技术领域
本发明属于中药提取物用途领域，具体涉及桃叶珊瑚苷的新用途。
背景技术
特发性肺纤维化(Idiopathic Pulmonary Fibrosis,IPF)是慢性纤维化性间质性肺炎一种特殊类型，发病原因尚不明确。目前公认的潜在的致病因素包括吸烟、环境职业因素暴露、微生物感染、胃食管反流及遗传因素等。特发性肺纤维化是一种慢性进行性发展、基本上不可逆的病理改变，病变局限于肺部，组织病理学和高分辨率CT显示为普通型间质性肺炎型特征。特发性肺纤维化常发生在老年人中，然而临床上各个年龄阶段均可见，且随着年龄的增长其发病率呈现增加的趋势。特发性肺纤维化的预后极差，确诊后中位生存期仅3-5年，5年生存率不到50％。目前针对特发性肺纤维化的临床试验药物包括糖皮质激素、秋水仙碱、环孢素A、乙酰半胱胺酸、抗凝剂、吡非尼酮、西地那非和伊马替尼等，但特发性肺纤维化患者对激素和各种药物的治疗反应普遍较差，目前尚无有效改善患者最终预后的药物。病情晚期唯一有效的治疗便为肺移植。因此研究特发性肺纤维化的发生机制以及探讨新的有效防治手段是目前基础和临床关注的热点。
桃叶珊瑚苷(aucubin，AU)属环烯醚萜苷类，分子式为C15H22O9，分子量346.33，熔点181℃，易溶于水、甲醇和乙醇等极性溶剂，几乎不溶于氯仿、乙醚和石油醚等弱极性溶剂。该化合物主要存在于杜仲Eucommia ulmoides Oliver、山茱萸科植物桃叶珊瑚属(Aucubachinensis)、车前科植物车前属(Plantago)等植物中，是杜仲、车前草、地黄等中草药的有效成分之一，具有保肝解毒、抗炎、抗氧化、促进胶原合成、抗骨质疏松及营养神经元细胞等众多药理活性。桃叶珊瑚苷结构式如下：
杜仲为杜仲科植物杜仲的干燥树皮，是中国名贵滋补药材。具补肝肾、强筋骨、降血 压、安胎等诸多功效，它是中国特有药材，其药用历史悠久，在临床有着广泛的应用。杜仲翅果是杜仲产业的副产品，含有杜仲胶、油脂、蛋白质、环烯醚萜等，其中桃叶珊瑚苷(aucubin，AU)含量高达7％-11％。桃叶珊瑚苷具有抗炎、抗氧化、解毒保肝、抗菌抗病毒、抗骨质疏松等药理活性，因其性质活泼、生物活性明显但不易获得，被称为“明星分子”，极具开发价值。目前国内外均未见桃叶珊瑚苷对特发性肺纤维化作用的报道。
桃叶珊瑚苷在现有技术中有多种成熟的制备方法，但是目前，从杜仲翅果中提取桃叶珊瑚苷的工艺方法研究较少。中国专利201010297478.7、公开了“一种从杜仲果中提取桃叶珊瑚苷的工艺方法”，主要包括闪式或超声提取、大孔树脂吸附纯化，但该工艺得到桃叶珊瑚苷纯度仅在50％，而且试剂消耗量大、操作繁琐、工业化产生产周期长、成本高，不利于桃叶珊瑚苷单体的工业化生产及开发利用。中国专利201310028642.8公开了“一种从杜仲中快速高效制备桃叶珊瑚苷单体的方法”，该方法经提取-结晶两步即可制得桃叶珊瑚苷，但收率较低，资源浪费严重。中国专利CN 101863938 A公开了“一种制备高纯度桃叶珊瑚苷的方法”，该方法以高分子填料固定相色谱柱、硅胶柱层析、重结晶来分离得到桃叶珊瑚苷，步骤多、产品收率较低、生产周期较长。
发明内容
本发明的目的旨在提供一种桃叶珊瑚苷的新用途。我们研究发现桃叶珊瑚苷对特发性肺纤维化具有防治作用，可用于制备治疗特发性肺纤维化的药物。
为实现上述目的，本发明的技术方案是：
桃叶珊瑚苷在制备治疗特发性肺纤维化药物中的应用。
所述桃叶珊瑚苷优选为杜仲翅果提取物，其中桃叶珊瑚苷纯度为98％以上。
所述桃叶珊瑚苷进一步优选是以杜仲翅果为原料，通过杜仲翅果脱壳，果仁粉碎，经过石油醚脱脂，乙醇提取，加丙酮冷却结晶，再经硅胶柱纯化，得桃叶珊瑚苷单体。
更进一步优选，所述桃叶珊瑚苷是通过以下制备方法得到，包括以下步骤：
①脱脂：将干燥的杜仲果脱壳得果仁，果仁粉碎，石油醚脱脂，得到脱脂粗料；所述石油醚用量为杜仲果果仁质量的6-10倍量，脱脂次数为2-4次，脱脂时间为1.5-4小时；
②提取：将所述脱脂粗料加入乙醇进行提取，过滤，合并提取液，40℃-60℃浓缩至提取液体积的1/5-1/12，得到浓缩提取液；所述乙醇用量为杜仲果质量的6-12倍量，提取次数为3-5次，每次提取时间为2-5小时；
③结晶：将所述浓缩提取液加入丙酮饱和溶解，冷却结晶，得到桃叶珊瑚苷粗晶体；
④硅胶柱层析：将所述桃叶珊瑚苷粗晶体加乙酸乙酯饱和溶解，再加入硅胶层析柱，其中层析用硅胶与桃叶珊瑚苷粗粗晶体的质量比为6:1-11:1，然后用乙酸乙酯和甲醇组成的溶液依次洗脱，收集洗脱液；所述依次洗脱时所用乙酸乙酯和甲醇组成的溶液中乙酸乙酯的浓度由高至低逐渐降低；
⑤浓缩干燥：将所述洗脱液在40℃-60℃浓缩，冷冻干燥，得桃叶珊瑚苷单体产品。优选方案：骤①中所述粉碎后为40-50目。
优选方案：步骤①中石油醚用量为杜仲果果仁的8-9倍量，脱脂次数为3-4次，脱脂时间为2-3小时。
优选方案：步骤②中乙醇用量为原料的8-10倍量，提取次数为3-4次，每次提取时间为3-4小时。
优选方案：步骤③中乙酸乙酯饱和溶解后，将溶解液置于4-10℃冷却,结晶12-72小时。
优选方案：步骤④中层析用硅胶与桃叶珊瑚苷粗粗晶体的质量比为8:1-10:1。
优选方案：步骤④中用乙酸乙酯和甲醇组成的溶液依次洗脱的顺序为：依次按质量比例乙酸乙酯比甲醇为1:0、10:1、6:1、4:1的次序洗脱，用量分别为3-5BV、3-6BV、4-6BV、3-5BV。
下面对本发明做进一步解释和说明。
本发明所述的桃叶珊瑚苷优选为杜仲翅果提取物，可以通过采用选自粉碎、压榨、煅烧、研磨、过筛、渗漉、萃取、水提、醇提、水沉、醇沉、酯提、酮提、层析、过滤等方法得到。以该提取物为活性物质可制成药物制剂，所述提取物可以是浸膏形式的物质，可以是干浸膏也可以是流浸膏，可以是粉末状物质，根据制剂的不同需要制成不同的状态。
本发明还提及桃叶珊瑚苷经过加工制备的适合服用的任何单位剂量形式的药物制剂，这些药物制剂选自以下剂型：片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、栓剂、软膏剂、硬膏剂、霜剂、喷雾剂、滴剂、贴剂，需要时可以制成缓释制剂、肠溶制剂。
本发明的桃叶珊瑚苷，在制备成药物制剂时可加入药物可接受的载体，所述药物可接受的载体选自：抗氧剂、鳌合剂表面活性剂填充剂崩解剂润湿剂分散剂润滑剂溶剂缓释材料肠溶材料pH调节剂、矫味剂、色素等，常用的载体如：甘露糖醇、右旋糖苷、乳糖、葡萄糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、氯化钠、硅衍生物、纤维素及纤维素衍生物、亚硫酸钠、焦亚硫酸钠、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、吐温80、琼脂、碳酸钙、碳酸 氢钙、聚乙二醇、环糊精、β-环糊精、磷脂类材料、高岭土、滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁等。
本发明的桃叶珊瑚苷的药物制剂，是通过将杜仲翅果经过提取或其他方式加工，制成药物活性物质，随后，以该活性物质为原料，需要时加入药物可接受的载体，按照制剂学的常规技术制成药物制剂。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做进一步的解释和说明，实施例中所述百分含量均为质量百分含量。
实施例1杜仲翅果提取物桃叶珊瑚苷的制备
将杜仲翅果脱壳，果仁粉碎至40目，取10kg投入提取罐，加60L石油醚脱脂，脱脂2次，每次3小时，滤出药渣为脱脂粗料。加80L乙醇至脱脂粗料超声提取2小时，提取3次，合并提取液。提取液40℃减压浓缩至原体积的1/8并回收乙醇。浓缩液加丙酮饱和溶解，7℃结晶48小时，粗晶体加乙酸乙酯饱和溶解。取10L硅胶装柱，将饱和液加入硅胶柱，依次用3BV乙酸乙酯(质量比乙酸乙酯:甲醇＝1:0)、4BV10:1乙酸乙酯/甲醇(质量比乙酸乙酯:甲醇＝10:1)、5BV6:1乙酸乙酯/甲醇(质量比乙酸乙酯:甲醇＝6:1)、4BV4:1乙酸乙酯/甲醇溶液洗脱(质量比乙酸乙酯:甲醇＝4:1)，同时用薄层色谱法检测，收集桃叶珊瑚苷流分，合并洗脱液，40℃减压浓缩，冷冻干燥，得到桃叶珊瑚苷单体410g，经HPLC法测定，其含量达98.7％。
实施例2杜仲翅果提取物桃叶珊瑚苷的制备
将杜仲翅果脱壳，果仁粉碎至50目，取10kg投入提取罐，加80L石油醚脱脂，脱脂3次，每次4小时，滤出药渣为脱脂粗料。加100L乙醇至脱脂粗料超声提取4小时，提取5次，合并提取液。提取液40℃减压浓缩至原体积的1/10并回收乙醇。浓缩液加丙酮饱和溶解，4℃结晶72小时，粗晶体加乙酸乙酯饱和溶解。取10L硅胶装柱，将饱和液加入硅胶柱，依次用3BV乙酸乙酯(质量比乙酸乙酯:甲醇＝1:0)、4BV10:1乙酸乙酯/甲醇(质量比乙酸乙酯:甲醇＝10:1)、5BV6:1乙酸乙酯/甲醇(质量比乙酸乙酯:甲醇＝6:1)、4BV4:1乙酸乙酯/甲醇溶液洗脱(质量比乙酸乙酯:甲醇＝4:1)，同时用薄层色谱法检测，收集桃叶珊瑚苷流分，合并洗脱液，40℃减压浓缩，冷冻干燥，得到桃叶珊瑚苷单体480g，经HPLC法测定，其含量达99.2％。
实施例3
将实施例1和实施例2所得到的桃叶珊瑚苷以及市售的桃叶珊瑚苷(购于上海源叶生 物科技有限公司)用于实施例3的对特发性肺纤维化的保护实验研究。
1.实验方法
1.1剂量设计和分组
实验分为正常对照组、模型组、桃叶珊瑚苷低剂量组(1mg/kg)、中剂量组(5mg/kg)、高剂量组(10mg/kg)、市售的桃叶珊瑚苷(10mg/kg)以及吡非尼酮阳性对照组(10mg/kg)。
表1试验分组和剂量设计
1.2实验步骤
健康雄性SD大鼠70只(体重250～300g)，随机分为7组：作为正常对照组(A组)、博来霉素组(B组)、桃叶珊瑚苷低、中、高剂量组(C、D、E组)，市售的桃叶珊瑚苷组(F组)、吡非尼酮阳性对照组(G组)。B组大鼠腹腔注射3％戊巴比妥钠(30mg/kg)，麻醉后仰卧固定于鼠台，颈部备皮后常规消毒铺巾，切开皮肤后逐层钝性分离暴露气管，以1mL的注射器斜行刺入气管内，向肺内快速注射博来霉素溶液0.2-0.3ml，立即竖起鼠板，左右摇晃2分钟，使药液均匀分布在两肺内，再次消毒皮肤后关闭伤口。A组注射相同体积的生理盐水。C、D、E、F、G组大鼠造模方法同B组，于气管注射博来霉素第二日开始每日给予腹腔注射低、中、高剂量的桃叶珊瑚苷和吡非尼酮溶液。每日实验前将桃叶珊瑚苷用蒸馏水、氟非尼酮用0.5％羟甲基纤维素钠按剂量配制成相应浓度，现配现用，按10mL/kg灌胃给药。A组及B组在手术第二日开始给予等体积的蒸馏水。实验期间大鼠自由饮水，进食(标准饮食)。每周测量大鼠体重一次。于实验开始给药后的第4周处死大鼠。采用股动脉放血法，戊巴比妥钠麻醉后，将大鼠仰卧固定于鼠台上，开胸显露心肺，取下肺脏后用生理盐水反复清洗，电子天平称量体重和肺重，计算肺系数(肺脏重量 /体重×100％)。4％甲醛固定右上肺、左下肺，常规脱水包埋，制成5μm厚石蜡切片，以备HE染色。
1.3检测指标
肺组织形态观察：分别取大鼠肺脏置于4％甲醛中固定，常规脱水、包埋、切片、HE染色。根据Szapiel等提供的方法，确定肺泡炎和肺纤维化程度，进行病理半定量分析。
肺泡炎分级:
0级:无肺泡炎；
1级:轻度肺泡炎，病变范围局限在全肺20％以下；
2级:中度肺泡炎，病变范围占全肺20％-50％；
3级:弥漫性肺泡炎，病变范围大于50％。
肺间质纤维化分级:
0级:无肺间质纤维化；
1级:轻度肺间质纤维化，病变范围局限在全肺20％以下；
2级:中度肺间质纤维化，病变范围占全肺20％-50％；
3级:重度肺间质纤维化，病变范围大于50％，肺泡融合，肺实质结构紊乱。
利用显微图像分析系统，对病理切片进行肺泡炎和纤维化程度自动测量，将肺组织HE染色病理切片分成以下三个区域进行分析:
(1)无染区:为肺泡腔所占面积。
(2)深染区:为细胞核所占面积。
(3)浅染区:为肺间质纤维结缔组织所占面积。
肺泡炎和肺纤维化的程度可由以上三个区域所占面积的不同进行确定。肺泡炎时肺间质炎性细胞浸润增加，表现为深染区面积增加，而纤维化时，肺泡大多塌陷或消失，间质出现大量胶原纤维，表现为无染区面积减少，浅染区面积增加。用深染区代表细胞核所占面积，即肺泡炎症面积，浅染区代表纤维结缔组织与胶原纤维所占面积，无染区代表肺泡腔面积。将病理切片置于图像分析仪显微镜下，在10x视野下，每张切片由左到右，由上到下依次选取10个视野进行图像分析，测出相应各区的面积值(象素/视野)，并换算成(um2/视野)，取平均值。
1.4统计方法：
采用SPSS16.0进行统计分析，统计学意义的水平设定为P<0.05。采用均数±标准差 用Leven’s test方法检验正态性和方差齐性。如果符合正态性和方差齐性，用单 因素方差分析(One-way ANOVA)和post Hoc LSD进行统计分析；如果不符合正态性和方差不齐，则用Kruskal-Wallis检验。如果Kruskal-Wallis检验有统计学意义(P<0.05)，则用Dunnett’s Test(非参数方法)进行比较分析。评价时考虑统计学差异和生物学意义。
2实验结果
桃叶珊瑚苷对肺组织病理的影响
与正常对照组比较，模型组大鼠呈现重度肺泡炎，局部有较多出血灶，肺泡隔增宽，炎性细胞浸润，巨噬细胞活化明显：体积增大，细胞内含有大量颗粒，大部分巨噬细胞呈泡沫样改变；片状聚集活化的成纤维细胞紧密相邻，肺泡隔及炎症区域见片状增生的胶原纤维，纤维化程度明显增加。从平均病理积分统计结果可以看出，模型组病理积分显著高于假手术组，提示肾纤维化模型造模成功。给药15天后，桃叶珊瑚苷高剂量组以及氟非尼酮阳性对照组、市售的桃叶珊瑚苷与模型组相比均出现显著差异，肾间质纤维化情况有所好转。
表2桃叶珊瑚苷对各组大鼠肺系数的影响
注：与正常对照组比较，++P<0.01，与模型组比较，*P<0.05。
3实验小结
上述结果表明，桃叶珊瑚苷高剂量组、市售的桃叶珊瑚苷组能显著改善特发性肺纤维化模型的肺泡炎、巨噬细胞泡沫样改变、纤维细胞活化和胶原纤维增生等症状，对特发性肺纤维化有一定的改善作用。