一种具有荧光性质的虫草多糖及其制备方法.pdf

本发明涉及一种易被检测的虫草多糖及其制备方法，属于生物化学技术领域。是一种具有荧光性质的虫草多糖，由虫草多糖、连接臂和荧光基团组成的，所述虫草多糖通过连接臂与荧光基团连接。其原理是：利用虫草多糖的还原性末端在硼氢化钠的作用下，糖和4-羟基苯乙胺的氨基共价偶联发生还原胺化反应后，生成仲氨基与异硫氰酸荧光素进行亲核反应，生成带有荧光的糖。本发明的有益效果是：通过合成方法使不带有特殊基团的虫草多糖成为易于检测的带有荧光的多糖，在保证虫草多糖的内部结构不被破坏的同时也保证了虫草多糖的抗肿瘤、抗慢性肾衰、增强机体免疫等生物学活性。用荧光标记过后的虫草多糖可以用于相应的药物代谢，药理等多方面的基础研究。

1.  一种具有荧光性质的虫草多糖，其特征在于：是由虫草多糖、连接臂和荧光基团组成的，所述虫草多糖通过连接臂与荧光基团连接。

2.  根据权利要求1所述的具有荧光性质的虫草多糖，其特征在于：所述虫草多糖通过共价键与连接臂连接。

3.  根据权利要求1所述的具有荧光性质的虫草多糖，其特征在于：所述连接臂通过共价键与荧光基团连接。

4.  根据权利要求1所述的具有荧光性质的虫草多糖，其特征在于：所述连接臂是4-羟基苯乙胺。

5.  根据权利要求1所述的具有荧光性质的虫草多糖，其特征在于：所述荧光基团是异硫氰酸荧光素。

6.  根据权利要求1所述的具有荧光性质的虫草多糖的制备方法，包括以下步骤：
(1)在还原剂的催化作用下，将虫草多糖溶于反应溶剂中，加入连接臂发生还原胺化反应，生成虫草多糖-连接臂复合物；
(2)将反应(1)中产生的仲氨基进一步与荧光基团进行反应，生成虫草多糖-连接臂-荧光基团复合物。

7.  根据权利要求6所述的具有荧光性质的虫草多糖的制备方法，其特征在于：
所述的还原剂是硼氢化钠，所述的反应溶剂是磷酸钾缓冲溶液；所述虫草多糖和连接臂的比例在4:3—1:1之间，反应温度为30℃--40℃，反应时间为48h—120h。

8.  根据权利要求6所述的具有荧光性质的虫草多糖的制备方法，其特征在于：
所述步骤(2)中的PH7.5～9。

一种具有荧光性质的虫草多糖及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种易被检测的虫草多糖及其制备方法，属于生物化学技术领域。
背景技术
现代医学研究表明，冬虫夏草具有增强巨噬细胞吞噬力、提高机体免疫的功能，具有一定的抗癌作用，对中枢神经系统具有镇静和催眠效果。此外，对肾脏、心脏、肝脏损伤有保护和防治作用，以及抗衰老、抗缺氧的应激作用，扩张冠状动脉、抗心率失常、降低心肌耗氧量及抗氧化等作用。因为冬虫夏草具有多种医疗和滋补作用，从古至今都受到人们的极大关注，作为冬虫夏草主要活性成分之一的虫草多糖，具有抗慢性肾衰竭的功能。对其活性的研究主要通过动物体内试验来证明虫草多糖具有调节生长转化因子(TGF-β)、血小管衍生生长因子(PDGF)、血管内皮生长因子(VEGF)和体内T细胞活性等作用，但是检测虫草多糖的活性，仅仅是根据这些因子的变化看其活性，无法得知究竟是虫草多糖中的哪个片段发挥着作用，限制了对其进行进一步分子机制的研究。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的缺陷，提出一种具有荧光性质的虫草多糖及其制备方法，为虫草多糖药理药效的研究提供方便。
本发明的目的是通过以下技术方案达到的：一种具有荧光性质的虫草多糖，是由虫草多糖、连接臂和荧光基团组成的，所述虫草多糖通过连接臂与荧光基团连接。其进一步完善的是，所述虫草多糖通过共价键与连接臂连接。所述连接臂通过共价键与荧光基团连接。所述连接臂是4-羟基苯乙胺。所述荧光基团是异硫氰酸荧光素。
具有荧光性质的虫草多糖的制备方法，包括以下步骤：(1)在还原剂的催化作用下，将虫草多糖溶于反应溶剂中，加入连接臂发生还原胺化反应，生成虫草多糖-连接臂复合物；(2)将反应(1)中产生的仲氨基进一步与荧光基团进行反应，生成虫草多糖-连接臂-荧光基团复合物。其进一步完善的是，所述的还原剂是硼氢化钠，所述的反应溶剂是磷酸钾缓冲溶液；所述虫草多糖和连接臂的比例在4：3—1：1之间，反应温度为30℃--40℃，反应时间为48h—120h。
本发明所涉及的虫草多糖是由麦角菌科真菌冬虫夏草中提取到的多糖，主要是由甘露糖，葡萄糖，半乳糖组成。本发明的原理是：虫草多糖的还原性末端在硼氢化钠的作用下，使糖和4-羟基苯乙胺的氨基共价偶联发生还原胺化反应，反应过后生成的仲氨基与异硫氰酸荧光素进行亲核反应，从而生成所需的带有荧光的糖。反应方程式如下：其中n表示甘露糖，

本发明的有益效果是：通过合成方法使不带有特殊基团的虫草多糖成为易于检测的带有荧光的多糖，在保证虫草多糖的内部结构不被破坏的同时也保证了虫草多糖的抗肿瘤、抗慢性肾衰、增强机体免疫等生物学活性。用荧光标记过后的虫草多糖可以用于相应的药物代谢，药理等多方面的基础研究。
附图说明
图1为虫草多糖-连接臂的测定图。图中：1.为虫草多糖-连接臂中连接臂吸收峰。
图2为虫草多糖-连接臂的糖含量测定图。图中：纵坐标表示吸收值，横坐标表示时间。
图3为虫草多糖-连接臂-荧光基团的测定图。图中：1.表示虫草多糖-连接臂-荧光基团中连接臂的吸收峰，横坐标表示管数。
图4为虫草多糖-连接臂-荧光基团的测定图。图中：1.表示荧光基团的吸收峰，2.表示糖含量，纵坐标表示吸收值，横坐标表示管数。
具体实施方式
实施例一
(1)将160mg的虫草多糖溶于6mL的0.2mol/L的磷酸钾缓冲液(PH 8.0)中，然后依次加入160mg的4-羟基苯乙胺和60mg硼氢化钠，于37℃培养箱中反应96h，间或振荡，反应完后离心分离，将上清液上Sephadex G-25柱，用水洗脱，用核酸蛋白检测仪在280nm下进行检测，收集第一个峰，即连接臂的吸收峰，见图1；用硫酸-苯酚法测第一个峰的糖含量，见图2；两个图显示第一个峰有4-羟基苯乙胺的吸收也有糖，表明虫草多糖已与连接臂相连，将第一个峰冷冻干燥得连有4-羟基苯乙胺的虫草多糖。
(2)取上述制得的连有4-羟基苯乙胺的虫草多糖16mg溶于水，用0.5mol/L的NaHCO₃调PH至8.5，然后加入2mg异硫氰酸荧光素，在室温下，避光反应过夜，向反应物中加入无水乙醇至浓度达到80％，有大量亮黄色沉淀析出，离心弃去上清液，沉淀加水复溶，得到带有荧光标记的虫草多糖，并进一步上SephdexG-25柱纯化，收集相应水洗脱组分即第一个峰，用核酸蛋白检测仪在280nm下检测有4-羟基苯乙胺的吸收峰，见图3；并用硫酸-苯酚法测有糖含量，用酶标仪在450nm下测有异硫氰酸荧光素的吸收峰，见图4。两个图表明虫草多糖已与连接臂和荧光基团相连，收集相应水洗脱组分，冷冻干燥保存。
实施例二
步骤同实施例一：
(1)将160mg的虫草多糖溶于6mL的0.2mol/L的磷酸钾缓冲液(PH 8.0)，然后依次加入120mg的4-羟基苯乙胺和60mg硼氢化钠，于30℃培养箱中反应120h，间或振荡，反应完后离心分离，将上清液上Sephadex G-25柱，用水洗脱，用核酸蛋白检测仪在280nm下进行检测，收集第一个峰，冷冻干燥得连有4-羟基苯乙胺的虫草多糖。
(2)将16mg连有4-羟基苯乙胺的虫草多糖溶于水，用0.5mol/L的NaHCO3调PH至7.5，然后加入2mg异硫氰酸荧光素，在室温下，避光反应过夜，向反应物中加入无水乙醇至乙醇浓度80％，有大量亮黄色沉淀析出，离心弃去上清液，沉淀加水复溶，得到带有荧光标记的虫草多糖，并进一步上SephdexG-25柱纯化，收集相应水洗脱组分冷冻干燥保存。
实施例三
步骤同实施例一：
(1)将160mg的虫草多糖溶于6mL的0.2mol/L的磷酸钾缓冲液(PH8.0)，然后依次加入160mg的4-羟基苯乙胺和60mg硼氢化钠，于40℃培养箱中反应48h，间或振荡，反应完后离心分离，将上清液上Sephadex G-25柱，用水洗脱，用核酸蛋白检测仪在280nm下进行检测，收集第一个峰，冷冻干燥得连有4-羟基苯乙胺的虫草多糖。
(2)将16mg连有4-羟基苯乙胺的虫草多糖溶于水，用0.5mol/L的NaHCO3调PH至9，然后加入2mg异硫氰酸荧光素，在室温下，避光反应过夜，向反应物中加入无水乙醇至乙醇浓度80％，有大量亮黄色沉淀析出，离心弃去上清液，沉淀加水复溶，得到带有荧光标记的虫草多糖，并进一步上SephdexG-25柱纯化，收集相应水洗脱组分冷冻干燥保存。
实施例四
步骤同实施例一：
(1)将160mg的虫草多糖溶于6mL的0.2mol/L的磷酸钾缓冲液(PH8.0)，然后依次加入130mg的4-羟基苯乙胺和60mg硼氢化钠，于35℃培养箱中反应96h，间或振荡，反应完后离心分离，将上清液上Sephadex G-25柱，用水洗脱，用核酸蛋白检测仪在280nm下进行检测，收集第一个峰，冷冻干燥得连有4-羟基苯乙胺的虫草多糖。
(2)将16mg连有4-羟基苯乙胺的虫草多糖溶于水，用0.5mol/L的NaHCO₃调PH至8，然后加入2mg异硫氰酸荧光素，在室温下，避光反应过夜，向反应物中加入无水乙醇至乙醇浓度80％，有大量亮黄色沉淀析出，离心弃去上清液，沉淀加水复溶，得到带有荧光标记的虫草多糖，并进一步上SephdexG-25柱纯化，收集相应水洗脱组分冷冻干燥保存。
实施例五
步骤同实施例一：
(1)将160mg的虫草多糖溶于6mL的0.2mol/L的磷酸钾缓冲液(PH8.0)，然后依次加入125mg的4-羟基苯乙胺和60mg硼氢化钠，于37℃培养箱中反应100h，间或振荡，反应完后离心分离，将上清液上Sephadex G-25柱，用水洗脱，用核酸蛋白检测仪在280nm下进行检测，收集第一个峰，冷冻干燥得连有4-羟基苯乙胺的虫草多糖。
(2)将16mg连有4-羟基苯乙胺的虫草多糖溶于水，用0.5mol/L的NaHCO₃调PH至7.8，然后加入2mg异硫氰酸荧光素，在室温下，避光反应过夜，向反应物中加入无水乙醇至乙醇浓度80％，有大量亮黄色沉淀析出，离心弃去上清液，沉淀加水复溶，得到带有荧光标记的虫草多糖，并进一步上SephdexG-25柱纯化，收集相应水洗脱组分冷冻干燥保存。
实施例六
步骤同实施例一：
(1)将160mg的虫草多糖溶于6mL的0.2mol/L的磷酸钾缓冲液(PH8.0)，然后依次加入140mg的4-羟基苯乙胺和60mg硼氢化钠，于32℃培养箱中反应60h，间或振荡，反应完后离心分离，将上清液上Sephadex G-25柱，用水洗脱，用核酸蛋白检测仪在280nm下进行检测，收集第一个峰，冷冻干燥得连有4-羟基苯乙胺的虫草多糖。
(2)将16mg连有4-羟基苯乙胺的虫草多糖溶于水，用0.5mol/L的NaHCO₃调PH至8.7，然后加入2mg异硫氰酸荧光素，在室温下，避光反应过夜，向反应物中加入无水乙醇至乙醇浓度80％，有大量亮黄色沉淀析出，离心弃去上清液，沉淀加水复溶，得到带有荧光标记的虫草多糖，并进一步上SephdexG-25柱纯化，收集相应水洗脱组分冷冻干燥保存。
实施例七
步骤同实施例一：
(1)将160mg的虫草多糖溶于6mL的0.2mol/L的磷酸钾缓冲液(PH8.0)，然后依次加入150mg的4-羟基苯乙胺和60mg硼氢化钠，于37℃培养箱中反应80h，间或振荡，反应完后离心分离，将上清液上Sephadex G-25柱，用水洗脱，用核酸蛋白检测仪在280nm下进行检测，收集第一个峰，冷冻干燥得连有4-羟基苯乙胺的虫草多糖。
(2)将16mg连有4-羟基苯乙胺的虫草多糖溶于水，用0.5mol/L的NaHC0₃调PH至8.3，然后加入2mg异硫氰酸荧光素，在室温下，避光反应过夜，向反应物中加入无水乙醇至乙醇浓度80％，有大量亮黄色沉淀析出，离心弃去上清液，沉淀加水复溶，得到带有荧光标记的虫草多糖，并进一步上SephdexG-25柱纯化，收集相应水洗脱组分冷冻干燥保存。
经分析得，虫草多糖用异硫氰酸荧光素标记过后，冷冻干燥，能在室温下保存，标记过后不含游离的4-羟基苯乙胺和异硫氰酸荧光素。
除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。