本发明涉及包含调节细胞容量的人激酶h-sgk的抑制剂或激活剂 的药物。这类药物适用于治疗其中h-sgk的表达增加或减少的病理状 态。EP-0 861 896已描述了h-sgk及其制备方法，该文的内容也特意 引入以构成本说明书的一部分。
术语的定义：
h-sgk：人血清和糖皮质素依赖性激酶(丝氨酸/苏氨酸激酶)
ENaC：上皮Na+通道
MDEG：哺乳动物退化蛋白(Waldmann，R.，Lazdunski，M.(1998) 《神经生物学流行观点》8：418-424)；同义词是“BNC”(脑Na+通 道)
TGFβ1：肿瘤生长因子β1
NKCC：Na+，K+，2Cl-协同转运蛋白
HEPES：[4-(2-羟乙基)哌嗪基]乙磺酸
SEM：平均标准误差
反式显性抑制激酶：通过突变修饰的h-sgk：127位上的赖氨酸已 被精氨酸取代(K127R)；突变位于催化区中并抑制激酶的催化功能。
糖尿病、动脉硬化、早老性痴呆、肝硬化、节段性回肠炎、纤维化 胰腺炎、肺纤维变性和慢性支气管炎中常见h-sgk的表达增加。h-sgk 的产生增加可以用TGFβ1对表达的刺激来解释(图1)。纤维变性疾病 是由基质蛋白的形成增加和分解减少引起的。二者都是TGFβ1的作用。 成纤维细胞中基质蛋白表达的增加可以通过用呋塞米抑制NKCC得以抑 制(图2)。迄今仍不清楚h-sgk表达的增加仅是结果还是疾病的原因。
现在出人意料的发现证明h-sgk激活Na+，K+，2Cl-协同转运(图 3)。由此可以得出结论：h-sgk对NKCC的刺激诱导纤维变性。除了 Na+，K+，2Cl-协同转运外，h-sgk还激活ENaC(图4和5)和MDEG。
h-sgk对ENaC的刺激作用可以用激酶抑制剂诸如象星形孢菌素 (Sigma，D-82041 Deisenhofen)或白屈菜红(Chelerythrin) (Sigma，loc.cit)加以抑制(图4)。另外，h-sgk对ENaC的作 用可以用反式显性抑制激酶抑制(图5)。h-sgk的抑制剂诸如星形孢 菌素、白屈菜红或其他激酶抑制剂因此可用于治疗上面所提到的疾病。 一般来说，适合于此目的的是所有已知的激酶抑制剂。在许多情况下， 激酶抑制剂也可从商业上获得，例如从Calbiochem-Novabiochem GmbH，Listweg 1，D-65812 Bad Soden购得(参见“1998年总商 品目录”)。其他激酶抑制剂可以从技术人员已知的其他商业或非商业 来源得到。
在癫痫发作中h-sgk的表达增加。我们已发现的功能数据显示该作 用适于减少神经元的应激性，因为NKCC的激活导致细胞外K+浓度下降， 接着发生超极化并因此抑制了神经元的活性。此外，MDEG的抑制会抑 制神经元的应激性。因此，穿过血脑屏障的激酶激动剂可以成功地用于 癫痫发作。相反，穿过血脑屏障的药物对激酶的抑制可能增加注意力和 学习能力。此外，激酶激活剂已为技术人员知悉了很长时间，其中蛋白 质激酶C激活剂是特别令人感兴趣的(参见：例如 Calbiochem-Novabiochem 1998 General Catalog，loc.cit.)。 其他激酶激活剂可以从技术人员已知的其他商业和非商业来源得到。
由于Na+，K+，2Cl-协同转运和Na+通道对肾的Na+吸收是决定性的， 且肾Na+吸收的增加伴随高血压，因此必须假定激酶的表达增加导致高 血压，而激酶的表达减少导致低血压。
本发明因此还涉及h-sgk的抑制剂在生产用于治疗糖尿病、动脉硬 化、早老性痴呆、肝硬化、节段性回肠炎、纤维化胰腺炎、肺纤维变性、 慢性支气管炎、放射性纤维化、硬皮病、囊纤维变性和其他纤维变性疾 病的药物、以及用于治疗本质性高血压的药物中的用途。包含h-sgk 的抑制剂或激活剂的药物另外还可用于调节神经元的应激性。特别有利 的是使用抑制剂星形孢菌素或白屈菜红及它们的类似物。
结果
糖尿病性肾：
h-sgk在正常肾脏中的表达只是很低的。肾小球、后近端和远端小 管中的一些细胞显示出清楚的h-sgk表达。与此对照，具有大量h-sgk 表达的细胞积聚在糖尿病性肾中。
动脉硬化：
大量表达h-sgk的细胞常见于动脉硬化脉管的管壁中。
早老性痴呆：
在正常的脑中只有零星的表达h-sgk的细胞。这些细胞大概是少突 神经胶质细胞。表达h-sgk的细胞的量在早老性痴呆患者的脑中明显 增加。
肝硬化：
在正常的肝脏中只有铜细胞表达h-sgk。但是，在肝硬化中，组织 中密布表达h-sgk的细胞。
节段性回肠炎：
在正常的肠组织中，h-sgk只在肠细胞中表达。但是在节段性回肠 炎中，结缔组织中也发现了激酶。
纤维化胰腺炎：
在正常的胰腺中，h-sgk见于腺泡细胞和管细胞。在胰腺管周围可 见偶见表达h-sgk的单核细胞。在纤维化胰腺炎中激酶的表达有显著 的增加。
肺纤维变性和慢性支气管炎：
在肺纤维变性和慢性支气管炎中观察到h-sgk的大量表达。
TGFβ1对h-sgk表达的刺激：
h-sgk的表达受到TGFβ1的刺激(图1)。既然TGFβ1在纤维化/ 发炎的组织中产生，这一发现就解释了在发炎的组织中h-sgk的表达 增加的原因。
TGFβ1刺激基质蛋白双糖链蛋白聚糖的表达，一种受到NKCC抑制 剂呋塞米抑制的作用：
TGFβ1刺激双糖链蛋白聚糖的表达。在NKCC抑制剂呋塞米的存在 下，TGFβ1对双糖链蛋白聚糖表达的作用完全被抑制。因此NKCC的活 化是TGFβ1的纤维化作用的先决条件(图2)。
h-sgk对NKCC的刺激：
激酶在纤维化组织中表达增加的重要性可能是多方面的，与纤维变 性没有因果联系。但是，用双电极电压夹钳进行的实验显示NKCC的活 性受到h-sgk的极大刺激(图3)。鉴于双糖链蛋白聚糖合成的呋塞米 敏感性，这一发现明确地证明了h-sgk在纤维变性中的因果性作用。
h-sgk对ENaC的刺激：
这种作用可以受到激酶抑制剂星形孢菌素和白屈菜红的抑制。如图 4所示，通过与h-sgk共表达而使得通过ENaC的流量大量增加。因此 激酶刺激ENaC。激酶抑制剂星形孢菌素和白屈菜红能完全抑制h-sgk 对ENaC的活化。
h-sgk对上皮ENaC的刺激可以通过反式显性抑制激酶h-sgk的共 表达逆转：
如图5所示，h-sgk共表达对ENaC介导的Na+流量的刺激作用可 以通过反式显性抑制激酶的共表达得以抑制。这种反式显性抑制激酶 (对照“术语的定义”)的催化单元上进行的修饰使得它能不再表现出 其功能。但是，由于它能结合底物，因此能置换活性激酶并由此抑制其 作用。反式显性抑制激酶不仅抑制外源h-sgk导致的ENaC活性的增加， 而且明显抑制内源h-sgk引起的刺激。
MDEG通过与h-sgk的共表达而完全阻断：
如图6所示，MDEG在卵母细胞中的表达导致了强Na+流量，其通过 降低细胞外pH而激活。该通道完全被与h-sgk的共表达阻断。由此必 定得出结论：h-sgk抑制神经元应激性。
实施例：
实施例1：原位杂交
将从正常的胰腺、肝、血管、脑、肺、肾和肠得到的组织、以及患 有糖尿病性肾病、动脉硬化、早老性痴呆、肝硬化、节段性回肠炎、纤 维化胰腺炎和肺纤维变性的组织在石蜡中在4％低聚甲醛/0.1M磷酸钠 缓冲液(pH7.2)中包埋4小时。将组织切片脱蜡并如以前所述进行杂交 (Kandolf，R.，D.Ameis，P.Kirschner，A.Canu，P.H.Hofschneider， 《美国国家科学院院报》84：6272-6276，1987年；Hohenadl，C.， K.Klingel，J.Mertsching，P.H.Hofschneider，R.Kandolf.，《分 子细胞探针》5：11-20，1991年；Klingel，K.，C.Hohenadl，A.Canu， M.Albrecht，M.Seemann，G.Mall，R.Kandolf，《美国国家科学院 院报》89：314-318，1992年)。
杂交混合物或者含有35S标记的编码h-sgk的有义RNA，或者含有 35S标记的与最后提及的RNA互补的反义RNA(各500ng/ml)，它们都 存在于10mM Tris-HCl，pH7.4；50％(vol/vol)去离子甲酰胺；600mM NaCl；1mM EDTA；0.2％聚乙烯吡咯烷酮；0.02％菲可；0.05％小牛血 清白蛋白；10％葡聚糖硫酸酯；10mM二硫苏糖醇；200μg/ml变性的超 声处理过的鲑精子DNA和100μg/ml兔肝tRNA。
与RNA探针的杂交在42℃下进行18小时。玻片如(Hohenadl等， 1991年；Klingel等，1992年)所述洗涤，然后在2x标准柠檬酸钠 中在55℃下培养1小时。未杂交的单链RNA探针用存在于10mM Tris-HCl，pH8.0/0.5M NaCl中的RNA酶A(20μg/ml)在37℃下消 化30分钟。然后组织样品放射自显影3周(Klingel等，1992年) 并用苏木精/曙红染色。
实施例2：双糖链蛋白聚糖和h-sgk的转录调节
细胞在添加了10％(vol/vol)胎牛血清(FCS)的RPMI/5％CO2/10mM 葡萄糖中在37℃、pH7.4下培养。细胞生长至90％融合，然后在 TRIZOL(GIBCO/BRL)中匀化(每份样品约0.4×106)。按照制造商的指 示制备总RNA。Northern印迹的分级分离利用在2.4mol/l甲醛的存 在下通过带有15或20μg总RNA和独立的对照的10g/l琼脂糖凝胶电 泳进行。RNA通过真空(Appligene Oncor Trans DNA Express Vacuum Blotter，Appligene，Heidelberg，Germany)转移到带正电荷的 尼龙膜(Boehringer Mannheim，Germany)上，在紫外线(UV Stratalinker 2400，Stratagene，Heidelberg，Germany)下交 联。杂交用DIG-Easy-Hyb(Boehringer Mannheim)以25μl/l的探 针浓度在50℃下进行过夜。用地高辛配基(DIG)标记的探针如早先的详 细描述(Waldegger等(1997)PNAS 94：4440-4445)通过PCR生产。 至于放射自显影法，让滤器暴露于X射线膜(Kodak)平均5分钟。
实施例3：双电极电压夹钳和示踪流实验
有爪蟾蜍的解剖以及卵母细胞的获得和处理已在早先作了详细描 述(Busch等，1992年)。卵母细胞各自注射1ng NKCC、ENaC或MDEG 的cRNA，同时注射或不注射h-sgk。注射后2-8天就可进行双电极电 压和流量夹钳实验。被呋塞米抑制的通过NKCC的Na+流入利用摄取到 卵母细胞中的22Na+摄取测量，其用闪烁计数器确定。Na+流量(ENaC) 在10Hz过滤并用笔记录器记录。实验通常在cRNA注射后的第二天进 行。浴溶液含有：96mM NaCl，2mM Kcl，1.8mM CaCl2，1mM MgCl2和5mM HEPES，pH7.5，支持电位为-50mVY。所有实验中pH通过用HCl或NaOH滴定来调节。浴液的流动速率设定为20ml/分钟，它能确保在 测量室中在10-15秒内完全改变溶液。所有数据以算术平均值±SEM的 形式给出。
附例说明：
图1：TGFβ1对h-sgk表达的刺激：
h-sgk的表达受TGFβ1的刺激。显示了0.5到6小时后TGFβ1的作用(上图)。佛波酯PDD(4-α-佛波醇12，13-二癸酸酯；刺激蛋 白激酶C)和Ca++离子载体离子霉素(Sigma，lot.cit；增加细胞内 Ca++浓度)同样刺激h-sgk表达(下图)。
图2：TGFβ1对双糖链蛋白聚糖表达的刺激：
双糖链蛋白聚糖(B)的表达受细胞渗透膨胀(hypo＝h，左上 图)和TGFβ1(右上图)的刺激。TGFβ1对双糖链蛋白聚糖表达的作用 在NKCC抑制剂布美他尼(b)(对照＝c)的存在下几乎完全被抑制。
图3：h-sgk对NKCC的刺激：
22Na+在表达NKCC的卵母细胞中的能被呋塞米抑制的摄取〔摄 取(nmol/20分钟/卵母细胞)＝u〕受到h-sgk的极大刺激。注射了NKCC 的卵母细胞没有显示出比未经注射的卵母细胞(n.i.)更高的Na+流入。 这种Na+流入没有被NKCC抑制剂呋塞米(＝F)抑制(上图)。单独的 h-sgk的表达没有导致对Na+流入的刺激。h-sgk与NKCC的共表达导 致Na+流入大量增加，这种增加完全被呋塞米抑制(下图)。
图4：h-sgk对ENaC的刺激：
通过ENaC的流量(I)通过与h-sgk的共表达而大大增加了。 卵母细胞用激酶抑制剂星形孢菌素(S)或白屈菜红(C)处理抑制了 h-sgk对Na+通道的活化。
图5：h-sgk对ENaC的刺激可以通过反式显性抑制激酶的共表达 逆转：
同时表达ENaC和h-sgk的卵母细胞显示出比只表达ENaC的 卵母细胞大得多的流量(I)。反式显性抑制激酶的共表达抑制了h-sgk 对ENaC的刺激。
图6：h-sgk对MDEG的抑制：
通过MDEG的流量(I)在培养持续过程中增加〔天(T)1-4〕。该 流量完全被与h-sgk的共表达抑制(峰值＝p；稳定水平＝pl)。