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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201610408919.3 (22)申请日 2016.06.08 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 106074488 A (43)申请公布日 2016.11.09 (73)专利权人 天津大学 地址 300072 天津市南开区卫津路92号 (72)发明人 魏静 孙剑 傅学钢 郝霞飞 (74)专利代理机构 天津市北洋有限责任专利代 理事务所 12201 代理人 陆艺 (51)Int.Cl. A61K 31/27(2006.01) A61P 37/00(2006.01。
2、) A61P 19/02(2006.01) A61P 29/00(2006.01) (56)对比文件 WO 2004113363 A2,2004.12.29, CN 101969920 A,2011.02.09, Jian Sun et alBAFF-targeting therapy, a promising strategy for treating autoimmune diseases. European Journal of Pharmacology .2008,第597卷1-5. Xavier Mariette.The B cell: a new therapeutic targe。
3、t in rheumatoid arthritis and other autoimmune diseases. Joint Bone Spine .2004,第71卷357-360. 审查员 王芳菲 (54)发明名称 苯甲氧羰基-L-谷氨酸在制备BLyS拮抗剂的 用途 (57)摘要 本发明公开了苯甲氧羰基-L-谷氨酸在制备 BLyS拮抗剂的用途， 竞争ELISA实验结果表明： 苯 甲氧羰基-L-谷氨酸能够抑制BLyS与TACI-Fc的 结合。 抑制作用与苯甲氧羰基-L-谷氨酸的浓度 呈正相关。 苯甲氧羰基-L-谷氨酸能够抑制BLyS 与BCMA-Fc的结合； 抑制作用与苯甲氧羰基-L-谷 氨。
4、酸的浓度呈正相关。 苯甲氧羰基-L-谷氨酸可 以作为潜在的BLyS小分子拮抗剂。 权利要求书1页 说明书4页 附图4页 CN 106074488 B 2018.07.27 CN 106074488 B 1.苯甲氧羰基-L-谷氨酸在制备B淋巴细胞刺激因子(BLyS)拮抗剂的用途。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 106074488 B 2 苯甲氧羰基-L-谷氨酸在制备BLyS拮抗剂的用途 技术领域 0001 本发明属于生物医药领域， 涉及苯甲氧羰基-L-谷氨酸作为BLyS拮抗剂的用途。 背景技术 0002 B淋巴细胞刺激因子(B lymphocyte stimulator,BLyS)，。
5、 又称为B细胞激活因子(B cell activating factor belonging to the TNF family,BAFF)， 是TNF家族中的一员。 由 单核细胞和巨噬细胞持续合成、 分泌。 BLyS能够结合B细胞表面的三种受体， B细胞成熟抗原 (B cell mature antigen,BCMA)， 跨膜激活物和CAML结合物(Transmembrane activator and CAML-interactor,TACI)以及BAFF受体3(BR3)。 受体结合BAFF后， 减少成熟B细胞的凋 亡。 如果敲除BAFF， 小鼠体内的成熟B细胞完全缺失。 由于BLyS在B。
6、淋巴细胞活化、 增殖中发 挥重要作用， 而B淋巴细胞产生的抗体所介导的体液免疫在众多已发现的自身免疫性疾病 当中处于中心地位。 目前认为BLyS在体内的过量表达与某些自身免疫性疾病如系统性红斑 狼疮(SLE)、 类风湿性关节炎(RA)等病程的发生、 发展密切相关。 因此， 以阻断BLyS生物学功 能为策略， 探讨BLyS抑制拮抗剂治疗系统性红斑狼疮和类风湿性关节炎等自身免疫性疾病 和B细胞肿瘤疾病的研究正在国外如火如荼的进行中。 目前， 针对BLyS的抑制剂的研究主要 集中在研制具有中和BLyS作用的BLyS诱饵受体(decoy receptor)、 抗BLyS抗体和拮抗肽 1-3。 2011。
7、年3月美国FDA批准由人类基因科学公司(Human Genome Sciences)和葛兰士- 史克(GlaxoSmithKline)公司联合研发的抗BLyS抗体BENLYSTA(Belimumab)治疗系统性红 斑狼疮。 这是50年来， FDA首次批准治疗该类疾病的药物。 但是蛋白抑制剂作为治疗药物具 有一定的局限性， 例如来源较少和分离纯化难度大以及药物稳定性较差， 另外还存在口服 的生物利用度较低， 主要是因为体内各种酶对多肽类药物的降解性高， 从而会导致这一类 药物的作用半衰期大大缩短。 因此， 开发小分子化合物作为BLyS抑制剂的研究具有重要的 现实意义。 目前， 尚未有苯甲氧羰基-。
8、L-谷氨酸在制备BLyS拮抗剂的用途的报道。 0003 1.Jian Sun*(孙剑) ,Zhou Lin,Jiannan Feng,Yan Li,Beifen Shen.(2008) BAFF-targeting therapy ,a promising strategy for treating autoimmune diseases.Eur J Pharmacol 597:15. 0004 2.Yacong Zhao,Xiafei Hao,Jiannan Feng,Beifen Shen,Jing Wei*(魏静), Jian Sun*(孙剑)(2015) ,The comparison。
9、 of BLyS-binding peptides from phage display library and computer-aided design on BLySTACI interaction.Int Immunopharmacol,24:219223. 0005 3.Xiafei Hao,Yanfeng Zhu,Chang Zheng,Xuegang Fu,Jiannan Feng,Beifen Shen,Jing Wei*(魏静),Jian Sun*(孙剑).A comparison of biological activity of B lymphocyte stimulat。
10、or(BLyS)antagonist peptibodies and the elucidation of possible BLyS binding sites.Protein&Peptide Letters,2016,23,17-23 0006 4.Xuegang Fu,Liyan Xuan,Yuzhe Wang,Jing Wei*(魏静),Jian Sun*(孙剑) .Molecular mechanism of the affinity interactions between BAFF and its 说 明 书 1/4 页 3 CN 106074488 B 3 peptides b。
11、y molecular simulations.Protein&Peptide Letters,2015,22,992-999. 发明内容 0007 本发明的目的是克服现有技术的不足， 提供苯甲氧羰基-L-谷氨酸在制备BLyS拮 抗剂的用途。 0008 本发明的技术方案概述如下： 0009 苯甲氧羰基-L-谷氨酸在制备BLyS拮抗剂的用途 0010 苯甲氧羰基-L-谷氨酸下面简称为CBz-L-谷氨酸。 0011 本发明的优点： 0012 1.对于BLyS结合TACI具有显著抑制作用 0013 竞争ELISA实验结果表明： CBz-L-谷氨酸浓度在1mg/mL时能够抑制1.263.79 BLyS。
12、与TACI-Fc的结合； 在3mg/mL时能够抑制59.3511.87BLyS与TACI-Fc的结合； 在 5mg/mL时能够抑制74.136.78BLyS与TACI-Fc的结合。 抑制作用与CBz-L-谷氨酸的浓度 呈正相关。 0014 非结合BAFF的小分子化合物(苯甲酸)， 即阴性对照， 对BLyS与TACI的相互作用没 有明显抑制作用、 且没有剂量依赖关系。 证明CBz-L-谷氨酸的抑制作用是特异和有效的。 0015 2.对于BLyS结合BCMA具有显著抑制作用 0016 竞争ELISA实验结果表明： CBz-L-谷氨酸浓度在1mg/mL时能够抑制5.630.88 BLyS与BCMA-。
13、Fc的结合； 在3mg/mL时能够抑制56.707.90BLyS与BCMA-Fc的结合； 在5mg/ mL时能够抑制82.803.98BLyS与BCMA-Fc的结合。 抑制作用与CBz-L-谷氨酸的浓度呈正 相关。 0017 阴性对照化合物(苯甲酸)对BLyS与BCMA的相互作用没有明显抑制作用、 且没有剂 量依赖关系。 证明CBz-L-谷氨酸的抑制作用是特异和有效的。 附图说明 0018 图1为BLyS结合受体的关键残基， +表示关键残基。 0019 图2为BLyS结合口袋的分子表面和关键残基， D1表示保守性结合区域， D2表示特异 性结合区域。 0020 图3为虚拟筛选流程图。 0021。
14、 图4为CBz-L-谷氨酸(苯甲氧羰基-L-谷氨酸)结构式。 0022 图5为CBz-L-谷氨酸与BLyS的相互作用的模式。 0023 图6为CBz-L-谷氨酸抑制TACI对BLyS的结合作用。 *代表p0.01； *代表0.01p 0.05。 0024 图7为CBz-L-谷氨酸抑制BCMA对BLyS的结合作用。 *代表p0.01。 具体实施方式 0025 下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。 众多研究已经详细阐述BLyS与受 体相互作用的可能模式及关键氨基酸。 我们在前期工作中通过分子动力学模拟， 基于BLyS 和其受体BCMA的晶体结构， 通过计算机模拟BLyS与其三个天然受体的相互。
15、作用模式， 探究 说 明 书 2/4 页 4 CN 106074488 B 4 其参与保守性结合作用和亲和力选择性的关键残基。 在此基础上， 利用 “锁钥原理” ， 针对关 键结合区域进行商业化化学小分子数据库进行分子虚拟筛选， 预测得到一系列具有潜在抑 制作用的小分子化合物， 获得其实体并进行体外活性测定发现， 二元酸类化合物二苯甲酰 酒石酸具有一定的抑制BLyS结合TACI和BCMA的作用。 为开发有临床应用前景的新药先导药 物奠定了实验研究基础。 0026 下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。 本发明的实施例是为了使本领域 的技术人员能够实施， 但并不对本发明作任何限制。 其中的常。
16、用试剂的公开了是为了使本 领域的技术人员更好的实施本发明， 但并不对本发明作任何限制。 0027 BLyS蛋白： 孙剑,黎燕,冯建男,孙瑛勋,胡美茹,沈倍奋,.人可溶性B淋巴细胞刺激 因子基因的克隆及在大肠杆菌中的表达J.细胞与分子免疫学杂志,2006,(2)SEQ ID NO.8所示。 0028 TACI-Fc蛋白： 冀丽军,白乌仁图雅,柴琳,孙剑,.TACI-Fc融合蛋白的基因构建、 原 核表达及生物活性鉴定J.生物技术,2013,(3).SEQ ID NO.9所示 0029 BCMA-Fc蛋白： 孙剑,冯建男,林周， 黎燕,沈倍奋.计算机辅助设计可溶性BLyS受 体,eBCMA-Fc融合。
17、蛋白及其在大肠杆菌中的表达.中国生物化学与分子生物学报,2008,24 (2)SEQ ID NO.9所示。 0030 Fc蛋白： 吴真.BCMA-Fc作为潜在药物的研究D.天津大学,2012SEQ ID NO.10所 示。 0031 包被液： 称量出33.6g碳酸氢钠和63.6g无水碳酸钠,将其放入烧杯中， 向内加入 600ml蒸馏水， 搅拌至溶质全部溶解， 再加入蒸馏水中定容到1L。 将其放在4下保存。 0032 PBST的配制： 取250 l吐温-20加入500ml的1PBS中， 混合均匀至完全融合。 在室 温下保存。 0033 5脱脂奶粉的配制： 称取脱脂奶粉1g， 搅拌下溶解于10ml。
18、 0.01M PBS中， 加PBS定 容至20ml， 于4保存 0034 TMB显色液： 取4.95ml底物缓冲液， 0.05ml 1TMB储液， 临用前加入5 l 30过氧 化氢。 0035 1TMB储液： 称取1g TMB， 搅拌下充分溶解于80ml DMSO中， 加DMSO定容至100ml， 保存于4。 0036 底物缓冲液(pH 5.0)： 取24.3ml 0.1M柠檬酸， 25.7ml 0.2M磷酸氢二钠， 加入约 40ml水， 调pH至5.0， 再加水定容至100ml， 保存于室温。 TMB工作液(现配现用)。 0037 实施例1： 用计算机模拟筛选技术， 筛选出BLyS相关小分子。
19、化合物。 0038 蛋白结构信息获取： 从Protein Date Bank蛋白质数据库(http:/www.rcsb.org/ pdb)中下载BLyS蛋白结构(PDB ID： 1OQD和1OQE)。 采用分子动力学等计算方法， 从分子水平 上探 究BLyS与其天然受体(BCMA， TACI， BR3)的相互作用机制。 根据每个氨基酸残基对结合 能贡献大小， 确定其关键残基。 图1和图2分别显示了BLyS靶点天然受体的关键作用残基， 以 及BLyS靶点的结合口袋和关键残基的相关信息。 0039 小分子数据库的获得： 小分子数据库含有近万个结构不同的化合物， 其主要来源 于两个途径： 天然产物数。
20、据库或商用小分子数据库中的小分子， 课题组合成得到的系列化 合物。 商用小分子数据库主要指百灵威(J&K)、 阿法埃莎(Alfa-Aesar)、 西格玛奥德里奇 说 明 书 3/4 页 5 CN 106074488 B 5 (Sigma-Aldrich)三家试剂公司网站得到。 对三维小分子结构进行加氢、 加电荷处理后， 将 文件保存成pdbqt文件格式， 进行进一步的分子对接研究。 0040 虚拟筛选： 借助AutoDock 4.2软件， 将数据库中所有小分子与BLyS活性中心区域 进行筛选对接计算。 分子对接过程中， 将三维小分子结构数据逐一放在BLyS的活性位点处， 通过不断优化小分子模型。
21、的位置、 构象、 分子内部可旋转键的二面角， 寻找化合物与BLyS作 用的最佳构象， 并预测其结合模式。 分析对接结果， 根据给出的小分子预测结合分值， 考察 化合物与BLyS结合中心的匹配度， 以及与关键氨基酸相互关系情况， 筛选出潜在具有BLyS 亲和力的小分子候选化合物。 分值越大， 代表化合物与BLyS的亲和力越高， 即化合物可能有 较好的亲和力。 选择综合评价最佳的化合物， 获得化合物实体， 并进行ELISA实验。 图3中描 述了虚拟筛选的流程图。 0041 实施例2： 计算机分析小分子拮抗剂和BLyS结合模式。 0042 利用计算机分子对接方法， 结合Chimera软件探讨了CBz。
22、-L-谷氨酸(结构参见图4) 与BLyS分子机制研究， 分析其与BLyS相互识别的关键氨基酸残基以及关键相互作用(图5)。 发现CBz-L-谷氨酸的一个苯环插入到BLyS的保守性疏水口袋， 与His69， Leu70和Ile92形成 疏水相互作用， 并与Arg124和Arg90残基侧链形成 -cation作用， 共同加强CBz-L-谷氨酸与 BLyS的结合作用； 两个侧链上的羧基与Arg90形成盐桥； 苄氧羰基上的氧以及氨基酸羧基中 的羰基氧与BLyS的关键残基Arg124形成氢键相互作用， 氨基酸羧基中的OH与Y65形成氢键。 0043 实施例3： 竞争ELISA分析化合物对于BLyS结合T。
23、ACI/BCMA蛋白的抑制作用。 0044 如果化合物CBz-L-谷氨酸可以与TACI/BCMA竞争结合BLyS活性口袋， 则加入的化 合物CBz-L-谷氨酸会抑制BLyS结合TACI/BCMA； 相反， 如果化合物CBz-L-谷氨酸不结合 BLyS， 也就不存在与TACI/BCMA竞争。 则加入化合物CBz-L-谷氨酸对BLyS结合TACI/BCMA没 有影响。 因此， 通过竞争抑制ELISA实验， 来测试小分子CBz-L-谷氨酸阻断BLyS与受体TACI 和BCMA结合的作用。 0045 首先， 按常规ELISA方法做BLyS与TACI-Fc/BCMA-Fc结合的ELISA。 确定竞争抑制。
24、 ELISA实验中使用TACI-Fc/BCMA-Fc的浓度。 最终确定浓度是10 g/mL。 竞争抑制ELISA的具 体操作步骤如下： 0046 a)包被： 20g/mL的BLyS与包被液按1:1稀释， 制备10 g/mL的BLyS液。 将稀释的 BLyS液按50微升/孔包被96孔板。 4过夜。 0047 b)洗板后， 用5的脱脂奶粉室温封闭2小时。 0048 c)洗板， 再将10g/mL的TACI-Fc或BCMA-Fc与不同体积的CBz-L-谷氨酸水溶液混 合， 制备小分子化合物CBz-L-谷氨酸终浓度梯度为0、 1、 3和5mg/mL的混合溶液， 每孔加入50 微升。 37， 温育1小时。。
25、 未加小分子溶液的混合溶液作为空白对照组。 苯甲酸为阴性对照化 合物。 0049 d)洗板， 加入HRP标记羊抗人2抗(按说明书稀释)。 0050 e)洗板后加入TMB显色剂显色。 0051 f)终止反应， 测450纳米的OD值。 化合物竞争BLyS与TACI-Fc/BCMS-Fc的相互作用 的抑制效果用下述公式计算： 抑制率(空白对照组OD450-实验组OD450)/空白对照组 OD450*100 (抑制率见图6和图7) 。 说 明 书 4/4 页 6 CN 106074488 B 6 图1 图2 说 明 书 附 图 1/4 页 7 CN 106074488 B 7 图3 图4 说 明 书 附 图 2/4 页 8 CN 106074488 B 8 图5 图6 说 明 书 附 图 3/4 页 9 CN 106074488 B 9 图7 说 明 书 附 图 4/4 页 10 CN 106074488 B 10 。