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1、(10)授权公告号 CN 102119948 B (45)授权公告日 2012.11.21 CN 102119948 B *CN102119948B* (21)申请号 201110059033.X (22)申请日 2011.03.13 A61K 36/286(2006.01) A61P 9/00(2006.01) A61P 9/10(2006.01) (73)专利权人 浙江大学 地址 310027 浙江省杭州市西湖区浙大路 38 号 (72)发明人 程翼宇 王毅 李云飞 葛志伟 (74)专利代理机构 杭州求是专利事务所有限公 司 33200 代理人 张法高 赵杭丽 CN 101073587 A。
2、,2007.11.21, CN 1428170 A,2003.07.09, 吴冬青等 . 红花黄色素提取工艺研究 .中 国野生植物资源 .2004, 第 23 卷 ( 第 01 期 ), 郑为超等 . 红花总黄素对异丙肾上腺素所致 心肌缺血大鼠的保护及机制研究 .中国实验方 剂学杂志 .2003, 第 9 卷 ( 第 06 期 ), 陈铎葆等 . 红花黄素预处理对大鼠心肌缺氧 / 再给氧损伤的影响 .中国中医急症 .2005, 第 14 卷 ( 第 01 期 ), (54) 发明名称 具心肌保护作用的红花有效组分及制备方法 与用途 (57) 摘要 本发明提供一种具有心肌保护作用的红花有 效组分。
3、， 将药材通过加热提取， 浓缩， 硅胶柱分离， 洗脱， 洗脱液浓缩干燥， 再用制备液相色谱继续分 离， 收集溶液， 溶液经浓缩干燥后得到有效组分。 本发明提供的红花有效组分可在制备治疗、 预防 心血管疾病药物中的应用。 本发明方法设计合理， 能快速准确地得到有效成分， 在生产中更易于药 物的质量控制。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 赵帅眉 权利要求书 1 页 说明书 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 3 页 1/1 页 2 1. 一种具有心肌保护作用的红花有效组分， 其特征在于， 通过以下步骤获得 ： 取红花 药材加。
4、入体积比为 1:1 的乙酸乙酯和乙醇， 加热回流 1 小时， 提取 2 次， 滤液合并得提取液 ； 将提取液浓缩成浸膏， 并将其与硅胶进行拌样， 用正相硅胶柱对其进行分离， 首先用体积比 为50:1的石油醚和乙酸乙酯作为洗脱剂， 得洗脱液I， 弃之， 然后改用体积比为10:1的氯仿 和甲醇作为洗脱剂， 得洗脱液 II， 将洗脱液 II 浓缩干燥后得样品 ； 用制备液相色谱继续分 离得到的样品 ： 制备色谱的分离条件 ： 色谱柱为 ZORBAX SB C18； 9.4mm 250mm， 5m 的半 制备柱， 流动相为水 A 和乙腈 B， 梯度洗脱程序如下 ： 0min， 30%B ； 18min。
5、， 40%B ； 30min， 50%B ； 流速为 3ml/min， 柱温为室温 ； 经制备液相色谱分离， 在 17.0-23.8min 时间段收集溶液， 溶 液经浓缩干燥后得到有效组分。 2. 根据权利要求 1 所述的一种红花有效组分在制备治疗心血管疾病的药物中的应用。 3. 根据权利要求 2 所述的应用， 其特征在于， 所述药物由红花有效组分加入药剂学上 可接受的辅料， 按照药剂学上记载的制剂制备方法制成。 4. 根据权利要求 3 所述的应用， 其特征在于， 所述的制剂包括液体制剂或固体制剂。 权 利 要 求 书 CN 102119948 B 2 1/3 页 3 具心肌保护作用的红花有效。
6、组分及制备方法与用途 技术领域 0001 本发明属中药领域， 涉及一种治疗心血管疾病的中药提取物， 具体涉及从红花中 提取的有效组分， 制剂及其制备方法与用途。 背景技术 0002 心血管疾病是危害人类健康的第一杀手， 近年来， 随着我国人口老年化以及人们 工作、 生活、 饮食结构及环境等的变化， 冠心病等心脑血管疾病的发生率也逐年增多， 严重 威胁着人民的身心健康。 天然产物中许多活性物质具有抗心肌缺血、 缺氧作用， 其中一些已 开发成治疗冠心病和心绞痛的新药。因而从天然产物中寻找具有抗心肌缺血、 缺氧生理活 性的有效物质， 是发现、 开发新药的有效途径之一。我国药用生物资源十分丰富， 其生。
7、理活 性物质是研究和发现新药先导化学物， 开发新药的天然宝库。 目前， 我国从天然产物中提取 活性物质， 用于开发成治疗冠心病、 安全性好、 毒性低的新药还很少， 从天然产物中提取活 性物质， 开发成具有抗心肌缺血， 用于治疗冠心病和心绞痛的新药， 具有重要应用价值和广 阔发展前景。 0003 红花为菊科植物红花 Carthamus tinctorius L. 的管状花。性味 性温， 味辛， 具 有活血通径、 散瘀止痛的功效。含有红花黄色素 （Safflor yellow） 、 红花苷 （Carthamin） 、 15， 20- 二 羟 基 -4- 娠 烯 -3- 酮 （15， 20 -Dih。
8、ydroxy-4-pregnen-3-one） 、 木犀草素 -7- 葡萄糖苷 （Luteolin-7-glucoside） 、 红花醌苷 （carthamone） 、 新红花苷 （neo-cqrthamin） 、 腺嘌呤核苷 (adenosine)、 黄色素 （safflor yellow A） 、 山柰酚、 槲皮 素及槲皮素、 槲皮素 -3- 葡萄糖苷、 桷皮素 -7- 葡萄糖苷、 山柰酚 3- 芸香糖苷和芦丁 （rutin） 、 红花多糖等化合物。 0004 现代药理研究表明 ： 红花水提取物及红花水溶性混合物 - 红花黄色素有增加冠脉 血流量及心肌营养性血流量的作用， 在兔、 大鼠、 。
9、犬等造成实验性心肌缺血或心肌梗塞的动 物模型上， 红花及其制剂均有不同程度的对抗作用。红花可使因垂体后叶素引起的大鼠或 家兔急性心肌缺血有明显保护作用 ； 可使反复短暂阻断冠状动脉血流造成麻醉犬急性心肌 缺血的程度明显减轻， 范围缩小， 心率减慢， 并保护急性心肌梗塞区的边缘， 缩小梗塞范围 及降低边缘区心电图 ST 段抬高的幅度， 从而改善缺血心肌氧的供求关系。红花具有非常显 著地抑制 ADP 诱导的家兔血小板聚集作用， 并对 ADP 已聚集的血小板也有非常明显的解聚 作用。红花尚可明显延长家兔血浆复钙时间、 凝血酶原时间和凝血时间。表明它能同时影 响体内和体外的凝血系统。此外， 红花油有降。
10、低血脂作用。红花具有以上对心血管系统的 明显药理作用， 因此， 从红花中分离出有效组分， 开发出治疗心血管疾病的现代中药具有重 要的意义。 发明内容 0005 本发明的目的是提供一种具有心肌保护作用的红花有效组分， 通过以下步骤制备 获得 ： 将红花药材加入乙酸乙酯和乙醇， 加热提取得提取液， 将提取液浓缩成浸膏， 并将其 说 明 书 CN 102119948 B 3 2/3 页 4 与硅胶进行拌样， 用正相硅胶柱对其进行分离， 首先用石油醚和乙酸乙酯作为洗脱剂， 得洗 脱液 I， 弃之， 然后改用氯仿和甲醇作为洗脱剂， 得洗脱液 II， 将洗脱液 II 浓缩干燥后得样 品 ； 用制备液相色谱。
11、继续分离得到的样品 ； 制备色谱的分离条件 ： 色谱柱为半制备柱， 流动 相为水和乙腈， 梯度洗脱。 0006 具体制备步骤如下 ： 取红花药材， 加入体积比为 1:1 的乙酸乙酯和乙醇， 加热回流 1 小时， 提取 2 次， 滤液合并得提取液。将提取液浓缩成浸膏， 并将其与硅胶进行拌样， 用正 相硅胶柱对其进行分离， 首先用体积比为 50:1 的石油醚和乙酸乙酯作为洗脱剂， 得洗脱液 I， 弃之， 然后改用体积比为 10:1 的氯仿和甲醇作为洗脱剂， 得洗脱液 II， 将洗脱液 II 浓 缩干燥后得样品 ； 用制备液相色谱继续分离得到的样品 ： 制备色谱的分离条件 ： 色谱柱为 制备柱 (Z。
12、ORBAX SB C18;9.4mm 250mm,5)， 流动相为水 A 和乙腈 B， 梯度洗脱程序如下 ： 0min 时， 流动相 A 为 70% 的水， 流动相 B 为 30% 的乙腈溶液 ； 18 min 时， 流动相 A 为 60% 的水， 流动相 B 为 40% 的乙腈溶 液 ； 30min 时， 流动相 A 为 50% 的水， 流动相 B 为 50% 的乙腈溶液 ； 流速为 3ml/min， 柱温为 室温 ； 经制备液相色谱分离， 在 17.023.8min 时间段收集溶液， 溶液经浓缩干燥后得到有 效组分。 0007 本发明的另一个目的是提供所述红花有效组分在制备治疗心血管疾病的。
13、药物中 的应用。经药理实验证明， 本发明提供的红花有效组分对心肌细胞有保护作用。 0008 本发明的红花有效组分可以作为活性成分， 加入药剂学上接受的辅料， 按照药剂 学上记载的制剂的制备方法制成制剂。 0009 所述的制剂包括注射液、 滴注液、 粉针剂、 颗粒剂、 片剂、 冲剂、 散剂、 口服液、 糖衣 片剂、 薄膜衣片剂、 肠溶衣片剂、 胶囊剂、 硬胶囊剂、 软胶囊剂、 口含剂、 颗粒剂、 丸剂、 膏剂、 丹剂、 喷雾剂、 滴丸剂 、 崩解剂、 口崩片、 微丸等。 0010 本发明的红花有效组分及其制剂可在制备治疗、 预防心血管疾病药物中应用。本 发明提供的制备方法设计合理， 能快速准确地。
14、得到有效成分， 在药理研究上更易于阐明其 作用机制， 在生产中更易于药物的质量控制。 具体实施方式 0011 下面将结合实施例进一步详细说明本发明的实质内容和有益效果， 该实施例仅用 于说明本发明而非对本发明的限制。 0012 实施例一 红花有效组分的制备 0013 将红花药材加入乙酸乙酯和乙醇， 加热提取得提取液， 将提取液浓缩成浸膏， 并将 其与硅胶进行拌样， 用正相硅胶柱对其进行分离， 首先用石油醚和乙酸乙酯作为流洗脱剂， 得洗脱液 I， 弃之， 然后改用氯仿和甲醇作为洗脱剂， 得洗脱液 II， 将洗脱液 II 浓缩干燥后 得样品 ； 用制备液相色谱继续分离得到的样品 ； 制备色谱的分离。
15、条件 ： 色谱柱为半制备柱， 流动相为水和乙腈， 梯度洗脱。在 17.023.8min 时间段收集溶液， 浓缩干燥后得到有效组 分。 0014 实施例二 红花有效组分的制备 0015 取红花药材250g， 将其粉碎后加入体积比为1:1的乙酸乙酯和乙醇， 加热回流1小 时， 提取 2 次， 滤液合并得提取液。将提取液浓缩成浸膏， 并将其与硅胶进行拌样， 用正相硅 说 明 书 CN 102119948 B 4 3/3 页 5 胶柱对其进行分离， 首先用体积比为 50:1 的石油醚和乙酸乙酯作为洗脱剂， 得洗脱液 I， 弃 之， 然后改用体积比为 10:1 的氯仿和甲醇作为洗脱剂， 得洗脱液 II，。
16、 将洗脱液 II 浓缩干燥 后得样品 ； 用制备液相色谱继续分离得到的样品 ： 制备色谱的分离条件 ： 色谱柱为半制备 柱 (ZORBAX SB C18;9.4mm 250mm,5)， 流动相为水 A 和乙腈 B， 梯度洗脱程序如下 ： 0min 时， 流动相 A 为 70% 的水， 流动相 B 为 30% 的乙腈溶液 ； 18 min 时， 流动相 A 为 60% 的 水， 流动相 B 为 40% 的乙腈溶液 ； 30min 时， 流动相 A 为 50% 的水， 流动相 B 为 50% 的乙腈溶 液 ； 流速为3ml/min， 柱温为室温 ； 经制备液相色谱分离， 在17.023.8min时。
17、间段收集溶液， 溶液经浓缩干燥后得到有效组分。 0016 实施例三 滴丸制剂的制备 0017 取红花有效组分 0.5g 与 10.5g 聚乙二醇 -20000 混合均匀， 加热熔融， 化料后移至 滴丸滴灌中， 药液滴至 68液体石蜡中， 除油， 制得滴丸 400 粒。 0018 实施例四 冻干粉针剂的制备 0019 取红花有效组分 0.5g、 葡萄糖 4.5g、 硫代硫酸钠 0.9g 和蒸馏水 1000ml， 上述组分 混合均匀后， 分装 400 支， 冷冻干燥， 即得。 0020 实施例五 红花组分的活性评价实验 0021 1红花组分对 H2O2损伤心肌细胞的保护作用 0022 体外培养 H。
18、9C2心肌细胞， 培养液为 DMEM( 高糖 )+10%FBS(G)+1% 非必需氨基酸 +0.1%双抗。 取对数生长期细胞置于96孔细胞培养板上， 恒温培养24 h后， 加入200mol/ mL H2O2损伤心肌细胞30 min， 再加入终浓度为50g/mL的红花组分孵育24 h， 采用MTT法 测定细胞活力。结果表明， 该组分对 H2O2损伤心肌细胞的保护率为 16.27%。 0023 2. 红花组分对缺氧复氧损伤心肌细胞的保护作用 0024 体外培养 H9C2心肌细胞， 培养液为 DMEM( 高糖 )+10%FBS(G)+1% 非必需氨基酸 +0.1% 双抗。取对数生长期细胞置于 96 孔细胞培养板上， 恒温培养 24 h 后， 在缺氧小室中 培养 6 h。缺氧结束后， 取出细胞培养板加入经无糖 Hank s 稀释的终浓度为 50g/mL 的 红花组分， 在正常培养条件下孵育 6 h， 取细胞培养上清液测定乳酸脱氢酶 (LDH) 含量。结 果表明， 该组分对缺氧复氧损伤的心肌细胞保护率为 13.04%。 说 明 书 CN 102119948 B 5 。