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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810192046.6 (22)申请日 2018.03.08 (71)申请人 吉林大学 地址 130000 吉林省长春市前进大街2699 号 (72)发明人 李婉南 杨茂义 赵国安 宋海淼 葛振龙 康明 刘小波 高波 韩露 (74)专利代理机构 北京快易权知识产权代理有 限公司 11660 代理人 陈伊雯 (51)Int.Cl. A61K 36/28(2006.01) A61K 38/01(2006.01) A61P 1/16(2006.01) A61K 133/00(20。
2、06.01) (54)发明名称 葵花盘粉及其有效成分在制备修复受损肝 细胞药物中的应用 (57)摘要 本发明公开了一种葵花盘粉及其有效成分 在制备修复受损肝细胞药物中的应用。 本发明的 葵花盘粉及其有效成分对由高尿酸血症引起的 受损肝细胞具有良好的抗炎和修复作用。 权利要求书1页 说明书4页 附图3页 CN 108354956 A 2018.08.03 CN 108354956 A 1.葵花盘粉及其有效成分在制备修复受损肝细胞药物中的应用。 2.如权利要求1所述的应用， 其特征在于， 所述受损肝细胞由高尿酸血症引起。 3.如权利要求1所述的应用， 其特征在于， 所述葵花盘粉有效成分通过以下方法。
3、制备得 到： 1)将葵花盘粉碎至100-200目， 加入6-10倍质量的去离子水， 充分搅拌， 用氢氧化钠调 节pH值为8-9， 在45-50搅拌120-240分钟， 得到葵花盘分离蛋白液； 2)将葵花盘分离蛋白液加热至85-90， 搅拌1-3h， 冷却至45-55， 加入占葵花盘分离 蛋白液总体积0.1-0.3的复合蛋白酶， 酶解3-5h， 反应终止时， 5分钟内升温至85-90， 保持5-10分钟， 使复合蛋白酶失去活性， 所得酶解液备用； 3)将步骤2)的酶解液在5000转/分钟的转速下离心8-12分钟， 收集上清液， 得葵花蛋白 小分子肽粗液； 4)将步骤3)的葵花蛋白小分子肽粗液经截。
4、流分子量为5000-20000的中空纤维膜超滤， 除去大分子蛋白， 得到葵花盘小分子肽液； 5)将步骤4)的葵花盘小分子肽液浓缩， 使其体积浓缩至原来的四分之一到二分之一， 喷雾干燥， 即得。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 108354956 A 2 葵花盘粉及其有效成分在制备修复受损肝细胞药物中的应用 技术领域 0001 本发明涉及药物技术领域， 特别涉及一种葵花盘粉及其有效成分在制备修复受损 肝细胞药物中的应用。 背景技术 0002 高尿酸血症目前国内外发病人数呈上升趋势， 其发病机制上以尿酸生成增多和肾 脏尿酸排泄减少为主， 且该疾病用药常常对肾脏肝脏造成损伤以及加重肝肾负担。
5、。 0003 向日葵花盘为菊科植物向日葵(Helianthus annuuss L.)的花盘， 亦称向日葵花 托、 向日葵饼和葵房， 其性平、 味甘淡、 无毒、 归肝经， 主要功能有清热平肝、 止痛、 止血， 用于 治疗关节炎、 乳腺炎、 头晕、 耳鸣、 脘腹痛等。 向日葵盘水煎液具有治疗肿瘤作用， 向日葵花 盘乙醇提取物有一定的降压作用， 民间也用其作为调治萎缩性胃炎药膳。 我国是向日葵的 种植大国， 葵花盘的资源丰富。 但是， 在传统应用中， 通常是将除葵花子后葵花盘作为牲畜 饲料喂养牲畜或作为烧材取暖做饭， 没有发挥出其更大的经济效益和医疗作用， 造成资源 浪费。 发明内容 0004 为。
6、了解决现有技术的问题， 本发明实施例提供了一种葵花盘粉及其有效成分在制 备修复受损肝细胞药物中的应用。 所述技术方案如下： 0005 一方面， 一种葵花盘粉及其有效成分在制备修复受损肝细胞药物中的应用。 0006 进一步的， 所述受损肝细胞由高尿酸血症引起。 0007 进一步的， 所述葵花盘粉有效成分通过以下方法制备得到： 0008 1)将葵花盘粉碎至100-200目， 加入6-10倍质量的去离子水， 充分搅拌， 用氢氧化 钠调节pH值为8-9， 在45-50搅拌120-240分钟， 得到葵花盘分离蛋白液； 0009 2)将葵花盘分离蛋白液加热至85-90， 搅拌1-3h， 冷却至45-55，。
7、 加入占葵花盘 分离蛋白液总体积0.1-0.3的复合蛋白酶， 酶解3-5h， 反应终止时， 5分钟内升温至85- 90， 保持5-10分钟， 使复合蛋白酶失去活性， 所得酶解液备用； 0010 3)将步骤2)的酶解液在5000转/分钟的转速下离心8-12分钟， 收集上清液， 得葵花 蛋白小分子肽粗液； 0011 4)将步骤3)的葵花蛋白小分子肽粗液经截流分子量为5000-20000的中空纤维膜 超滤， 除去大分子蛋白， 得到葵花盘小分子肽液； 0012 5)将步骤4)的葵花盘小分子肽液浓缩， 使其体积浓缩至原来的四分之一到二分之 一， 喷雾干燥， 即得。 0013 本发明实施例提供的技术方案带。
8、来的有益效果是： 本发明的葵花盘粉及其有效成 分对由高尿酸血症引起的受损肝细胞具有良好的抗炎和修复作用。 附图说明 说 明 书 1/4 页 3 CN 108354956 A 3 0014 为了更清楚地说明本发明施例中的技术方案， 下面将对实施例描述中所需要使用 的附图作简单地介绍。 0015 图1是本发明实施例2中空白组肝脏细胞图； 0016 图2是本发明实施例2中模型组肝脏细胞图； 0017 图3是本发明实施例2中葵花盘粉有效成分组肝脏细胞图； 0018 图4是本发明实施例2中生物碱组肝脏细胞图； 0019 图5是本发明实施例2中总黄酮组肝脏细胞图； 0020 图6是本发明实施例2中多糖组肝。
9、脏细胞图； 0021 图7是本发明实施例2中葵花盘粉组肝脏细胞图； 0022 图8是本发明实施例2中别嘌呤组肝脏细胞图。 具体实施方式 0023 为使本发明的目的、 技术方案和优点更加清楚， 下面将结合附图对本发明实施方 式作进一步地详细描述。 0024 实施例1葵花盘粉及其有效成分的制备 0025 1)将葵花盘5kg粉碎至100目， 加入30kg的去离子水， 充分搅拌， 用氢氧化钠调节pH 值为8， 在45搅拌120分钟， 得到葵花盘分离蛋白液。 0026 2)将葵花盘分离蛋白液加热至85， 搅拌1h， 冷却至45， 加入占葵花盘分离蛋白 液总体积0.1的复合蛋白酶(生姜蛋白酶、 蜗牛蛋白酶。
10、、 蝙蝠蛾幼虫蛋白消化酶按1:0.5:1 的质量比例混合)， 酶解3h， 反应终止时， 5分钟内升温至85， 保持5分钟， 使复合蛋白酶失 去活性， 所得酶解液备用。 0027 3)将步骤2)的酶解液在5000转/分钟的转速下离心8分钟， 收集上清液， 得葵花蛋 白小分子肽粗液。 0028 4)将步骤3)的葵花蛋白小分子肽粗液经截流分子量为5000的中空纤维膜超滤， 除 去大分子蛋白， 得到葵花盘小分子肽液。 0029 5)将步骤4)的葵花盘小分子肽液浓缩， 使其体积浓缩至原来的四分之一到， 喷雾 干燥， 即得葵花盘粉有效成分。 0030 蝙蝠蛾幼虫蛋白消化酶的制备方法包括如下步骤： 将蝙蝠蛾。
11、幼虫去头并剔除虫皮 和脂肪， 取消化道整体， 加入10倍质量的磷酸缓冲液， 匀浆， 在4下组织浆液， 然后以 3000rpm/min的速度离心， 取上清液加热到40并迅速冷却至5， 过滤除去脂肪， 透析除 盐， 冷冻干燥， 即得。 0031 实施例2葵花盘粉及其有效成分降尿酸修复受损肝脏细胞试验 0032 (1)材料 0033 小分子肽： 实施例1制备的葵花盘粉有效成分。 0034 酵母膏： 英国Oxiod公司。 0035 氧嗪酸钾盐： 美国Sigma公司， 批号： 101310713。 0036 别嘌醇片： 世贸天阶制药(江苏)有限责任公司， 批号： 201608301。 0037 小鼠尿酸。
12、检测试剂盒： 南京建成生物工程研究所。 0038 SPF级KM小鼠： 雄性， 体质量(2225)g， 由吉林大学第一医院实验动物中心提供。 说 明 书 2/4 页 4 CN 108354956 A 4 0039 (2)造模给药 0040 研究进行前对小鼠进行称重， 其中12只作为空白对照组， 其余小鼠为高尿酸血症 模型造模组。 实验期间每日早间称重。 本次造模实验采取酵母膏灌胃的方法， 通过给予大量 嘌呤物质使其尿酸值增高， 嘌呤代谢紊乱， 从而达到短时间内暂时性升高血尿酸值的效果， 随后分组给药并达到对肝组织造成不同程度的损伤的效果。 将100只小鼠随机分为8组， 每 组约12只， 分别为空。
13、白组、 模型组、 葵花盘粉有效成分组、 多糖组、 生物碱组、 总黄酮组、 葵花 盘粉组和别嘌醇组。 造模期间， 除空白组(等体积水灌胃)外， 其他各组每天按20g/kg酵母膏 进行灌胃， 1次/d， 连续灌胃7天， 第7日夜间断食， 次日清晨取血测血UA值， 测血尿酸值结果 表明血尿酸值升高随即可以进行给药。 第9天开始， 空白组每日等体积水灌胃， 根据血尿酸 值测试结果随机选取12只作为模型组， 余下均分为6组给药， 上午持续酵母膏灌胃， 给药组 下午灌胃给药， 连续给药7天， 7日后晚间断食， 次日脱颈处死并取肝脏进行免疫组织化学分 析。 使用含有酵母膏的高嘌呤饮食进行灌胃， 可导致小鼠出。
14、现短暂的高尿酸血症现象， 并可 持续15-20天。 0041 (3)免疫组化免疫组化实验检验药物对肝脏影响 0042 组织浸入石蜡后， 包埋前将组织移入包埋用石蜡杯内。 从恒温箱取出置于三角 架上， 其下点燃酒精灯， 以保持石蜡的溶解状态。 0043 准备好包埋框， 将包埋用的镊子在酒精灯上加温(防止镊子粘蜡)后， 左手持蜡 杯， 右手把加温的镊子放在蜡口(直立状)倒蜡时让石蜡沿镊子注入包埋框内。 0044 迅速镊取组织块放入包埋框石蜡内， 切面朝下放正置入框底并轻轻压平， 以保 证不再有气泡。 0045 待石蜡表面凝固前将标签贴于其上， 需注意勿使标签与标本混淆， 当蜡块冷至 蜡面有一层透明。
15、蜡膜时， 浸入冷水中迅速使其冷却， 否则蜡内常形成结晶。 0046 蜡块完全硬固后除去铜框， 以保证蜡彻底凝固， 立即修切。 0047 取出切片， 采用免疫组化试剂盒染色， 显微镜观察检验切片组织细胞状态并拍 照。 0048 实验结果见图1-8， 空白组(图1)中肝小叶内肝细胞及肝细胞索清晰， 肝细胞胞质 饱满。 模型组(图2)部分肝小叶内肝细胞及肝细胞索不清晰， 肝细胞萎缩可见点状坏死灶及 肝细胞嗜酸性变。 生物碱组、 总黄酮组及多糖组(图4-6)偶见点状坏死灶及嗜酸性变。 葵花 盘粉组(图7)及葵花盘粉有效成分组(图3)肝小叶内肝细胞及肝细胞索清晰， 肝细胞胞质饱 满， 偶见点状坏死灶。 。
16、对肝细胞具有很好的修复作用。 别嘌醇组(图8)部分肝小叶内肝细胞 及肝细胞索不清晰， 肝细胞萎缩多见散在炎细胞浸润灶、 点状坏死灶及偶见中央静脉周围 的肝细胞空化淡染， 别嘌醇组对肝细胞具有较大伤害。 显微结构提示葵花盘粉及其有效成 分对受损的肝细胞具有一定的抗炎和修复作用， 其中效果最好的也是葵花盘粉有效成分 组。 0049 本发明葵花盘粉及其有效成分在制备修复受损肝细胞药物中的应用， 葵花盘粉及 其有效成分可以起到抗炎， 消肿， 止痛及降低血尿酸， 溶解尿酸钠的作用， 同时对肝脏受损 细胞有良好的修复效果， 对高尿酸症标本兼治， 从根本治疗高尿酸症。 0050 上述本发明实施例序号仅仅为了描述， 不代表实施例的优劣。 0051 以上所述仅为本发明的较佳实施例， 并不用以限制本发明， 凡在本发明的精神和 说 明 书 3/4 页 5 CN 108354956 A 5 原则之内， 所作的任何修改、 等同替换、 改进等， 均应包含在本发明的保护范围之内。 说 明 书 4/4 页 6 CN 108354956 A 6 图1 图2 图3 说 明 书 附 图 1/3 页 7 CN 108354956 A 7 图4 图5 图6 说 明 书 附 图 2/3 页 8 CN 108354956 A 8 图7 图8 说 明 书 附 图 3/3 页 9 CN 108354956 A 9 。