技术领域
本发明涉及超声影像领域，具体涉及HA介导CPPs修饰的载10-HCPT相变脂质纳米粒的制备方法及其应用。
背景技术
肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是发病率第五位、死亡率第三位的恶性肿瘤，极大的危害着患者的身心健康。目前HCC最佳的治疗方法仍为根治性手术切除，但大多数HCC患者确诊时已达晚期或存在远处转移，治疗棘手，预后很差。由于原发性肝癌对现有的全身化疗药物敏感性较差，其化疗效果不佳。因此，急需探索治疗原发性肝癌的新靶点、新措施和开发新药物。
超声微泡作为超声造影剂已广泛应用于临床疾病的诊断，尤其在肝脏疾病的诊断和鉴别诊断中发挥重要作用，另外，它作为一种携带抗肿瘤药物或基因的工具用于疾病的治疗也广泛应用于实验研究，但超声微泡因其粒径大，不能穿过肿瘤组织内部血管内皮间隙(380～780nm)，难以实现血管外肿瘤组织的显像和治疗。为了解决这个难题，脂质纳米粒以纳米级粒径能穿透肿瘤组织血管内皮间隙到达肿瘤组织，同时也可作为抗肿瘤药物载体将化疗药物运输到肿瘤部位进行抗癌治疗，但常规脂质纳米粒以聚集形式增强背向散射显影，其显像效果不及超声微泡。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种能特异性主动靶向并进入深部肝癌组织，在体外LIFU的辐照下能发生液-气相转变，可同时起到实时显像和定位释放抗肿瘤药物的HA介导CPPs修饰的载10-HCPT相变脂质纳米粒的制备方法。
为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：HA介导CPPs修饰的载10-HCPT相变脂质纳米粒，包括磷脂壳膜,磷脂壳膜上载有抗肿瘤药物10-HCPT，磷脂壳膜上修饰有DC-胆固醇、两侧连有半胱氨酸的穿膜肽，磷脂壳膜外层吸附有透明质酸。
进一步，所述的磷脂壳膜内部包裹有全氟戊烷。
进一步，其粒径为(284.2±13.3)nm，粒径多分散指数PDI为0.149。
进一步，其ZETA电位为-(16.55±1.50)mV。
进一步，其载抗肿瘤药物量为(5.23±0.34)％，包封率为(48.10±3.13)％。
采用本发明的HA介导CPPs修饰的载10-HCPT相变脂质纳米粒，简称HA/CPPs-10-HCPT-NPs，该纳米粒在光镜、激光共聚焦显微镜和透射电镜下观察呈大小均匀的颗粒状，分散性好，无明显成团聚集现象，粒径为表面zeta电位为-(16.55±1.50)mV，表面电荷为负电荷，使其在体内血液循环中不易受血液中的蛋白攻击，延长了体内循环时间，同时粒径大小为(284.2±13.3)nm，具备穿透血管内皮间隙(380～780nm)的能力，能到达血管外组织细胞，具备让血池外组织细胞成像的潜力。通过高效液相色谱仪检测HA/CPPs-10-HCPT-NPs中10-HCPT的载药量和包封率分别为(5.23±0.34)％and(48.10±3.13)％。
本发明制备纳米粒的壳材磷脂与生物体细胞膜磷脂成分相同；同时选用的全氟戊烷(PFP)具备良好的携氧能力，可作为血液替代品；透明质酸是一种天然的高分子酸性粘多糖，具有生物相容性、生无可降解性、无免疫源性以及对肿瘤细胞的高亲和性等特点，已在药物输送和组织工程等领域得到广泛的应用。因此本发明制备纳米粒的所用材料生物安全性均较高。PFP的沸点为29℃，在常温条件下呈液态，当在生理温度(37℃)条件下可相变呈气态，研究表明，当PFP被脂质包裹形成纳米粒后其液气相变温度阈值会明显升高，这是因为施加在纳米粒周围的Laplace压力较前增加了，从HA/CPPs-10-HCPT-NPs热致相变实验结果，可以看到加热板温度升至43℃时尚没能使其相变，当升至45℃时，开始有气泡形成，表明HA/CPPs-10-HCPT-NPs相变温度为45℃左右，温度升至47℃时，形成的气泡数量最多，随着加热板温度的继续升高，纳米粒体积增大至一定程度后会发生爆破。
超声是触发液态氟碳相变的最有效因素之一。本发明也对HA/CPPs-10-HCPT-NPs进行了声致相变(ADV)条件探索，我们从实验结果看到新研制的HA/CPPs-10-HCPT-NPs在2.4W/cm23min时B-mode和CEUS显示超声声像图回声信号最强，DFY定量分析软件结果也提示在2.4W/cm23min时回声强度值最高，因此HA/CPPs-10-HCPT-NPs最佳ADV条件为2.4W/cm23min，之所以在2.8W/cm2 3min时的超声回声强度较2.4W/cm2 3min时弱，考虑原因可能是在2.8W/cm2 3min时足以让纳米粒发生破裂，导致回声强度明显下降。
综上所述，本发明的纳米级超声分子探针HA/CPPs-10-HCPT-NPs具备粒径小、良好载药能力、ADV等优秀性能，具备良好的靶向穿膜能力，将HA/CPPs-10-HCPT-NPs联合LIFU辐照物理化学协同作用起到很好的杀伤肝癌细胞的效果。
本发明还提供另一个技术方案，HA介导CPPs修饰的载10-HCPT相变脂质纳米粒的制备方法，采用薄膜分散法和超声乳化法。
进一步，薄膜分散法的操作为
A.DSPE-CG-TAT-GC的合成
其操作步骤如下：
1)DSPE-PEG-NHS的合成
(a)称取磷脂-聚乙二醇-羧基溶于二氯甲烷，按1:3:2.5摩尔比加入N-羟基琥珀酰亚胺、二环己基碳二亚胺，在37.5℃搅拌反应12小时；
(b)反应完成后过滤，用无水乙醚进行洗涤后过滤，复溶后反向层析纯化，真空干燥，得到DSPE-PEG-NHS；
2)DSPE-CG-TAT-GC的合成
(a)分别将DSPE-PEG-NHS和两侧连有半胱氨酸的穿膜肽溶于二甲基亚砜，向两侧连有半胱氨酸的穿膜肽加入等摩尔比的三乙胺，20mM巯基乙醇；
(b)将CG-TAT-GC加入到DSPE-PEG-NHS中，搅拌反应2小时，加入三倍体积的水稀释，调pH2～3终止反应；
(c)透析过夜，反向层析纯化后，冷冻干燥得DSPE-CG-TAT-GC；
超声乳化法的操作为
B.HA/CPPs-10-HCPT-NPs的制备，其操作步骤为
(1)称量：称取10mg二棕榈酰磷脂酰胆碱，2mg DSPE-CG-TAT-GC，1.5mg DC-胆固醇，1mg抗肿瘤药物10-HCPT原药粉末；
(2)溶解：加入10ml甲醇和10ml三氯甲烷溶解；
(3)旋转蒸发：使用旋转蒸发器去除有机溶剂，旋转蒸发时间为1h，得到药脂薄膜；
(4)水化：加入4ml去离子水，将药脂薄膜洗脱下来，得到药脂混悬液；
(5)声振：将药脂混悬液预冷，然后缓慢加入120μl全氟戊烷至药脂混悬液中，使用声振仪声振乳化，得到乳白色液体；
(6)离心：将乳白色液体高速离心，离心转速为8000rpm，温度为4℃，时间为5min，离心完毕去弃上清液，用去离子水重悬沉淀，如此重复两次，获得CPPs-10-HCPT-NPs混悬液；
(7)配置透明质酸溶液：将6mg透明质酸钠中加入10ml去离子水，溶解后配制成0.6mg/ml透明质酸溶液；
(8)静电吸附：将CPPs/10-HCPT-NPs混悬液与0.6mg/ml透明质酸溶液等体积混合，静置1h后，得到HA/CPPs-10-HCPT-NPs乳液。
进一步，所述步骤B的(3)旋转蒸发时，温度为50℃。进一步，所述步骤B的(2)溶解时，采用圆底烧瓶，并用橡皮塞将圆底烧瓶口密封；
所述步骤B的(5)中乳化采用声振仪乳化,全程冰浴，且功率为100w，时间为6min。
进一步，所述步骤B的(5)中声振仪采用间断声振的方式。
本发明以穿膜肽修饰的磷脂、胆固醇为成膜材料，以10-hydroxycamptothecin(10-HCPT)作为抗肿瘤药物模型，采用薄膜分散法、超声乳化法将10-HCPT装载在壳层中，将液态氟碳perfluoropentane(PFP)包裹在脂质壳层内为内核，制备出阳离子脂质纳米粒，然后采用静电吸附作用将透明质酸吸附在上述制备的阳离子脂质纳米粒外层，最终获得一种新型多功能超声分子探针——HA介导CPPs修饰的载10-HCPT相变脂质纳米粒(HA/CPPs-10-HCPT-NPs)。
附图说明
图1为本发明HA介导CPPs修饰的载10-HCPT相变脂质纳米粒的结构示意图。
图2为本发明HA介导CPPs修饰的载10-HCPT相变脂质纳米粒热致相变光镜图(43℃)。
图3为本发明HA介导CPPs修饰的载10-HCPT相变脂质纳米粒热致相变光镜图(45℃)。
图4为本发明HA介导CPPs修饰的载10-HCPT相变脂质纳米粒热致相变光镜图(47℃)。
图5为本发明HA介导CPPs修饰的载10-HCPT相变脂质纳米粒热致相变光镜图(49℃)。
图6为本发明HA介导CPPs修饰的载10-HCPT相变脂质纳米粒的US回声趋势图。
图7为本发明HA介导CPPs修饰的载10-HCPT相变脂质纳米粒的CEUS回声趋势图。
图8为本发明HA介导CPPs修饰的载10-HCPT相变脂质纳米粒的细胞毒性对比图。
图9为本发明HA介导CPPs修饰的载10-HCPT相变脂质纳米粒的细胞凋亡能力对比图。
图10为本发明HA介导CPPs修饰的载10-HCPT相变脂质纳米粒的裸鼠活体荧光成像对比图。
图11为本发明HA介导CPPs修饰的载10-HCPT相变脂质纳米粒的纳米粒体内声致相变增强超声显像定量分析图。
图12为本发明HA介导CPPs修饰的载10-HCPT相变脂质纳米粒的小鼠治疗肿瘤效果对比图。
具体实施方式
一、本发明HA介导CPPs修饰的载10-HCPT相变脂质纳米粒(简称HA/CPPs-10-HCPT-NPs)，其具体的制备方法为：
A.DSPE-CG-TAT-GC的合成
(1)DSPE-PEG-NHS的合成.
(a)称取适量DSPE-PEG-COOH溶于DCM(二氯甲烷)，按1:3:2.5摩尔比加入NHS、DCC，在37.5℃搅拌反应12小时。
(b)反应完成后过滤，滤液低压抽干，用无水乙醚进行洗涤后过滤，复溶后反向层析纯化，真空干燥。
(2)DSPE-CG-TAT-GC的合成
(a)分别将DSPE-PEG-NHS和CG-TAT-GC溶于DMSO，向CG-TAT-GC加入等摩尔比的三乙胺、20mM巯基乙醇。
(b)将CG-TAT-GC加入到DSPE-PEG-NHS中，搅拌反应2小时，加入三倍体积的水稀释，调pH2～3终止反应。
(c)行透析过夜，反向层析纯化后，冷冻干燥得DSPE-CG-TAT-GC。
B.HA/CPPs-10-HCPT-NPs的制备
(1)称量：用电子天平分别精确称取10mg DPPC，2mg DSPE-CG-TAT-GC，1.5mg DC-胆固醇，1mg 10-HCPT原药粉末，将它们倒入100ml圆底烧瓶。
(2)溶解：在上述圆底烧瓶内用微量加样枪加入10ml甲醇和10ml三氯甲烷，然后用橡皮塞将圆底烧瓶口密封，防止有毒有机溶剂挥发。在温水箱内慢慢振荡，使烧瓶内物质充分溶解，必要时用超声清洗机帮助溶解。
(3)旋转蒸发：将旋转蒸发器的水浴锅加热开关打开，设置温度为50℃，检查旋转蒸发器水箱的水是否满足旋转蒸发时使用条件，打开真空泵水阀将其内冷凝管注满水，待水浴锅温度升至设置温度并恒定后将上述充分溶解的药脂混合溶液连接到旋转蒸发器上，设置旋转蒸发时间为1h，启动旋转蒸发器开关，通过负压旋转蒸发去除有机溶剂，得到药脂薄膜。
(4)水化：旋转蒸发完毕，可见圆底烧瓶底部形成一层均匀的药脂薄膜，关掉旋转蒸发器的真空泵和负压阀门，将圆底烧瓶从旋转蒸发器上取下。用微量加样枪加入4ml去离子水，用橡皮塞密闭瓶口，在水浴锅里慢慢摇晃使药脂薄膜被去离子水充分洗脱下来，必要时可在超声波清洗机里帮助其水化洗脱，得到药脂混悬液。
(5)声振：将上述洗脱的药脂混悬液用加样枪转移至10ml EP管里，放置在冰水浴中预冷，然后用微量加样枪吸取120μl PFP缓慢加入到上述预冷的药脂混悬液中，将声振仪探头插入液面下，设置声振仪参数为(125w，6min，5s on and 5s off)，启动声振仪开关，需要注意的是声振仪作用的全程要保证EP充分接触冰水浴，以免因散热不佳导致声振乳化失败。声振完毕，可见EP管内液体呈乳白色液体，得到乳白色液体。
(6)离心：将上述声振后的乳白色液体转移至离心管内，在高速冷冻离心机里离心，设置离心机参数为(8000rpm，4℃，5min)，离心完毕去弃上清液，用去离子水重悬沉淀，如此充分两次，最后获得CPPs-10-HCPT-NPs混悬液。
(7)配置透明质酸溶液：用电子天平称取透明质酸钠6mg倒入15ml离心管内，加入10ml去离子水，充分溶解后配制成0.6mg/ml透明质酸溶液。
(8)静电吸附：将CPPs/10-HCPT-NPs乳液与0.6mg/ml透明质酸溶液等体积混合，静置1h后即得HA/CPPs-10-HCPT-NPs乳液样品。
得到如图1所示的HA介导CPPs修饰的载10-HCPT相变脂质纳米粒，包括磷脂壳膜,磷脂壳膜上载有抗肿瘤药物10-HCPT，磷脂壳膜上修饰有DC-胆固醇、两侧连有半胱氨酸的穿膜肽CG-TAT-GC，磷脂壳膜外层吸附有透明质酸，磷脂壳膜内部包裹有全氟戊烷。
另外，为了实验需要，将DSPE-CG-TAT-GC替换成DSPE，其他步骤不变，即可获得10-HCPT-NPs、HA/10-HCPT-NPs纳米粒乳液样品。在药脂混悬液旋转蒸发成膜之前加入少许DiI染料，与有机溶剂充分混合，其余步骤不变，即可获得DiI标记的各种相应纳米粒乳液。
二、HA介导CPPs修饰的载10-HCPT相变脂质纳米粒的特性及性能
1.A介导CPPs修饰的载10-HCPT相变脂质纳米粒的表征
(1)普通光镜检测：普通光镜下观察发现HA/CPPs-10-HCPT-NPs呈小球状，点状颗粒，大小较均匀，分散性好，无成团聚集现象。
(2)激光共聚焦显微镜检测：激光共聚焦显微镜下观察发现HA/CPPs-10-HCPT-NPs呈小球状，点状颗粒，大小较均匀，分散性好，无成团聚集现象。
(3)透射电子显微镜检测：透射电镜下观察发现HA/CPPs-10-HCPT-NPs呈圆球形，形态规则。
(4)激光粒度分析仪检测：将CPPs-10-HCPT-NPs和HA/CPPs-10-HCPT-NPs纳米粒乳液稀释一定程度后送激光粒度分析仪分别检测其粒径和电位，检测结果提示CPPs-10-HCPT-NPs呈正电荷，粒径大小约为(245.1±10.3)nm，HA/CPPs-10-HCPT-NPs纳米粒带负电荷，粒径大小约为(284.2±13.3)nm。
2.HA/CPPs-10-HCPT-NPs的载药量和包封率检测
通过高效液相色谱仪检测HA/CPPs-10-HCPT-NPs的峰面积并计算其载药量和包封率。经计算HA/CPPs-10-HCPT-NPs的载药量和包封率分别为(5.23±0.34)％、(48.10±3.13)％。
3.HA/CPPs-10-HCPT-NPs的热致相变探索
在HA/CPPs-10-HCPT-NPs热致相变的实验中，当加热板温度达43℃时，纳米粒基本稳定，大小无明显变化(如图2)，随着温度逐渐升高，当升至45℃时，纳米粒体积开始增大(如图3所示)，当温度继续升高至47℃时可见越来越多的纳米粒体积增大，相变的纳米粒数量增多，观察还发现部分纳米粒体积增大到一定程度后发生爆破(如图4所示),将加热板温度继续升高至49℃时，加热板上仅可见少许纳米粒相变的气泡存在(如图5所示)。
4.HA/CPPs-10-HCPT-NPs的声致相变探索
在HA/CPPs-10-HCPT-NPs声致相变的实验中，我们研究了时间依赖和超声强度依赖的纳米粒相变情况探讨。根据纳米粒声致相变超声声像图、DFY定量分析软件得到的US回声趋势图(如图6所示)和CEUS回声趋势图(如图7所示)的结果可得：LIFU辐照前，各组纳米粒乳液经超声诊断仪探查的声像图不管在B-mode还是CEUS-mode均显示为低回声或无回声。在B-mode下，在声强2W/cm2组，随着时间延长，声像图的回声信号越来越强；在声强2.4W/cm2组，前3分钟随着时间延长回声信号逐渐增高，在第3分钟时达最高，延长至第4分钟时，回声信号开始变弱；在声强2.8W/cm2组，同样在前3分钟，随着时间延长，回声信号逐渐增加，在第3分钟时回声信号最高，第4分钟时开始减弱，不过2.8W/cm2组第3分钟时的回声信号较2.4W/cm2组第3分钟的回声信号弱。
综上可知：纳米级超声分子探针能透过增大的肿瘤血管内皮间隙到达血管外，实现血管外的组织细胞成像，若纳米粒表面修饰有靶向肿瘤部位的相应受体或者抗体，则能将其携带的抗肿瘤药物递送到肿瘤靶部位进行治疗。由于常规纳米粒即使穿过肿瘤血管内皮间隙后达到血管外组织的距离仍然有限，仅为数个肿瘤细胞深度，对深部肿瘤组织的治疗效果有待进一步提高。基于上述研究，本发明采用薄膜分散法、超声乳化法、静电吸附作用研发了一种新型多功能超声分子探针----透明质酸介导穿膜肽修饰的载10-HCPT的相变脂质纳米粒(HA/CPPs-10-HCPT-NPs)，该纳米粒在光镜、激光共聚焦显微镜和透射电镜下观察呈大小均匀的颗粒状，分散性好，无明显成团聚集现象，粒径为表面zeta电位为-(16.55±1.50)mV，表面电荷为负电荷使其在体内血液循环中不易受血液中的蛋白攻击，延长了体内循环时间，同时粒径大小为(284.2±13.3)nm，具备穿透血管内皮间隙(380～780nm)的能力，能到达血管外组织细胞，具备让血池外组织细胞成像的潜力。通过高效液相色谱仪检测HA/CPPs-10-HCPT-NPs中10-HCPT的载药量和包封率分别为(5.23±0.34)％and(48.10±3.13)％。
制备纳米粒的壳材磷脂与生物体细胞膜磷脂成分相同；同时选用的全氟戊烷(PFP)具备良好的携氧能力，可作为血液替代品；透明质酸是一种天然的高分子酸性粘多糖，具有生物相容性、生无可降解性、无免疫源性以及对肿瘤细胞的高亲和性等特点，已在药物输送和组织工程等领域得到广泛的应用。因此本实验制备纳米粒的所用材料生物安全性均较高。PFP的沸点为29℃，在常温条件下呈液态，当在生理温度(37℃)条件下可相变呈气态，研究表明，当PFP被脂质包裹形成纳米粒后其液气相变温度阈值会明显升高，这是因为施加在纳米粒周围的Laplace压力较前增加了，从HA/CPPs-10-HCPT-NPs热致相变实验结果，我们可以看到加热板温度升至43℃时尚没能使其相变，当升至45℃时，开始有气泡形成，表明HA/CPPs-10-HCPT-NPs相变温度为45℃左右，温度升至47℃时，形成的气泡数量最多，随着加热板温度的继续升高，纳米粒体积增大至一定程度后会发生爆破。
对新制备的HA/CPPs-10-HCPT-NPs进行了声致相变(ADV)条件探索，我们从实验结果看到新研制的HA/CPPs-10-HCPT-NPs在2.4W/cm23min时B-mode和CEUS显示超声声像图回声信号最强，DFY定量分析软件结果也提示在2.4W/cm23min时回声强度值最高，因此HA/CPPs-10-HCPT-NPs最佳ADV条件为2.4W/cm23min，之所以在2.8W/cm2 3min时的超声回声强度较2.4W/cm2 3min时弱，考虑原因可能是在2.8W/cm2 3min时足以让纳米粒发生破裂，导致回声强度明显下降。
综上所述，本发明的纳米级超声分子探针HA/CPPs-10-HCPT-NPs具备粒径小、良好载药能力、ADV等优秀性能。
三、HA介导CPPs修饰的载10-HCPT相变脂质纳米粒联合LIFU杀伤肝癌细胞的实验研究
纳米粒具体的制备流程同本发明的制备方法。所不同的是在药脂膜旋转蒸发成膜之前，加入适量的DiI染料，让染料充分溶解到有机溶剂中，其余步骤不变，最后可制备出DiI标记的HA/CPPs-10-HCPT-NPs和CPPs-10-HCPT-NPs纳米粒。
实验结果为：
1.HA/CPPs-10-HCPT-NPs体外寻靶能力检测
由实验结果可知，在HA/CPPs-10-HCPT-NPs组，SMMC-7721细胞周围粘附大量红色点代表的DiI标记的纳米粒，并可见部分纳米粒进入细胞内；在CPPs-10-HCPT-NPs组，SMMC-7721细胞周围未能见到红点粘附，表明DiI标记的CPPs-10-HCPT-NPs纳米粒未能有效聚集到肝癌细胞膜上，同时细胞内也未能见到纳米粒出现；为进一步验证HA/CPPs-10-HCPT-NPs纳米粒的靶向性能是HA介导的，设立了HA/CPPs-10-HCPT-NPs+HAase组，从该组实验结果发现，SMMC-7721细胞周围也基本未见到红点代表的纳米粒粘附、聚集。
2.HA/CPPs-10-HCPT-NPs体外穿膜能力检测
从实验结果发现，在HA/CPPs-10-HCPT-NPs组，可见大量的DiI标记的HA/CPPs-10-HCPT-NPs粘附在3D MCTS上并穿透进入MCTS内，其穿透深度为27.14μm；而在HA/10-HCPT-NPs组，仅可见少量的DiI-HA/10-HCPT-NPs粘附在MCTS上，穿透进入MCTS的纳米粒也较HA/CPPs-10-HCPT-NPs组明显减少，穿透深度为9.83μm，HA/CPPs-10-HCPT-NPs穿透MCTS的深度为HA/10-HCPT-NPs的2.76倍。
3.HA/CPPs-10-HCPT-NPs联合LIFU抗肝癌SMMC-7721细胞增殖能力检测
采用CCK-8法检测了HA/CPPs-10-HCPT-NPs联合LIFU抗肝癌细胞SMMC-7721增殖能力的效果，实验结果显示，10-HCPT纯药组的细胞毒性高于HA/CPPs-10-HCPT-NPs、CPPs-10-HCPT-NPs、HA/10-HCPT-NPs、10-HCPT-NPs，细胞存活率则低于上述各组；对照组和单纯LIFU组相比细胞存活率略高，但差异没有统计学意义；在10-HCPT+LIFU辐照组，其细胞存活率则低于单纯10-HCPT组，其差异具有统计学意义；而是在HA/CPPs-10-HCPT-NPs+LIFU组，其细胞毒性是所有组中最高的，其存活率显著低于其他纳米粒+LIFU辐照组，差异具有统计学意义(如图8所示)。
4.HA/CPPs-10-HCPT-NPs联合LIFU促肝癌SMMC-7721细胞凋亡能力检测
为了检测HA/CPPs-10-HCPT-NPs联合LIFU杀伤肝癌细胞的效果，采用流式细胞术检测SMMC-7721细胞的凋亡情况，从实验结果分析，HA/CPPs-10-HCPT-NPs+LIFU组的细胞凋亡率是所有实验组中最高的，表明HA/CPPs-10-HCPT-NPs联合LIFU对肝癌SMMC-7721的杀伤作用最强(如图9所示)；没有经LIFU辐照的载药相变纳米粒组的细胞凋亡率低于10-HCPT纯药组，但是经LIFU辐照的载药相变纳米粒组的细胞凋亡率则明显高于10-HCPT+LIFU辐照组的细胞凋亡率，其中HA/CPPs-10-HCPT-NPs+LIFU是最明显的，单纯LIFU辐照组与对照组的细胞凋亡率相比略高，但差异没有统计学意义，实验结果与HA/CPPs-10-HCPT-NPs联合LIFU抗肝癌细胞增殖的实验反映HA/CPPs-10-HCPT-NPs联合LIFU杀伤肝癌细胞的效果结果一致。
综上，原发性肝癌发病隐匿，在疾病早期很难被发现，很多患者一经诊断大多进入中晚期，治疗效果大打折扣，因此早期发现，早期诊断，并进行早期治疗对改善患者预后起到决定性作用。超声分子探针为实现肿瘤的早期发现，早期诊断提供了有力手段。
本实验在前期实验的基础上将新研发的HA/CPPs-10-HCPT-NPs超声分子探针对肝癌细胞SMMC-7721的靶向性能和穿膜性能进行了评估，然后评价了HA/CPPs-10-HCPT-NPs联合低强度聚焦超声(LIFU)在体外杀伤肝癌细胞SMMC-7721的效果。
据文献报道，肝癌细胞SMMC-7721的细胞膜表面高表达CD44，本实验通过western-blotting检测了SMMC-7721细胞膜蛋白上CD44的表达情况，实验结果显示SMMC-7721细胞膜上高表达CD44，这与既往文献报道的情况一致。CD44是一种细胞粘附因子，它与肿瘤细胞的生成、侵袭、淋巴结的转移有密切关系，更重要的是它能与透明质酸特异性结合。透明质酸(HA)是一种天然的粘多糖，无免疫源性，并具有良好的生物相容性和生物可降解性，能与CD44有很高的亲和力，以HA为靶向分子与药物缀合后可增强由受体介导的细胞内吞作用。因此，CD44可作为肝癌的一种潜在的靶点应用于肝癌的诊断和治疗。我们研发的HA/CPPs-10-HCPT-NPs纳米粒能主动粘附在肝癌细胞SMMC-7721周围并大部分进入细胞内，而CPPs-10-HCPT-NPs纳米粒则不能粘附在肝癌细胞SMMC-7721周围，说明HA在介导纳米粒靶向肝细胞并内吞进入细胞起到积极作用，另外当HA/CPPs-10-HCPT-NPs先与HAase作用后再与肝癌细胞SMMC-7721孵育，结果在SMMC-7721细胞周围也很难见到纳米粒的荧光，更进一步说明HA在引导HA/CPPs-10-HCPT-NPs靶向结合肝癌SMMC-7721细胞的重要作用。
细胞穿膜肽(CPPs)与细胞膜有很强的亲和力，能携带大分子物质(如蛋白、多肽、核酸片段等)在不损伤细胞膜的情况下穿过细胞膜进入细胞质甚至细胞核内。人类免疫缺陷病毒1型反转录激活因子(HIV-1TAT)作为最短的多肽能修饰在脂质体或者纳米胶束上，能携带各种药物或者基因进入细胞。发明人发现，在TAT侧链连接半胱氨酸的多肽，即CG-TAT-GC较未修饰型TAT的穿膜效果更佳。HA/CPPs-10-HCPT-NPs在CG-TAT-GC介导下穿透进入3D MCTS的纳米粒较HA/10-HCPT-NPs组明显增多，其穿透的深度为27.14μm，也明显大于HA/10-HCPT-NPs组的9.83μm，前者是后者的2.76倍，这说明CG-TAT-GC对促进HA/CPPs-10-HCPT-NPs穿透进入3D MCTS起到积极作用。
HA/CPPs-10-HCPT-NPs与LIFU辐照联合对肝癌细胞SMMC-7721的杀伤效果。通过CCK-8法检测发现，纯药组的细胞存活率明显低于未经LIFU辐照的各载药纳米粒组，分析原因可能是纯药比纳米粒更易于被动扩散、内化、渗透进入细胞内，而载药纳米粒则是通过缓慢释放药物的方式。空白对照组和单纯LIFU辐照组相比，两者的细胞存活率差异没有统计学差异(P>0.05)，表明单纯的LIFU辐照剂量对细胞的安全的。10-HCPT+LIFU辐照组的细胞存活率低于单纯10-HCPT组，考虑是因为LIFU产生的超声空化效应使细胞膜通透性增加，让更多的10-HCPT药物进入细胞导致细胞存活率明显下降。在众多实验组中，HA/CPPs-10-HCPT-NPs+LIFU辐照组的细胞毒性最大，细胞存活率是最低的，分析原因考虑是在HA介导下纳米粒靶向结合到肝癌细胞SMMC-7721与非靶向组相比更多，同时在CG-TAT-GC介导下穿透进入细胞的纳米粒较没有CG-TAT-GC修饰的纳米粒更多，再加上LIFU的辐照作用，使粘附和穿透进入细胞的纳米粒发生相变和爆破，在上述因素的综合作用下使SMMC-7721受到物理化学的双重杀伤作用，因此HA/CPPs-10-HCPT-NPs+LIFU辐照组对SMMC-7721的杀伤作用在众实验组中是最显著的，差异具有统计学意义。
另外，通过流式细胞术检测了各实验组细胞的凋亡情况，从实验结果我们可以看到，HA/CPPs-10-HCPT-NPs+LIFU辐照组的细胞凋亡率在所有实验组中是最高的，表明HA/CPPs-10-HCPT-NPs+LIFU辐照组与其他各实验组相比对SMMC-7721细胞产生了更大杀伤作用，单纯LIFU辐照组与空白对照组相比，两组的细胞凋亡率差异没有统计学意义。细胞凋亡实验结果反映的HA/CPPs-10-HCPT-NPs联合LIFU杀伤肝癌细胞的效果与抗增殖试验结果得出的结论一致。
验证了HA的靶向引导性能和CG-TAT-GC介导的穿膜性能，表明HA/CPPs-10-HCPT-NPs具备良好的靶向穿膜能力，同时，将HA/CPPs-10-HCPT-NPs联合LIFU辐照探讨了物理化学协同作用起到很好的杀伤肝癌细胞的效果。
四、HA介导CPPs修饰的载10-HCPT相变纳米粒联合LIFU精准诊疗肝癌的实验研究
DiR-HA/CPPs-10-HCPT-NPs具体的制备流程同本发明的制备方法。所不同的是在药脂混合溶液旋转蒸发成膜之前，加入适量的DiR染料，让染料充分溶解到有机溶剂中，其余步骤不变，最后可制备出DiR标记的HA/CPPs-10-HCPT-NPs和CPPs-10-HCPT-NPs纳米粒。检测结果为：
1.免疫组织化学检测裸鼠皮下移植瘤组织CD44的表达
采用免疫组织化学的方法检测裸鼠皮下移植瘤组织细胞膜成棕黄色着色，表明肝癌SMMC-7721细胞种植的裸鼠皮下移植瘤组织高表达CD44。
2.HA/CPPs-10-HCPT-NPs体内靶向能力检测
从小动物活体荧光成像结果和对比图(如图10所示)中，可以看到经荷瘤裸鼠尾静脉注射DiR-HA/CPPs-10-HCPT-NPs的靶向纳米粒组在注射纳米粒乳液后4h和24h，皮下移植瘤部位的荧光信号均强于DiR-CPPs-10-HCPT-NPs非靶向纳米粒组，另外在靶向组，离体肿瘤组织的荧光信号也明显强于非靶向组。从荧光强度定量分析结果也可以看到24h后靶向组离体肿瘤组织荧光强度显著高于非靶向组。
同时从肿瘤组织快速冰冻切片的激光共聚焦显微镜图片结果看到，在靶向组，经尾静脉注射纳米粒后1h，肿瘤组织冰冻切片中可见散在的红色点状荧光信号代表的DiI-HA/CPPs-10-HCPT-NPs纳米粒，而在非靶向组，肿瘤组织冰冻切片中则几乎见不到红色点状荧光信号代表的纳米颗粒。
3.HA/CPPs-10-HCPT-NPs体内声致相变效果及增强超声显影能力的评估
从纳米粒体内声致相变效果及增强超声显影能力的实验结果中，可以得知，在HA/CPPs-10-HCPT-NPs+LIFU辐照组，注射HA/CPPs-10-HCPT-NPs之前，皮下移植瘤超声声像图显示为低回声信号，注射纳米粒入裸鼠体内1h后，经LIFU辐照肿瘤，超声诊断仪在B-mode和超声造影模式(CEUS)下均可在肿瘤部位LIFU聚焦点处探及团状高回声信号，然而CPPs-10-HCPT-NPs+LIFU辐照组则在LIFU前、后肿瘤部位均未见明显的高回声信号，同样在只注射HA/CPPs-10-HCPT-NPs而无LIFU辐照组中，亦未见明显的强回声信号。从DFY软件定量分析结果来看(如图11所示)，在HA/CPPs-10-HCPT-NPs+LIFU辐照组，LIFU辐照后较辐照前肿瘤部位聚焦区域回声信号明显增强，在B-mode和CEUS模式下HA/CPPs-10-HCPT-NPs+LIFU辐照组的回声强度值增加程度均显著高于其他各组在LIFU辐照前、后超声声像图回声强度值增加的程度，差异具有统计学意义(P<0.05)。
4.HA/CPPs-10-HCPT-NPs联合LIFU辐照治疗裸鼠皮下移植瘤的效果评价
从HA/CPPs-10-HCPT-NPs联合LIFU辐照对裸鼠荷SMMC-7721肝癌皮下移植瘤的治疗效果的实验结果分析，HA/CPPs-10-HCPT-NPs+LIFU辐照组的裸鼠移植瘤肿瘤体积是最小的，抑瘤率是最高的(P<0.001)，因此在所有处理组中HA/CPPs-10-HCPT-NPs+LIFU辐照组的抑瘤效果是最佳的。也可以看到在单纯LIFU辐照组与空白对照组比较中，两组裸鼠的肿瘤体积和抑瘤率之间比较差异没有统计学意义(P>0.05)(如图12所示)。
另外，在HA/10-HCPT-NPs组，其肿瘤体积小于没有HA的10-HCPT-NPs组，其抑瘤率高于10-HCPT-NPs组，表明抗肿瘤治疗效果前者强于后者；HA/CPPs-10-HCPT-NPs组的抗肿瘤效果强于不含CG-TAT-GC穿膜肽的HA/10-HCPT-NPs组；而在HA/CPPs-10-HCPT-NPs+LIFU辐照组的抑瘤率是HA/CPPs-10-HCPT-NPs组的1.16倍，两组之间差异具有统计学意义。
组织病理学检查实验结果中，单纯LIFU辐照组和对照组裸鼠皮下移植瘤的组织切片H&E染色显示肿瘤细胞正常形态，而HA/CPPs-10-HCPT-NPs+LIFU辐照组的显微镜下观察肿瘤组织切片H&E染色结果显示大量肿瘤组织细胞的细胞膜溶解和核碎裂；在TUNEL染色实验中，细胞核被染成棕色的细胞为凋亡的阳性细胞，显微镜下观察发现，细胞凋亡最多的是HA/CPPs-10-HCPT-NPs+LIFU辐照组，同时经计算HA/CPPs-10-HCPT-NPs+LIFU辐照组的凋亡指数在所有实验组中是最高的；在PCNA染色实验中，细胞核被染成棕色的细胞为增殖的阳性细胞，显微镜下观察发现，细胞增殖最少的是HA/CPPs-10-HCPT-NPs+LIFU辐照组，同时经计算HA/CPPs-10-HCPT-NPs+LIFU辐照组的增殖指数在所有实验中是最低的。
综上：首先，采用免疫组化检测发现裸鼠皮下移植瘤组织中CD44呈高表达，这为肝癌的靶向治疗提供了潜在靶标。透明质酸与CD44亲和力很强，将DiR标记的HA介导的CPPs-10-HCPT-NPs经荷瘤裸鼠尾静脉注射入体内后，采用小动物活体荧光成像系统观察发现裸鼠肿瘤部位显示很强的荧光信号，而DiR标记的不含HA的CPPs-10-HCPT-NPs注射入裸鼠体内后肿瘤部位不能检测到明显的荧光信号，24h后将肿瘤离体下来进行荧光成像并定量分析显示靶向组肿瘤的荧光强度值显著高于非靶向组，差异具有显著统计学意义(P<0.001)，上述实验结果表明纳米粒在HA引导下能成功靶向结合到肿瘤部位。为进一步验证HA/CPPs-10-HCPT-NPs的体内靶向能力，将肝癌裸鼠皮下移植瘤离体后进行快速冰冻切片，激光共聚焦显微镜观察发现HA/CPPs-10-HCPT-NPs组冰冻切片可见散在的代表纳米粒的点状荧光信号，而CPPs-10-HCPT-NPs组则不能观察到，这就更直观表明HA具有很强的靶向引导能力，同时HA/CPPs-10-HCPT-NPs能散在分散到肿瘤组织内部，说明其具备良好的穿膜能力，通过穿透细胞膜和细胞外基质渗透进更深的组织细胞，以实现靶向更多的肿瘤细胞。
要作为一种性能优良的超声分子探针，除了需要有针对靶病灶很强的靶向结合能力之外，还需要能在靶病灶区域特异性显影，提高病灶在周围正常组织中识别能力。因此对HA/CPPs-10-HCPT-NPs在体内的液气相变效果和增强超声显像的能力进行了评估。将HA/CPPs-10-HCPT-NPs注入裸鼠体内1h后，用LIFU辐照肿瘤部位，在肿瘤部位焦域内可探及高回声信号，而在注射纳米粒之前肿瘤部位的声像图显示为低回声，CPPs-10-HCPT-NPs+LIFU组和HA/CPPs-10-HCPT-NPs组的肿瘤部位均不能探及高回声信号，上述实验结果表明除了进一步验证了HA/CPPs-10-HCPT-NPs能靶向结合到肿瘤部位之外，它还能在外界LIFU辐照下发生ADV以增强病灶部位的超声显影，提高了病灶的诊断效果。由此可见，HA/CPPs-10-HCPT-NPs具备良好的超声分子探针靶向和增强超声显像诊断的性能。
从HA/CPPs-10-HCPT-NPs联合LIFU治疗荷瘤裸鼠皮下移植瘤的体内实验结果中，可以看到HA/CPPs-10-HCPT-NPs联合LIFU辐照可显著抑制肿瘤生长，在众多实验组中，HA/CPPs-10-HCPT-NPs联合LIFU辐照组的肿瘤体积是最小的，抑瘤率是最高的，因此HA/CPPs-10-HCPT-NPs联合LIFU辐照组的抑瘤效果是所有实验中最强的。从各实验组的分组情况来看，单纯LIFU辐照组和空白对照组的肿瘤体积和抑瘤率各自的差异没有统计学意义，表明该辐照剂量的安全的。我们还发现单纯10-HCPT组的抗肿瘤效果低于各载药纳米粒组，这与体外实验中，单纯10-HCPT对肝癌细胞的杀伤作用强于各载药纳米粒组的结果相反，其原因发明人认为可能是单纯10-HCPT在体内经过代谢被很快清除，而载药纳米粒组在体内通过缓慢释药，维持一个持续的药物浓度，对肿瘤起到持续抑制作用的效果，另外10-HCPT的细胞毒性经磷脂包裹成脂质体后会下降，药物稳定性增加，这也有利于增强抑瘤效果。还发现HA/CPPs-10-HCPT-NPs组的抑瘤效果强于CPPs-10-HCPT-NPs组，HA/10-HCPT-NPs组的抑瘤效果强于10-HCPT-NPs组，是因为各靶向纳米粒组受HA的介导在靶病灶区域的聚集显著多于相应的非靶向组。另外，HA/CPPs-10-HCPT-NPs纳米粒组抑瘤作用强于HA/10-HCPT-NPs纳米粒组，这可能是由于前者在CPPs的介导下穿透细胞膜和细胞外基质屏障到达更深的肿瘤组织细胞，实现靶向更多、更深的肿瘤细胞，从而产生更强的抗肿瘤效果。而在HA/CPPs-10-HCPT-NPs+LIFU辐照组的肿瘤抑制率是单纯HA/CPPs-10-HCPT-NPs组的1.16倍，差异具有统计学意义(P<0.05)，该结果说明HA/CPPs-10-HCPT-NPs经LIFU辐照后其抗肿瘤效果显著增加。
从H&E染色结果来看，空白对照组和单纯LIFU辐照组的肿瘤组织细胞未见明显破坏，而HA/CPPs-10-HCPT-NPs+LIFU组的组织细胞可见明显的细胞形态不完整、核碎裂等。TUNEL染色结果显示HA/CPPs-10-HCPT-NPs+LIFU组的细胞凋亡率最高，PCNA染色结果显示HA/CPPs-10-HCPT-NPs+LIFU组的细胞增殖率最低。上述实验结果表明HA/CPPs-10-HCPT-NPs经LIFU辐照发生ADV，液气相变产生的微泡继续发生爆破促进载药纳米粒内药物的释放，在上述物理化学综合作用下使抗肿瘤效果实现最大化。通过本发明制备方法制备的HA介导CPPs修饰的载10-HCPT相变脂质纳米粒，其结果如下：
一、成功制备了HA/CPPs-10-HCPT-NPs，表面所带负电荷，粒径小于300nm，形态规则，大小均匀，分散性好，无成团聚集，性质稳定，药物载药量和包封率较高，具备热致相变和声致相变的性能，在一定温度和LIFU辐照条件下发生液气相变以增强超声显像。
二、HA/CPPs-10-HCPT-NPs能在HA的介导下特异靶向结合到细胞膜高表达CD44的肝癌细胞SMMC-7721，并在穿膜肽CG-TAT-GC介导下穿透细胞膜、细胞外基质屏障进入3D MCTS。
三、HA/CPPs-10-HCPT-NPs联合LIFU对肝癌细胞SMMC-7721有很强的杀伤作用。
四、HA/CPPs-10-HCPT-NPs经尾静脉注入荷瘤裸鼠体内后能聚集到肿瘤部位，并在LIFU辐照下发生ADV增强肿瘤内聚焦区域的显像。
五、HA/CPPs-10-HCPT-NPs联合LIFU显著抑制裸鼠肝癌皮下移植瘤的生长，有良好的治疗肝癌效果。
六、HA/CPPs-10-HCPT-NPs联合LIFU辐照集诊断、治疗于一体，有望成为一种前景光明的诊治原发性肝癌的新策略。
对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。