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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710849077.X (22)申请日 2017.09.14 (71)申请人 中国药科大学 地址 211198 江苏省南京市江宁区龙眠大 道639号 (72)发明人 尹莉芳 何伟 伊木朗 (51)Int.Cl. A61K 31/145(2006.01) A61K 31/337(2006.01) A61K 9/10(2006.01) A61K 47/42(2017.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 一种用于多抗药性逆转的稳定杂交纳米悬 浮剂 (。
2、57)摘要 稳定杂交的纳米悬浮剂是由抗癌剂和多药 调节剂药物一起封装并按一定比例由食物蛋白 涂抹的纳米粒包埋。 食物蛋白作为一种稳定剂用 于稳定杂交纳米悬浮剂。 纳米悬浮剂运输这两种 药物到肿瘤位点， 逆转紫杉醇耐药性肺腺癌细胞 系的耐药性以及提高细胞凋亡比例。 此外， 杂交 纳米悬浮剂是根据抗溶剂配制方法而制成， 使用 丙酮为药物溶剂。 这种杂交纳米悬浮剂是稳定的 并能释放多耐药性调节药物失活P-糖蛋白和还 原及提高抗癌药物的抗肿瘤效果。 这种杂交纳米 悬浮剂是稳定的均质的可用于耐药肿瘤的治疗。 权利要求书1页 说明书3页 附图11页 CN 108309963 A 2018.07.24 CN。
3、 108309963 A 1.Beta-乳球蛋白均匀包裹的紫杉醇和戒酒硫杂交纳米悬浮剂(PTX-DSF Ns)配制及鉴 定如下： (1)Beta-乳球蛋白( -LG)浓度为0.5-2W/V。 (2)双药(紫杉醇-戒酒硫)浓度为1/0.1-10/1W/W。 (3)丙酮浓度为0.5-2。 2.PTX-DSF Ns的直径为纳米级并带有负界达电位。 3.稳定性研究在10生理盐水、 10PBS(pH7.4)、 10PBS(pH7.4)+10FBS中实施。 纳 米悬浮剂根据粒子大小、 多分散性及界达电位判断可在多种溶液中稳定。 4.PTX-DSF Ns形态学研究使用电镜扫描及透射式电子显微镜观测， 其形态。
4、为针状结 构。 5.结晶度通过PXRD分析得出， 并与PTX、 DSF、 -LG和PTX-DSF Ns混合体对比。 6.载药量通过HPLC检测， PTX-DSF Ns不论对于MDR调节剂还是抗癌药物都拥有高载药 能力。 7.PTX-DSF Ns传递两种药物(Paclitaxel-Disulfiram)于pH5.4-7.4中。 8.A549/TAX细胞系中细胞摄取PTX-DSF Ns后8小时和12小时大约是2-14倍的差别， 相 比于细胞摄取PTX Ns不含DSF。 9.PTX-DSF Ns提高了A549/TAX细胞系的凋亡率， 降低最低抑制浓度和抗癌药剂量。 降 低量与毒性有关。 10.杂交纳。
5、米悬浮剂上调caspase-3和caspase-9蛋白的表达。 微管失稳是细胞分裂的 必要条件。 PTX是微管稳定药物， 因此， PTX DSF Ns可引起高速分裂的肿瘤细胞周期停止。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 108309963 A 2 一种用于多抗药性逆转的稳定杂交纳米悬浮剂 技术领域： 0001 本发明属于生物医学领域， 尤其是对于常规化疗产生抵抗性实体瘤耐药性领域。 制备过程使用含有PTX的DSF和无毒理作用的 -LG通过下调MDR-1基因从而杀伤肿瘤， 这种 咋加的纳米悬浮颗粒剂型主要可应用于产生耐药性的肿瘤。 背景技术： 0002 化疗是一种很重要的抗癌疗法， 但是。
6、单一疗法非常的不理想， 这主要是由于治疗 中的副作用、 极小的吸收量以及不断增长的对于化疗的耐药性。 联合化疗可以调控肿瘤细 胞的信号通路， 到达协同克服单一化疗弊端的作用。 然而这种混合治疗也拥有很多的不足， 比如联合药物不同的物理化学性质、 不同的药代动力特征、 多药物不同的体内分布以及不 同的细胞膜传递机制， 都导致了联合药物不能在靶目标位置达到最佳的释放浓度。 多药物 耐药性(MDR)的产生是影响癌症治疗的主要屏障。 因此， 逆转MDR是肿瘤细胞化学成败的核 心决定因素。 MDR 的提高主要是由MDR-1编码的P-糖蛋白过表达引起的。 P-糖蛋白， 一种膜 结合转运体属于 ATP-Bi。
7、nding Cassette(ABC)家族， 允许化疗药物从肿瘤细胞中流出。 0003 不溶性活性化合物的纳米悬浮液(Ns)是一种胶体分散体， 由纳米颗粒和少量稳定 剂组成。 对比其他纳米药物， 如脂质体、 聚合物胶束以及无机纳米运输载体， Ns拥有明显更 好的药物载量能力， 这主要是因为Ns中粒子含有100的药物。 此外， 还可以减少个体差异 性和食物效应， 改善了治疗效果， 降低副作用， 降低了对正常器官的毒性。 同时， Ns中由 -LG 包裹的粒子可以显著提高在血液循环中的半衰期。 0004 戒酒硫(DSF)1951年已被FDA证明是一种不溶性的药物， 可用于治疗酗酒， 同时拥 有逆转 。
8、MDR的潜力。 DSF通过与半胱氨酸相互作用抑制P-糖蛋白调节药物外流的能力， 从而 恢复化疗对癌症细胞的治疗作用。 0005 化疗药物PTX阻断了细胞分裂所需微管的动态不稳定性， 从而导致细胞凋亡和细 胞周期的快速分裂。 发明内容： 0006 本发明的目的是制备一利稳定的含有不溶于水的紫杉醇和戒酒硫的在肿瘤靶点 发挥作用的纳米悬浮剂型。 PTX和DSF按照固定的6 1W/W的比例溶于丙酮以形成双药有机 相。 -LG溶于水并在90-100下加热30-40分钟形成pH7-9的液相。 PTX-DSF Ns使用抗溶沉 淀法制备， 及在低于4-8的冰浴中将有机相混入液相。 之后PTX-DSF Ns立即。
9、被超声处理 15-30分钟。 0007 荧光素5(6)-isothiocyanate(FITC)标记的TX-DSF Ns(FITC-PTX-DSF Ns)or FITC-PTX Ns使用相似的方法制备， 除了FITC， DSF和PTX在使用前一同被溶于丙酮。 0008 PTX-DSF Ns剂型直径在纳米级(160-200nm)并带有负界达电位(-20-30mV)。 0009 液体及冷冻形式的PTX-DSF Ns以粉末形式经过电镜， 透射式电子显微镜， 及粉末 衍射分析(PXRD)。 说 明 书 1/3 页 3 CN 108309963 A 3 0010 本发明对于MDR调节器和抗癌药物都有很高。
10、的载药能力， 约为30-40的PTX和6- 8的 DSF。 0011 本发明可在肿瘤靶点释放DSF用于逆转MDR和提高A549细胞抵抗PTX耐药性的敏感 度。 本发明显著提高了A549/TAX细胞对于PTX的摄取， 相比较PTX敏感A549细胞， 通过改变核 苷酸结合区域内的半胱氨酸残基降低了DSF下调P-糖蛋白的表达， 这导致了摄取更高的细 胞毒性药物。 两种纳米粒， FITC-PTX Ns和FITC-PTX-DSF Ns， 分别于A549/TAX共培养12-24 个小时， 并用荧光素FITC孵育0.5-12小时， 其浓度固定为400-800ng/ml。 细胞最初摄取 FITC-PTX Ns。
11、的速度是与时间相关的， 随后出现了令人意外的衰减。 另一方面， FITC-PTX- DSF Ns随着时间的推移显著提高了荧光强度。 细胞摄取FITC-PTX-DSF Ns差不多是FITC- PTX Ns的2倍到14倍。 经过共聚焦检测， A549/TAX细胞显示出了细胞外围的绿色荧光， 相反 的FITC-PTX-DSF Ns处理过的细胞， 展现出明显的细胞内绿色和黄色荧光型号。 0012 本发现结果如下， (i)A549/TAX细胞过度表达P-糖蛋白， 因此排斥FITC-PTX Ns， 从 而在细胞外可见绿色荧光。 (ii)A549/TAX细胞中FITC-PTX-DSF的DSF成功的于P-糖蛋。
12、白相 互作用， 显著抑制了FITC-PTX-DSF流出， 并随着时间的推移逐渐在细胞内聚集。 0013 本发明展现了24和48小时后的剂量依赖性细胞毒性， 总体来说， 生存力随着PTX药 物浓度从0.1-100 g/ml的提高而降低。 与单药物相比较， 在A549细胞中， PTX-DSF和PTX-DSF Ns 提共了更多的毒性。 0014 本发明与PTX-DSF相比， 针对A549/TAX耐药株细胞拥有更好的细胞凋亡诱导能力， 这说明其在体外拥有更好的抗MDR相关癌症的能力。 IC50是基于计算自由PTX、 自由DSF、 PTX-DSF和PTX-DSF Ns中PTX浓度得到， 以确定PTX-D。
13、SF Ns于PTX-DSF比较的好处， 结果展示 与Table 1。 在A549细胞中， 与细胞毒素PTX比较， PTX-DSF在24小时培养之后， 降低了IC50值 大约2.3倍， 在48小时培养之后降低了2.6倍。 但是， PTX-DSF Ns在24小时和48小时培养之 后， IC50值大约降低了6倍。 换用A549/TAX细胞， 同理， 使用PTX-DSF 和PTX-DSF Ns培养24/48 小时之后则分别降低了2.2/2.4倍和6/8倍。 这证明了， 本发明可以很好地发挥两个药物的 联合作用， 提高了大约1.75-5倍的细胞凋亡率， 降低了2-7倍的IC50值， 以及通过降低MDR-。
14、1 的表达， 而降低了5.8-8.9倍的PTX剂量。 0015 本发明可诱导A549和A549/TAX细胞凋亡。 Annexin-V/FITC结果显示， 相比于单药 物， PTX-DSF和PTX-DSF Ns都可以显著诱导大量细胞凋亡。 然而， 两种剂型诱导细胞凋亡的 总比例却大致相似约77。 与此相反， PTX-DSF联合用药可以显著提高A549/TAX凋亡的比 例， PTX-DSF Ns诱导凋亡的比例约为80， PTX-DSF约为48。 在某种程度上， DSF单独作用 也可以诱导细胞系的凋亡。 0016 本发明可导致A549和A549/TAX细胞周期的停止， PTX通过降低G0/G1期细胞。
15、的比 例， 和提高 G2/M期细胞比例产生细胞毒素。 此外， DSF显著降低A549细胞在G0/G1期的细胞 比例， 提高G2/M期细胞比例。 与PTX相比， 联合剂型PTX-DSF和PTX-DSF Ns进一步提高了 A549G2/M期细胞比例。 联合PTX和DSF产生了大量的细胞毒素显著影响了A549细胞系， 尤其 是耐紫杉醇的癌症细胞。 因此， 本剂型可以降低G0/G1期细胞的比例， 使细胞周期停止。 与单 一PTX相比， 杂交纳米悬浮剂在A549细胞中， 显著上调caspase-3表达， caspase-9表达则被 PTX-DSF Ns上调。 相似的提高caspase-3表达也可以在经过。
16、PTX-DSF和PTX-DSF Ns 处理的 A549/TAX细胞中发现。 PTX-DSF Ns上调caspase-3和caspase-9表达程度比PTX-DSF 更大， 说 明 书 2/3 页 4 CN 108309963 A 4 说明PTX-DSF Ns有促进两种药物协同作用的效果。 0017 本发明显著下调了MDR-1的表达大约2.4倍。 因此， A549/TAX细胞中下调MDR-1进一 步改善了抑制效果。 附图说明： 0018 图1： -LG稳定的PTX-DSF Ns 0019 图2： 冻干粉末PTX-DSF Ns 0020 图3： PTX-DSF Ns粒子大小及粒子分散度 0021 。
17、图4： PTX-DSF Ns的界达电位 0022 图5： PTX-DSF Ns的SEM图 0023 图6： PTX-DSF Ns的TEM图 0024 图7： PTX-DSF Ns依据粒子大小和PDI在生理盐水， PBS pH 7.4 and PBS pH 7.4+ 10serum 中的物理稳定性 0025 图8： PTX-DSF Ns依据界达电位在生理盐水， PBS pH 7.4 and PBS pH 7.4+10 serum中的物理稳定性 0026 图9： PTX， DSF， -LG以及PTX， DSF和 -LG， PTX-DSF Ns混合物的PXRD分析结果 0027 图10： DSF从原。
18、始粒子和PTX-DSF Ns在pH 5.4or pH 7.4中的体外释放的结果 0028 图11： PTX从原始粒子和PTX-DSF Ns在pH 5.4or pH 7.4中的体外释放的结果 0029 图12： A549/TAX细胞经过FITC-PTX-DSF Ns和FITC-PTX Ns 12小时处的共聚焦检 测结果， FITC浓度固定为800ng/ml， 尺度为20 m。 0030 图13： 经过流式细胞仪检测的A549/TAX细胞吸收FITC-PTX-DSF Ns和FITC-PTX Ns 的情况。 0031 图14： A549细胞经过FITC-PTX-DSF Ns处理的共聚焦图片。 尺度为。
19、20 m 0032 图15： A549/TAX细胞经过FITC-PTX-DSF Ns处理的共聚焦图片。 尺度为20 m 0033 图16： A549和A549/TAX细胞的细胞凋亡检测 0034 图17： A549和A549/TAX细胞周期停滞。 0035 图18： A549细胞的Caspase-3和-9的活性。 0036 图19： A549/TAX细胞的Caspase-3和-9的活性。 0037 图20： A549/TAX细胞的MDR-1基因表达的RT-qPCR检测结果。 0038 图21： MDR-1基因表达的凝胶电泳结果。 说 明 书 3/3 页 5 CN 108309963 A 5 图。
20、1 图2 图3 说 明 书 附 图 1/11 页 6 CN 108309963 A 6 图4 图5 说 明 书 附 图 2/11 页 7 CN 108309963 A 7 图6 图7 说 明 书 附 图 3/11 页 8 CN 108309963 A 8 图8 说 明 书 附 图 4/11 页 9 CN 108309963 A 9 图9 说 明 书 附 图 5/11 页 10 CN 108309963 A 10 图10 图11 说 明 书 附 图 6/11 页 11 CN 108309963 A 11 图12 图13 说 明 书 附 图 7/11 页 12 CN 108309963 A 12 图14 图15 说 明 书 附 图 8/11 页 13 CN 108309963 A 13 图16 图17 说 明 书 附 图 9/11 页 14 CN 108309963 A 14 图18 图19 说 明 书 附 图 10/11 页 15 CN 108309963 A 15 图20 图21 说 明 书 附 图 11/11 页 16 CN 108309963 A 16 。