(参见文献：Sumi,H.,et al.,A novel fibrinolytic enzyme (nattokinase)in the vegetable cheese Natto；a typical and popular soybean food in the Japanese diet.Cellular and Molecular Life Sciences,1987.43(10):p.1110-1111.)。
NK是由纳豆芽孢杆菌分泌的、由275个氨基酸残基组成的不含二硫键的单链多肽酶。其分子量为27700Da，具有8个赖氨酸残基，且不含有半胱氨酸残基，等电点为8.66±0.3(参见文献：凌均建，罗立新，杨汝德,纳豆激酶的分子生物学研究进展.广东药学院学报1999.15(004):第300-303页)。NK的溶栓机理主要包括(1)直接溶解血栓块中的交联纤维蛋白(参见文献：王萍，陈钧,纳豆激酶纤溶活性研究.江西农业大学学报,2004.26(3):第431-434页；Mahajan,P.M.,S.V.Gokhale,and S.S.Lele, Production of nattokinase using Bacillus natto NRRL3666:Media optimization,scale up,and kinetic modeling.Food Science and Biotechnology,2010.19(6):p.1593-1603；段智变，江汉湖，张书霞，江晓，董名盛，赵晓燕,纳豆激酶粗制液对家兔溶血栓作用及其机制研究.营养学报,2003.25(001):第46-51页；饶颖竹等，纳豆激酶粗提液的体外溶栓抑菌实验.蛇志,2004.16(001):第7-1页；Omura,K.,et al.,A newly derived protein from Bacillus subtilis natto with both antithrombotic and fibrinolytic effects.Journal of pharmacological sciences,2005.99(3):p.247-251.)；(2)激活血管内的尿激酶原和内皮细胞，从而产生内源性尿激酶和组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)，进而促使体内的纤溶酶原转化为纤溶酶而溶栓(参见文献：Kumada,K.,T.Onga,and H.Hoshino,The effect of natto possessing a high fibrinolytic activity in human plasma.Igaku to Seibutsugaku,1994.128(3):p.117-119.)；(3)降解纤溶酶原激活剂的抑制剂PAI-1，从而减少t-PA的水解，使纤溶酶生成量增加而加速溶栓(参见文献：毛娜娜等,纳豆激酶溶栓作用研究进展.中国血液流变学杂志,2008(2))。
2、纳豆激酶溶栓效果
已有大量研究证明NK在体内具有较强的溶栓效果。Fujita等研究了NK对大鼠颈动脉血管内皮细胞损伤引起的血栓的溶解作用，发现静脉注射NK的动物其动脉血流恢复率高达62.0％，注射纤溶酶的动物其恢复率只有15.8％，而注射弹性蛋白酶的没有得到任何恢复，表明NK在体内的溶栓活性远高于纤溶酶和弹性蛋白酶(参见文献：Fujita,M.,et al.,Thrombolytic effect of nattokinase on a chemically induced thrombosis model in rat.Biological&pharmaceutical bulletin,1995.18(10):p.1387.)。此外，Fujita等还发现通过向十二指肠内注射给药后，NK也可以有效地被吸收，并增强大鼠体内的纤溶活性(参见文献：FuJITA,M.,et al.,Transport of nattokinase across the rat intestinal tract.Biological&pharmaceutical bulletin,1995.18(9):p.1194-1196.)。段智变等建立家兔颈动脉血栓模型，之后通过十二指肠内注射分别给予高(4500IU·kg-1)、低剂量(2500IU·kg-1)的NK和生理盐水(参见文献：(段智变，江汉湖，张书霞，江晓，董名盛， 赵晓燕,纳豆激酶粗制液对家兔溶血栓作用及其机制研究.营养学报,2003.25(001):第46-51页.))。给药后1-1.5h内，相比于生理盐水组，NK高剂量组的凝血时间、凝血酶原时间、凝血酶时间和活化的部分凝血活酶时间均显著延长，而低剂量组只有凝血酶时间显著延长。给药后2h，相比于生理盐水组，NK高剂量组的优球蛋白溶解时间和纤维蛋白原含量显著降低，纤维蛋白降解产物含量明显增高，血浆D-二聚体呈阳性。NK低剂量组的优球蛋白溶解时间明显缩短，纤维蛋白降解产物含量、凝血酶时间值显著增加，血浆D-二聚体呈阳性，纤维蛋白原含量无明显变化。Kumada等给健康人口服NK后，发现血中优球蛋白溶解时间大大降低；优球蛋白的纤溶活性提高，在第4天达到最高值，并维持到第8天；纤维蛋白降解产物在第l天即迅速达到最高值(参见文献：Kumada,K.,T.Onga,and H.Hoshino,The effect of natto possessing a high fibrinolytic activity in human plasma.Igaku ta Seibutsugaku,1994.128(3):p.117-119.)。
3、纳豆激酶的其他药理作用
Kim等给予20-80岁的高血压患者口服NK胶囊(2000FU/天)，于8周后检测受试者血压，结果显示与对照组(服用安慰剂)相比，服用NK的患者的舒张压和收缩压均明显降低，证明NK具有治疗高血压的功效，其降压作用的确切机制尚不明确(参见文献：Kim,J.Y.,et al.,Effects of nattokinase on blood pressure:a randomized,controlled trial.Hypertension research,2008.31(8):p.1583-1588.)。
4、纳豆激酶安全性
纳豆是一种具有长期服用历史(不晚于公元7世纪)的食品，人类即使每日空腹口服200g也未见有相关不良反应发生(参见文献：Sumi,H.,et al.,Enhancement of the fibrinolytic activity in plasma by oral administration of nattokinase.Acta Haematol,1990.84(3):p.139-143.)。韩国维寿酶公司(Vasozyme company)生产的维寿酶肠溶胶囊(其中NK为单纯的物理混合，没有形成乳剂)，每日推荐服用量为8000IU；而中国台湾的台盐实业公司生产的纳豆大师(纳豆红曲素食胶囊)，其每日推荐服用量高达12800IU。上述两种产品长期服用时未见不良反应报道。黄晓曼等研究了NIH小鼠口 服NK的急性毒性，按小鼠的吞食极限单次灌服NK浓溶液(剂量为400kIU·kg-1)，发现该剂量不会导致实验小鼠产生死亡及异常(观察2周)，2周后处死动物，内脏无病理学变化(参见文献：黄晓曼，杨鹊，邱志健，曾琳玲，彭中健，夏枫耿,纳豆激酶的安全性试验中国食品添加剂,2008(002):第109-112页.)。此外，黄晓曼等亦证实，以尾静脉注射的方式对NIH小鼠给予NK，100k IU·kg-1的剂量不会导致小鼠死亡，并在一系列剂量梯度的实验中得到半数致死量为172.6k IU·kg-1，存活动物在2周后解剖，各器官均未发现病理学改变。
5、纳豆激酶的现有制剂
由于NK在溶解血栓和/或预防血栓性疾病发生等方面的突出疗效，近年来将其作为功能性食品和添加剂的产品不断面世。日本大和制药有限公司以须见洋行博士的技术为支持开发纳豆产品，其名称为NKCP(Nattoesse compound)，剂型有硬胶囊、软胶囊(非肠溶胶囊，其中NK为单纯的物理混合，混悬制剂)和片剂。该公司在生产制剂的同时也供应原料。韩国维寿酶公司生产的“维寿酶”则是NK干粉肠溶胶囊。除此之外，朝鲜的纳豆产品“血宫不老精”(Royal Blood Fresh)也已面市，该药由金日成综合大学生命科学部微生物酵素研究室研究师们于1995年研究开发，其主要成分是青曲酱中的细菌分离精制的酵素剂(其中含有NK)(National institute of Drug controlling of DPR.Korea.From Analysis of Royal Blood-Fresh NO:PG90-4c-0486)，剂型为胶囊(非肠溶胶囊，其中NK为单纯的物理混合，混悬制剂)，生产商为朝鲜富强会社。国内则主要有北京燕京中发的燕京牌纳豆(纳豆提取物肠溶胶囊)，天津百德公司的纳豆口嚼片，草仙药业的净血酶纳豆胶囊，湖南贵生坊的纳豆素胶囊，天津宝恒生物的蛋白硒纳豆胶囊等。从以上资料可知，目前的NK产品在形式上都为普通胶囊(非肠溶胶囊，其中NK为单纯的物理混合，混悬制剂)或片剂。
NK是从纳豆发酵液中精制而来，纳豆发酵液自身即是一种具有确切疗效的液体口服剂。但液体酶的缺点是稳定性差，容易失活。因此目前的产品或文献多采用冻干的方式获得NK冻干粉而增加其稳定性。此外，NK 在pH低于5的环境下很快失活(如胃液中)，在高于60℃的情况下也迅速变性(参见文献：付利，杨志兴,纳豆激酶的研究与应用.生物工程进展,1995.15(5):第46-49页.)。而且对于NK这样的蛋白多肽类药物而言，口服给药时会面临肠道的三大障碍，即酶的降解、黏液层的扩散屏蔽以及粘膜的吸收屏蔽(参见文献：程刚,生物药剂学2010:中国医药科技出版社)。
因此在NK相关产品的剂型设计和工艺确定中都必须同时考虑如何最大限度的维持NK的活性，促进NK吸收，以及工艺的经济性。
遗憾的是，目前上市产品和文献报道中能对这些因素进行全面考虑的甚少。以片剂为例，压片过程中物料内部会产生高温，后期的包衣工艺可能引入的高温及有机溶剂，这些都可能影响NK的活性。NK冻干粉直接灌装肠溶胶囊虽然减弱了温度的影响，但NK作为分子量28kDa的多肽，其在肠道中的吸收受到一定的限制(参见文献：张霞，尹宗宁，王怡鑫,纳豆激酶脂质体的制备及其体外释放.中国药学杂志,2007.42(4):第279-282页)。
张云峰等使用超声工艺制备了NK环糊精包合物，以期提高NK的稳定性和跨膜能力，但超声工艺(常温下0.5h)不仅可能带来NK活性的降低，而且在产业化上也不经济(参见：张云峰，纳豆激酶羟丙基-β-环糊精包合物的制备和鉴定.广东化工,2011.38(001):第10-10页；张云峰、李军、陈晓炜、曹晓琴,专利CN201010287914.2)。
高大海等分别选取了两种肠溶体系(海藻酸钙胶囊和以CAP为包衣的肠溶微丸体系)来制备纳豆激酶肠溶制剂(参见：高大海,纳豆激酶的分离纯化和酶学性质的研究,2005,浙江大学)，并考察了两种体系对NK包埋率的影响以及两种体系在体外模拟的人工肠液和人工胃液中的释放情况。结果表明以CAP制备得到的肠溶微丸较为理想，其在模拟胃液中120min内总释放度小于10％，在模拟肠液中60min内完全释放。
也有研究者使用微丸制剂工艺包裹NK并灌装胶囊，工艺流程为将NK与药用辅料混合，制软材，制丸芯，喷入包衣液包衣，装胶囊(参见：肖洁瑾,徐.顾.邹.,专利CN1766096A，标题为“一种纳豆激酶组合物及其制备方法”)。但这种方法也存在一些缺点：(1)由于包衣温度较低(30℃)， 容易造成微丸的粘连，影响微丸制剂的成型；(2)包衣后微丸还需要一个低温(30℃)烘箱内的膜愈合过程，由于温度较低，所以膜愈合时间长达8h，这也给生产带来不便。Law和Zhang等以高纯度NK冻干粉末作为原料，制备肠溶缓释片(参见：Law,D.and Z.Zhang,Stabilization and target delivery of Nattokinase using compression coating.Drug development and industrial pharmacy,2007.33(5):p.495-503.)。
用辅料L100-55和HPC的混合物对药物进行直接压缩包衣，可实现制剂的肠道控制释放。
陈景鑫等以环糊精包合法制备NK微胶囊并对制剂的耐酸、耐热、储存稳定性等进行了考察(参见：陈景鑫,纳豆激酶微胶囊的制备及其稳定性研究,2010,黑龙江八一农垦大学)，结果表明该方法能明显改善制剂的储存稳定性，但此法制备工艺较复杂。
综上可知，制剂工作者在NK口服制剂的开发方面做了大量工作，给出了众多方案，但至今还没有找到一个能同时兼顾NK口服吸收好、活性保持强、工艺简单和制备成本低的方案。
发明内容
本申请的目的是提供一种纳豆激酶口服乳剂。
本申请的另一目的是提供一种制备上述纳豆激酶口服乳剂的方法。
本申请的又一目的是提供一种灌装有上述纳豆激酶口服乳剂的胶囊。
具体地，在一方面，本申请提供一种纳豆激酶口服乳剂，所述乳剂包括油相和水相，所述水相是浓度为100-10000IU/mL的纳豆激酶水溶液，所述油相含有如下基于所述油相的总重量计算的重量百分数的各组分：磷脂8-12％，蜂蜡4-6％，去氧胆酸0.4-1％，辅助乳化剂1.25-5％，余量为油。
本申请所述的纳豆激酶水溶液是纳豆激酶冻干粉溶于水中所制得的溶液。本申请所用的纳豆激酶冻干粉可以购买自汕头双骏生物科技有限公司、日本生物科技等。
本领域的技术人员将理解的是，在本申请中所用的油可以为用于制备乳剂的各种常用的油。
在一些实施方式中，所述油相各组分的重量百分数为：磷脂10％，蜂蜡5％，去氧胆酸0.5％，辅助乳化剂2.5％，余量为油。
在一些实施方式中，所述油相的以克计的重量与所述水相的以毫升计的体积之间的比值可以为2.5:1～20:1。优选地，所述油相的以克计的重量与所述水相的以毫升计的体积之间的比值可以为5:1。
在一些实施方式中，所述磷脂可以选自大豆卵磷脂或蛋黄卵磷脂中的一种或两种。
在一些实施方式中，所述辅助乳化剂可以选自聚氧乙烯氢化蓖麻油、辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯、聚乙二醇月桂酸甘油酯、聚乙二醇硬脂酸甘油酯中的一种或多种。
在一些实施方式中，所述油可以选自中链甘油三酯或长链甘油三酯中的一种或两种。优选地，所述油可以为中链甘油三酯。
本领域的技术人员将理解的是，在本申请中所用的蜂蜡、去氧胆酸、大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、聚氧乙烯氢化蓖麻油、辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯、聚乙二醇月桂酸甘油酯、聚乙二醇硬脂酸甘油酯、中链甘油三酯和长链甘油三酯均为市售产品。
在一些实施方式中，所述乳剂包括油相和水相，所述水相是浓度为100-10000IU/mL的纳豆激酶水溶液，所述油相含有如下基于所述油相的总重量计算的重量百分数的各组分：大豆卵磷脂8-12％，蜂蜡4-6％，去氧胆酸0.4-1％，聚氧乙烯氢化蓖麻油1.25-5％，余量为中链甘油三酯；所述油相的以克计的重量与所述水相的以毫升计的体积之间的比值为2.5:1～20:1，优选地为5:1。
在一些实施方式中，所述乳剂包括油相和水相，所述水相是浓度为100-10000IU/mL的纳豆激酶水溶液，所述油相含有如下基于所述油相的总重量计算的重量百分数的各组分：大豆卵磷脂10％，蜂蜡5％，去氧胆酸0.5％，聚氧乙烯氢化蓖麻油2.5％，余量为中链甘油三酯；所述油相的 以克计的重量与所述水相的以毫升计的体积之间的比值为5:1。
在另外的方面，本申请提供一种制备上述纳豆激酶口服乳剂的方法，所述方法可以包括如下步骤：
配制配方量的纳豆激酶水溶液，即得到水相，待用；
混合配方量的油相各组分，得到油相各组分的混合物；
在55-70℃的温度下，搅拌油相各组分的混合物至分散均匀，得到油相，冷却至室温，待用；
将油相的温度控制在35-45℃下，在搅拌状态下将水相加入到油相中，并在此温度下持续搅拌1-10分钟，即得纳豆激酶口服乳剂。
本领域的技术人员将理解的是，本申请所述的室温可以为20～30℃之间的温度。
在一些实施方式中，可以在60-65℃下，搅拌混合物至分散均匀。
在一些实施方式中，可以将油相的温度控制在36-38℃下，在搅拌状态下将水相加入到油相中，并在此温度下持续搅拌1-10分钟，优选地搅拌1-5分钟。
在又一方面，本申请提供一种灌装有上述纳豆激酶口服乳剂的胶囊。
与现有技术相比，本申请所提供的纳豆激酶口服乳剂为W/O(油包水)乳剂，实验证明，本申请的纳豆激酶口服乳剂能够明显改善纳豆激酶的热稳定性和放置稳定性，同时提高了纳豆激酶的口服药效。同时，本申请所提供的制备上述纳豆激酶口服乳剂的方法操作简单，生产成本低，易于大规模化生产。
具体实施方式
下面通过实施例来描述本申请的实施方式，本领域的技术人员应当认识到，这些具体的实施例仅表明为了达到本申请的目的而选择的实施技术方案，并不是对技术方案的限制。根据本申请的教导，结合现有技术对本申请技术方案的改进是显然的，均属于本申请保护的范围。
在本申请中，所有的设备或原料等均可从市场获得或是本行业常用的。在以下实施例中，所用各成分的相关信息如下：
大豆卵磷脂(SPC)，购自：Lipoid，批号为20110113；
蛋黄卵磷脂(EPC)，购自：Lipoid，批号为201003011；
聚氧乙烯氢化蓖麻油(RH40)，购自：巴斯夫，批号为20110516；
去氧胆酸(DCA)，购自：百灵威，批号为20120325；
中链脂肪酸甘油三酯(MCT)，购自：Lipoid，批号为20100219；
长链脂肪酸甘油三酯(LCT)，购自：Lipoid，批号为20101101；
蜂蜡，购自：禹王公司，批号为20091026；
辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯，购自：嘉法狮(上海)贸易有限公司，批号为20091103；
聚乙二醇月桂酸甘油酯，购自：嘉法狮(上海)贸易有限公司，批号为20090513；
聚乙二醇硬脂酸甘油酯，购自：嘉法狮(上海)贸易有限公司，批号为20100319；
纳豆激酶(NK)冻干粉购买自汕头双骏生物科技有限公司，生产批号为Y2013021301。
在本申请中，所述NK溶液均是将NK冻干粉溶解于水中获得的，实验发现，当浓度在100-10000IU/mL时，均能制备得到稳定的纳豆激酶口服乳剂。
实施例1
一种纳豆激酶口服乳剂，所述乳剂包括油相和水相，所述水相是浓度为10000IU/mL的纳豆激酶水溶液，所述油相含有如下基于所述油相的总重量计算的重量百分数的各组分：SPC10％(w/w)，蜂蜡5％(w/w)，RH402.5％(w/w)，DCA0.5％(w/w)，余量为MCT。同时，所述油相的以克计的重量与所述水相的以毫升计的体积之间的比值为5:1。
制备方法：
称取配方量的纳豆激酶冻干粉溶解于水中，得到水相；
称取配方量的SPC、蜂蜡、RH40、DCA和MCT，总共10g置于25mL烧杯中，于65℃水浴下恒温搅拌混合至分散均匀，得到油相，室温下冷却待用；
将油相的温度控制在37℃下，凝固的油相在此温度下融化，并在搅拌状态下移取2mL NK溶液缓缓注入油相中，同时在此温度下持续搅拌1min，即得纳豆激酶口服乳剂。
所述纳豆激酶口服乳剂为半固态、乳膏状，无絮凝状沉淀量，放置7天后不分层。
实施例2
一种纳豆激酶口服乳剂，所述乳剂包括油相和水相，所述水相是浓度为100IU/mL的纳豆激酶水溶液，所述油相含有如下基于所述油相的总重量计算的重量百分数的各组分：SPC10％(w/w)，EPC1.6％(w/w)，蜂蜡5％(w/w)，RH402.5％(w/w)、DCA0.5％(w/w)，余量为MCT80.4％。同时，所述油相的以克计的重量与所述水相的以毫升计的体积之间的比值为5:1。
制备方法：
称取配方量的纳豆激酶冻干粉溶解于水中，得到水相；
称取配方量的SPC、EPC、蜂蜡、RH40、DCA和MCT，总共10g置于25mL烧杯中，于65℃水浴下恒温搅拌混合至分散均匀，得到油相，室温下冷却待用；
将油相的温度控制在37℃下，凝固的油相在此温度下融化，并在搅拌状态下移取2mL NK溶液缓缓注入油相中，同时在此温度下持续搅拌1min，即得纳豆激酶口服乳剂。
所述纳豆激酶口服乳剂的性状与实施例1的纳豆激酶口服乳剂的性状相同。
实施例3
一种纳豆激酶口服乳剂，所述乳剂包括油相和水相，所述水相是浓度为1000IU/mL的纳豆激酶水溶液，所述油相含有如下基于所述油相的总重量计算的重量百分数的各组分：EPC11.6％(w/w)，蜂蜡5％(w/w)，RH402.5％(w/w)DCA0.5％(w/w)，余量为MCT。同时，所述油相的以克计的重量与所述水相的以毫升计的体积之间的比值为5:1。
制备方法：
称取配方量的纳豆激酶冻干粉溶解于水中，得到水相；
称取配方量的EPC、蜂蜡、RH40、DCA和MCT，总共10g置于25mL烧杯中，于65℃水浴下恒温搅拌混合至分散均匀，得到油相，室温下冷却待用；
将油相的温度控制在36℃下，凝固的油相在此温度下融化，并在搅拌状态下移取2mL NK溶液缓缓注入油相中，同时在此温度下持续搅拌1min，即得纳豆激酶口服乳剂。
所述纳豆激酶口服乳剂的性状与实施例1的纳豆激酶口服乳剂的性状相同。
实施例4
一种具有如实施例1所述的配方量的纳豆激酶口服乳剂，其制备方法包括如下步骤：
称取配方量的纳豆激酶冻干粉溶解于水中，得到水相；
称取配方量的SPC、蜂蜡、RH40、DCA和MCT，总共10g置于25mL烧杯中，于55℃水浴下恒温搅拌混合至分散均匀，得到油相，室温下冷却待用；
将油相的温度控制在35℃下，凝固的油相在此温度下融化，并在搅拌状态下移取2mL NK溶液缓缓注入油相中，同时在此温度下持续搅拌5min，即得纳豆激酶口服乳剂。
所述纳豆激酶口服乳剂的性状与实施例1的纳豆激酶口服乳剂的性状 相同。
实施例5
一种具有如实施例1所述的配方量的纳豆激酶口服乳剂，其制备方法包括如下步骤：
称取配方量的纳豆激酶冻干粉溶解于水中，得到水相；
称取配方量的SPC、蜂蜡、RH40、DCA和MCT，总共10g置于25mL烧杯中，于60℃水浴下恒温搅拌混合至分散均匀，得到油相，室温下冷却待用；
将油相的温度控制在45℃下，凝固的油相在此温度下融化，并在搅拌状态下移取2mL NK溶液缓缓注入油相中，同时在此温度下持续搅拌10min，即得纳豆激酶口服乳剂。
所述纳豆激酶口服乳剂的性状与实施例1的纳豆激酶口服乳剂的性状相同。
实施例6
一种具有如实施例1所述的配方量的纳豆激酶口服乳剂，其制备方法包括如下步骤：
称取配方量的纳豆激酶冻干粉溶解于水中，得到水相；
称取配方量的SPC、蜂蜡、RH40、DCA和MCT，总共10g置于25mL烧杯中，于70℃水浴下恒温搅拌混合至分散均匀，得到油相，室温下冷却待用；
将油相的温度控制在38℃下，凝固的油相在此温度下融化，并在搅拌状态下移取2mL NK溶液缓缓注入油相中，同时在此温度下持续搅拌8min，即得纳豆激酶口服乳剂。
所述纳豆激酶口服乳剂的性状与实施例1的纳豆激酶口服乳剂的性状相同。
实施例7
油相的以克计的重量与水相的以毫升计的体积之间的比值对乳剂的 影响
纳豆激酶口服乳剂，所述乳剂包括油相和水相，所述水相是浓度为10000IU/mL的纳豆激酶水溶液，所述油相含有如下基于所述油相的总重量计算的重量百分数的各组分：SPC10％(w/w)，蜂蜡5％(w/w)，RH402.5％(w/w)，DCA0.5％(w/w)，余量为MCT。同时，所述油相的以克计的重量与所述水相的以毫升计的体积之间的比值如表1所示。
按照实施例1所述的制备方法来制备纳豆激酶口服乳剂，产品的外观、絮凝状沉淀及室温放置7天后的稳定性如表1所示。
表1.不同的油相与水相的比值(g/ml)对所制备的乳剂的性状的影响
由表1可知，当油相：水相＜2.5：1(比如1.25：1)(g/mL)时，乳剂的稳定性较差，放置后很快分层。当油相：水相＞20：1(比如25:1)(g/mL)时，虽然也能够制备出稳定的制剂，但实验发现，其载药量较小。因此，油相以克计的重量与水相以毫升计的体积之间的比值优选地为2.5:1～20:1。
实施例8
磷脂的选择对乳剂的影响
纳豆激酶口服乳剂，所述乳剂包括油相和水相，所述水相是浓度为10000IU/mL的纳豆激酶水溶液，所述油相含有如下基于所述油相的总重量计算的重量百分数的各组分：磷脂10％(w/w)，蜂蜡5％(w/w)，RH402.5％(w/w)，DCA0.5％(w/w)，余量为MCT。并且，油相的以克计的重量与水相的以毫升计的体积之间的比值为5:1(g/mL)。
其中，磷脂分别为SPC、EPC和以重量比为1:1的SPC和EPC混合 物。
按照实施例1所述的制备方法来制备纳豆激酶口服乳剂，产品的外观、絮凝状沉淀及室温放置7天后的稳定性如表2所示。
表2.不同磷脂制备的NK乳剂
由表2可知，当磷脂选用SPC、EPC或两者的混合物时，均能制备出稳定性良好的乳剂。
实施例9
辅助乳化剂的选择对乳剂的影响
纳豆激酶口服乳剂，所述乳剂包括油相和水相，所述水相是浓度为10000IU/mL的纳豆激酶水溶液，所述油相含有如下基于所述油相的总重量计算的重量百分数的各组分：SPC10％(w/w)，蜂蜡5％(w/w)，辅助乳化剂2.5％(w/w)，DCA0.5％(w/w)，余量为MCT。并且油相的以克计的重量与水相的以毫升计的体积之间的比值为5:1(g/mL)。其中，所用的辅助乳化剂如表3所示。
按照实施例1所述的制备方法来制备纳豆激酶口服乳剂，产品室温放置后的状态和絮凝后震荡均匀度如表3所示。
表3.辅助乳化剂的种类对制剂成乳的影响
在表3中，*的数量代表各项所达到的程度，*数量越多，表示此项指标程度越深
由表3可知，当使用RH40、辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯、聚乙二醇月桂酸甘油酯、聚乙二醇硬脂酸甘油酯作为辅助乳化剂时，产品的稳定性较好且絮凝后震荡均匀度好。
实施例10
油的选择对乳剂的影响
纳豆激酶口服乳剂，所述乳剂包括油相和水相，所述水相是浓度为10000IU/mL的纳豆激酶水溶液，所述油相含有如下基于所述油相的总重量计算的重量百分数的各组分：SPC10％(w/w)，蜂蜡5％(w/w)，RH402.5％(w/w)，DCA0.5％(w/w)，余量为油。并且油相的以克计的重量与水相的以毫升计的体积之间的比值为5:1(g/mL)。
其中，所述油分别为MCT、LCT及重量比为1:1的MCT和LCT混合物。
根据实施例1所述的制备方法来制备上述纳豆激酶口服乳剂。实验证明，以MCT和/或LCT为油均能制备出稳定的乳剂，即室温放置7天后不分层。
实施例11
磷脂含量对乳剂的影响
纳豆激酶口服乳剂，所述乳剂包括油相和水相，所述水相是浓度为10000IU/mL的纳豆激酶水溶液，所述油相含有如下基于所述油相的总重量计算的重量百分数的各组分：磷脂，蜂蜡5％(w/w)，RH402.5％(w/w)，DCA0.5％(w/w)，余量为MCT。并且油相的以克计的重量与水相的以毫升计的体积之间的比值为5:1(g/mL)。
其中，磷脂为SPC且SPC的重量百分数如表4所示。
按照实施例1所述的制备方法来制备纳豆激酶口服乳剂，产品的外观 状态、絮凝状沉淀量及室温放置7天后的稳定性如表4所示。
表4.不同重量百分数的SPC对产品的影响
由表4可知，产品放置7天后的分层程度随SPC重量百分数的增加而减弱，8％及以上的SPC均带来较好的稳定性，在综合其它方面的考虑因素后，比如15％SPC磷脂用量过多，导致制剂体积过大，服用不方便/或者增加服用难度，因此将磷脂的重量百分数优选地选择为8-12％。
实施例12
蜂蜡含量对乳剂的影响
纳豆激酶口服乳剂，所述乳剂包括油相和水相，所述水相是浓度为10000IU/mL的纳豆激酶水溶液，所述油相含有如下基于所述油相的总重量计算的重量百分数的各组分：SPC10％(w/w)，蜂蜡，RH402.5％(w/w)，DCA0.5％(w/w)，余量为MCT。并且油相的以克计的重量与水相的以毫升计的体积之间的比值为5:1(g/mL)。
其中蜂蜡的重量百分数如表5所示。
按照实施例1所述的制备方法来制备纳豆激酶口服乳剂，产品的外观状态、流动性(室温、37℃)及室温放置7天后的稳定性如表5所示。
表5.不同重量百分数的蜂蜡对产品的影响
由表5可知，当蜂蜡的重量百分数为4-6％时，所制得的乳剂在室温(在这个实施例中，所述室温特指20℃)下呈凝固状态，而在37℃时具有良好的流动性，且放置7天后乳剂无分层现象。而当蜂蜡含量大于6％(w/w)时，乳剂在37℃下流动性较差，不利于口服后在体内的吸收。因此，将蜂蜡的重量百分数优选地选择为4-6％。
实施例13
DCA含量对乳剂的影响
纳豆激酶口服乳剂，所述乳剂包括油相和水相，所述水相是浓度为10000IU/mL的纳豆激酶水溶液，所述油相含有如下基于所述油相的总重量计算的重量百分数的各组分：SPC10％(w/w)，蜂蜡5％，RH402.5％(w/w)，DCA，余量为MCT。并且油相的以克计的重量与水相的以毫升计的体积之间的比值为5:1(g/mL)。
其中，DCA的重量百分数如表6所示。
按照实施例1所述的制备方法来制备纳豆激酶口服乳剂。
由于纳豆激酶口服乳剂为W/O乳剂，因此以W/O乳剂在水中的自乳化效果作为评价指标，方法如下：在37℃的保温条件下，用滴管向7mL西林瓶中滴加一滴如上制备的乳剂，然后加入2mL蒸馏水，于37℃水浴中轻轻振摇，观察不同DCA重量百分数所制备的乳剂的乳化效果，结果如表6所示。
表6.不同重量百分数的DCA对乳剂的自乳化效果的影响
由表6可知，当DCA的重量百分数从0％提高到0.4％时，乳剂的自乳化能力随之增强；但随着油相中的DCA的重量百分数的进一步提高， 乳剂的自乳化效果不再继续改善，而过多的DCA会对胃肠粘膜带来损伤，因此在综合多方面的因素进行考虑后，将DCA的重量百分数优选地选择为0.4-1％。
实施例14
辅助乳化剂的含量对乳剂的影响
纳豆激酶口服乳剂，所述乳剂包括油相和水相，所述水相是浓度为10000IU/mL的纳豆激酶水溶液，所述油相含有如下基于所述油相的总重量计算的重量百分数的各组分：SPC10％(w/w)，蜂蜡5％(w/w)，辅助乳化剂，DCA0.5％(w/w)，余量为MCT。并且油相的以克计的重量与水相的以毫升计的体积之间的比值为5:1(g/mL)。
其中，辅助乳化剂为RH40，其重量百分数分别如表7所示的。
按照“实施例1”所述的制备方法来制备纳豆激酶口服乳剂。在室温下静置一天后，观察所制备的W/O乳剂的分层程度与絮凝状态，并再次振摇后观察。结果显示在表7。
表7.不同重量百分数的辅助乳化剂对制剂成乳的影响
以*数量代表各项所达到的程度，*数量越多，表示此项指标程度越深
由表7可知，当RH40的重量百分数在1.25-5％时，乳剂稳定性较好，故将RH40的重量百分数选择为1.25-5％，从而将辅助乳化剂的重量百分数优选地选择为1.25-5％。
实施例15
取实施例1所制备的NK乳剂，且按照实施例1所述的处方和制备方法制备含NK的空白乳剂(除了使用蒸馏水代替NK溶液以外，其它配方 或步骤与实施例1相同)，并将NK乳剂或空白乳剂灌入小鼠专用的肠溶小胶囊中，得到NK乳剂胶囊和空白乳剂胶囊。NK冻干粉用玉米淀粉按1:1(w/w)混合均匀后，灌入小鼠专用的肠溶小胶囊，得到NK粉末胶囊。
将35只wistar大鼠随机分成7组，每组5只，各组分别为：
1、NK乳剂胶囊高剂量组(NK-ECa-H)，给药剂量为14.4kIU·kg-1。
2、NK乳剂胶囊低剂量组(NK-ECa-L)，给药剂量为7.2kIU·kg-1。
3、NK粉末胶囊高剂量组(NK-PCa-H)，给药剂量为14.4kIU·kg-1。
4、NK粉末胶囊低剂量组(NK-PCa-L)，给药剂量为7.2kIU·kg-1。
5、NK乳剂灌胃组(NK-E)，给药剂量为14.4kIU·kg-1。
6、空白乳剂胶囊组(ECa)，给药剂量与乳剂高剂量组相同。
7、空白组(Control)，灌服与给药组数目相同的空胶囊。
每日给药1次，连续10日。给药后第11天，以3.5％水合氯醛对大鼠进行腹腔麻醉(1ml/100g)，手术分离双侧颈总动脉。在双侧颈总动脉下各垫一条1.2cm×3.0cm的塑料薄片，用浸渍有50μl FeC13溶液(10％，w/w)的滤纸条(1.0cm×1.5cm)覆盖双侧颈总动脉。20min后取下滤纸条，剪下变色区域并用生理盐水洗净，滤纸吸干水分后测量其长度，并用分析天平精密称重。
将单位长度血栓的重量记为相对栓重(mg/cm)，并根据下述公式计算抗栓率(％)。
抗栓率(％)＝(WN-WS)/WN×100％
其中，WN为对照组的平均相对栓重；WS为给药组的平均相对栓重。
按照上式计算抗栓率，并对结果进行统计学分析，结果如表8所示。
表8不同给药组的抗栓率及统计学分析(n＝5)
与空白组处理的大鼠相比的ap值。
与ECa处理的大鼠相比的bp值。
与NK-E处理的大鼠相比的cp值。
与NK-ECa-H处理的大鼠相比的dp值。
与NK-ECa-L处理的大鼠相比的ep值。
与NK-PCa-H处理的大鼠相比的fp值。
与NK-PCa-L处理的大鼠相比的gp值。
从表8可以看出，与空白组(Control)相比，各种NK制剂(NK-ECa、NK-PCa和NK-E)均有显著的抗栓效果(P<0.05)。NK-ECa和NK-PCa的抗栓效果均显著强于NK-E(P<0.05)。NK-ECa的抗栓效果显著强于NK-PCa(P<0.05)。对于剂量不同的给药组，NK-ECa-H的抗栓效果显著优于NK-ECa-L(P<0.05)；但NK-PCa-H的抗栓效果与NK-PCa-L没有显著性差异(P>0.05)。由此说明，本申请的纳豆激酶口服乳剂及含有其的胶囊可以提高纳豆激酶的口服药效。
实施例16
取实施例1的纳豆激酶口服乳剂(NK W/O乳剂)，并配制相同酶活度的NK溶液。将所述NK溶液与所述NK W/O乳剂分别于4℃和室温(20℃)下放置。30天后，运用纤维蛋白平板法测定酶的活性，评价将NK制备成乳剂后对其放置稳定性的影响。
纤维蛋白平板法测定NK酶活度的方法如下：
取48℃水浴孵育5min的纤维蛋白原溶液(1.5mg·mL-1)59mL置于烧杯中，边搅拌边快速加入降温至48℃的琼脂糖溶液(1.5％，w/w)59mL和浓度为10IU·mL-1凝血酶溶液4.5mL，立即混匀，快速倒入直径为150mm的玻璃平皿中，高度约为1cm。室温水平放置1h后，用直径为2mm的玻璃滴管(打孔器)在纤维蛋白平板上打孔。
精密量取不同浓度(1000、500、200、100、50和25IU·mL-1)的尿 激酶溶液各10μL，分别点于同一纤维蛋白平板上(n＝2)，加盖置于37℃恒温箱中孵育18h。取出后用游标卡尺于平皿背面测量溶圈垂直两直径(a、b)，将酶活度与对应的溶圈垂直两径乘积S(S＝a×b)的对数值作回归曲线，计算得到的线性方程为logS＝0.341×logC-0.4085，r＝0.9881。表明在25-1000IU·mL-1范围内，尿激酶活度与平板上的溶圈S值的对数呈良好的线性关系。
分别取10μL不同浓度尿激酶标准溶液和NK溶液点样于纤维蛋白平板上，加盖后置37℃恒温箱中培养18h。得不同的供试品溶圈S值。通过比较，选择溶圈S值在标准曲线浓度范围内的稀释点，将其面积的对数值代入标准曲线，换算所得的值再乘以NK溶液的稀释倍数，则为NK制剂的酶活度。
结果：NK溶液在室温下放置1个月后残余的酶活力为13.7％，在4℃放置1个月后残余的酶活力为60.0％；NK W/O乳剂在室温下放置1个月后残余的酶活力为61.0％，在4℃条件下放置1个月后残余的酶活力高达94.0％。由此说明将NK制备成乳剂能够显著提高NK的放置稳定性。
采用相同方法研究了NK制备成W/O乳剂后的热稳定性。取NK溶液和NK W/O乳剂于70℃下分别放置1h和3h。之后采用纤维蛋白平板法测定酶活度。发现NK溶液在70℃下放置1h后残余的酶活力为9.2％，放置3h后残余的酶活力为3.5％。而NK W/O乳剂在70℃下放置1h后残余的酶活力为50.6％，放置3h后残余的酶活力为31.5％。由此说明将NK制备成W/O乳剂能够显著提高其热稳定性。
综上所述，本申请的纳豆激酶口服乳剂不仅能够明显改善纳豆激酶的热稳定性和放置稳定性，而且能够提高纳豆激酶的口服药效。
以上所述仅为本申请的优选实施例，并非对本申请作出任何形式上和实质上的限制。本领域的技术人员，在不脱离本申请技术方案的范围内，当可利用以上所揭示的技术内容而作出的些许更改、修饰与演变的等同变化均为本申请的等效实施例；同时，凡依据本申请的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更改、修饰与演变等均在本申请的由权利要求界定的范围内。