技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种病人来源的胃癌异种移植的斑马鱼模型、其构建方法及应用。
背景技术
胃癌是全球最常见的消化系统恶性肿瘤之一，在东亚地区最为高发。世界卫生组织(WHO)公布的《2014年全球癌症报告》数据显示，2012年中国新增的胃癌病例和死亡人数均占全球的40％以上。2016年，美国癌症学会(ACS)主办的权威期刊《CA Cancer J Clin》中新发表的中国2015年癌症统计报告显示，我国2015年胃癌的新发病例为67.91万例，其中，男性新发病例数为47.77万例，位列男性高发癌症的第二位，仅次于肺癌。女性新发病例数为20.14万例，位列女性高发癌症的第三位，仅次于乳腺癌和肺癌。胃癌已经成为中国人群中第二位致死癌症，死亡病例数为49.8万例，仅次于肺癌。
早期胃癌患者进行根治性切除术后的5年生存率可达90％，但是由于胃癌早期症状不明显和胃镜常规检查普及不足等原因，我国胃癌患者就诊时约80％已到晚期。现有的胃癌治疗手段有限，单纯手术治疗的总生存率只有20％左右，放疗和化疗常用于术前或术后的辅助性治疗。胃癌的药物治疗仍然以经典化疗药物为主，如5-氟尿嘧啶，紫杉醇和铂类，靶向药物在胃癌治疗中尚处于临床试验阶段。由于胃癌是一种异质性极高的肿瘤，现有的众多临床方案表明，化疗可延长胃癌患者的生存时间，但目前尚未找到公认的、优势明显的符合个性化用药的“金标准”治疗方案。很多患者因未能接受与个体最为匹配的药物而失去原本的治疗窗。因此，胃癌临床上急需个性化的用药方案指导。
病人来源的肿瘤异种移植模型(Patient-derived tumor xenograft，PDX)，是指将患者的新鲜肿瘤组织移植到免疫缺陷动物上，依靠动物体提供的微环境进行生长。与人源肿瘤细胞系异种移植模型相比，PDX模型肿瘤的分化程度、形态特征、结构特点以及分子特性等与患者本身的肿瘤特点更为接近，这为肿瘤的生物学研究、诊断标志物的寻找和药物筛选提供了一个重要的体内模型。此外，PDX模型能够体现标本来源患者自述肿瘤的特点，包括对药物反应的特异性等。因此，PDX模型具有比传统肿瘤细胞系异种移植模型具有更高的临床相关性，对肿瘤临床前期评估、治疗和预后具有更加重要的转化意义，特别是对于肿瘤的个体化诊断和治疗具有不可代替的价值。目前，小鼠是最常用的肿瘤PDX模型动物，但是由于小鼠肿瘤接种、成瘤和药效评价时间通常为3个月，不能满足临床实时指导个体化用药的重大需求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种病人来源的胃癌异种移植动物模型及其构建方法与在胃癌药物筛选中的用途。
本发明首先提供一种病人来源的胃癌异种移植斑马鱼模型，该斑马鱼胚胎移植有病人来源的胃癌组织分离培养的原代单细胞。
本发明所述移植是在受精后24-72小时内进行，进一步优选36-60小时内，更优选在48小时进行。所述移植的部位在胚胎卵黄囊。
本发明所述原代单细胞是经过染色的，所述的染色染料为氯甲基苯甲酰胺荧光染料(CM-DiI)。
本发明另一方面提供上述病人来源的胃癌异种移植斑马鱼模型在研究胃癌的转移、扩散或耐药的机制，或者筛选有效的胃癌治疗药物的应用。
本发明所述的病人来源的胃癌异种移植斑马鱼模型用于筛选有效的胃癌治疗药物包括如下步骤：确定胃癌候选药物对未经移植的胚胎的安全范围内的最高药物浓度；以胚胎安全范围内的药物浓度的候选药物浸泡所述的病人来源的胃癌异种移植马鱼胚胎，并选用候选药物的溶解溶剂作为对照药物同法处理；在荧光显微镜下对斑马鱼胚胎中病人来源的细胞的增殖、扩散的情况进行定性分析或/和定量分析。所述定量分析按下式公式计算抗肿瘤效果：
药物的肿瘤抑制率＝(药物处理组的荧光强度/对照组的荧光强度)*100％。
候选药物浸泡斑马鱼胚胎处理的时间为持续2到5天，优选3天。观察时间优选为第1、4、7天，也可以仅在第7天观察计算。
更具体而言，本发明所述的病人来源的胃癌异种移植斑马鱼模型用于筛选有效的胃癌治疗药物的具体步骤如下：
(1)以不同浓度的备选药物处理受精后一到三天龄、优选两天龄的未经移植的斑马鱼胚胎，持续处理三到五天，优选四天，根据胚胎存活情况确定胚胎安全范围内的最高药物浓度；
(2)以确定的所述胚胎安全范围内的最高药物浓度的所述备选药物对受精后1到3天龄、优选两天龄的已注射过病人来源的胃癌细胞的斑马鱼胚胎，处理2到5天、优选3天，并选用备选药物的溶剂作为对照药物同法处理。
(3)观察比较处理后的斑马鱼胚胎中红色病人来源的细胞的增殖、扩散的情况。在荧光显微镜下对红色细胞进行拍照，并用Image Pro Plus软件对红色荧光强度定量，并用,公式计算药物的抗肿瘤效果。
本发明的第三方面是提供一种病人来源的胃癌异种移植斑马鱼模型的构建方法，包括如下步骤：
(1)将病人来源的的胃癌临床手术组织标本解离成原代单细胞；
(2)将解离所得的原代单细胞染色；
(3)将步骤(2)得到的原代单细胞注射到斑马鱼胚胎卵黄囊内。
所述的构建方法中步骤(1)所述的解离包括：将样本在生理盐水中进行无菌清洁后，在磷酸盐缓冲液中剪切成小块，经胰酶消化至解离完全，离心，去除胰酶；步骤(2)所述染色，使用的染料为CM-DiI，染料浓度为1-5μg/ml，染色时间为1-10小时，染色后去除染料，磷酸盐缓冲液洗涤并重悬至细胞密度为5×103-5×105个/μl；步骤(3)所述的注射包括：将受精后36-60小时的斑马鱼胚胎固定，采用显微注射器在体视镜下，将10-30nl，优选为20nl的步骤(2)得到的原代细胞注射入斑马鱼胚胎卵黄囊内。
本发明所述的构建方法，在所述的步骤(3)后还包括使用荧光显微镜进行定性分析或/和定量分析的观察步骤。所述观察步骤可以在异种移植细胞后的第1-7天内，将斑马鱼胚胎用三卡因麻醉，经荧光显微镜观察荧光细胞在斑马鱼体内的转移和扩散情况。
本发明所述的构建方法，更具体而言，步骤(1)具体为：将临床手术胃癌组织样本用磷酸缓冲液洗涤2遍，手术剪刀将其剪切成1mm3的小块后，经0.25％胰酶37℃消化10-120分钟，待观察到组织块解离完全后，离心，去除胰酶；
步骤(2)中CM-DiI染料的终浓度为2μg/ml，染色时间为1-10小时。离心去除染料，磷酸缓冲液洗涤并重悬至细胞密度为5×103-5×105个/μl；
步骤(3)，具体为：将受精后36-60小时斑马鱼胚胎固定，采用显微注射器在体视镜下，将10-30nl，优选为20nl步骤(2)得到的原代细胞注射入斑马鱼胚胎卵黄囊。本发明使用的斑马鱼是国际公认的模式脊椎动物，基因与人类基因具有高度同源性(>85％)，是经典的发育生物学研究模型，也可作为药物活性筛选、药物毒性评价和人类疾病研究的常用动物模型。
本发明所述胃癌治疗药物可以为5-氟尿嘧啶(5-FU)。
斑马鱼具有体积小，生长快，发育早期通体透明的特点。基于斑马鱼的PDX模型具有成本低，通量高，操作简单，便于在体观察的优势。更重要的是，基于斑马鱼的PDX模型的实验周期短(1周)，是目前唯一有望满足实时指导胃癌个体化用药临床需求的动物模型。
本发明通过构建病人来源的胃癌异种移植斑马鱼模型，可以用于筛选是否有效的胃癌治疗药物，特别是筛选剔除掉那些对病人没有治疗效果的药物。本发明的病人来源的胃癌异种移植(PDX)模型与人胃癌细胞系异种移植模型相比，在指导临床胃癌患者个性化用药上有更高的准确性。
附图说明
图1是病人来源的胃癌原代细胞注射入斑马鱼胚胎的表型
图2是本发明实施例2中两例5-FU非敏感病人#1、#2来源的胃癌异种移植斑马鱼模型评价5-FU的抗癌效果
图3是本发明实施例2中两例5-FU敏感病人#3、#4来源的胃癌异种移植斑马鱼模型评价5-FU的抗癌效果
图4是两例人类胃癌细胞株的异种移植斑马鱼模型评价5-FU的抗癌效果
图5是本发明实施例4中经姜黄素处理的病人来源的胃癌异种移植斑马鱼模型的表型
图6是本发明实施例4中病人来源的胃癌异种移植斑马鱼模型评价姜黄素的抗癌效果
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明进行详细描述，但下例实施例不应看作对本发明范围的限制。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1：本发明的病人来源的胃癌异种移植斑马鱼模型的构建
1.胃癌组织原代细胞的分离
将病人来源的临床组织活检为胃癌的手术标本放置于生理盐水中，在无菌条件下清除肿瘤组织表面血块、坏死组织、脂肪和结缔组织，用灭菌后的眼科剪将组织剪碎，经无菌磷酸盐缓冲液(pH为7.4)洗2次，加入少量磷酸缓冲液，用弯头眼科剪反复剪切组织，直到组织成糊状，约1mm3大小。加入0.25％胰酶，37℃消化10分钟，待观察到组织块解离完全后，离心，去除胰酶。用含10％FBS(胎牛血清)的RPMI-1640培养基重悬细胞。
2.原代细胞的染色
将解离所得的原代单细胞用CM-DiI染色，染料终浓度为2μg/ml，染色时间为1小时。离心去除染料，磷酸缓冲液洗涤并重悬至细胞密度为1×104/μl。
3.细胞移植
将已染色的细胞装载到显微注射针中，将受精后48小时斑马鱼胚胎固定，用显微注射器在体视镜下，将20nl步骤(2)得到的原代细胞注射到斑马鱼胚胎卵黄囊内。
4.荧光显微镜观察
在注射后的7天内，采用荧光显微镜观察斑马鱼体内病人来源的细胞的生长、转移和扩散的情况，并拍照。
如图1所示，病人来源的胃癌细胞在斑马鱼胚胎内显示出增殖和扩散的表型。注射后4天，可见病人来源的胃癌细胞已经向腹部和头部扩散。注射后7天，可见病人来源的胃癌细胞已经扩散至斑马鱼胚胎尾部和脑部。
为了体现病人来源的胃癌异种移植(PDX)模型与人胃癌细胞系异种移植模型在指导临床胃癌患者个性化用药的准确性的差异，我们还进行了如下实验：
实施例2：4例病人来源的异种移植斑马鱼模型用于评估5-FU(5-氟尿嘧啶)临床不敏感的抗癌效果
1.安全剂量的确定
以不同浓度的5-FU处理(浸泡)受精后两天龄的斑马鱼胚胎，持续处理三天，确定胚胎安全范围内的最高5-FU浓度为4000μM。
2.药物处理斑马鱼胚胎
选用4000μM和400μM的5-FU作用于(浸泡)按实施例1方法制备得到的已注射病人来源的胃癌原代细胞的斑马鱼胚胎模型，连续作用三天，并用0.1％DMSO作为溶剂对照。
3.荧光显微镜观察抑瘤效果
观察比较处理后的斑马鱼胚胎中红色病人来源的细胞的增殖、扩散的情况。在荧光显微镜下对红色细胞进行拍照，并用Image Pro Plus软件对红色荧光强度定量，计算5-FU的抗肿瘤效果，计算公式：药物的肿瘤抑制率＝(药物处理组的荧光强度/对照组的荧光强度)*100％(见图2-3)。
病人来源的胃癌异种移植斑马鱼模型结果显示，在注射后7天时，#1、#2两例胃癌患者来源的胃癌细胞对5-FU不敏感，没有明显的抑瘤效果，而临床上该两名胃癌患者使用5-FU治疗胃癌的效果也均无明显疗效。#3、#4两例胃癌患者来源的胃癌细胞对5-FU敏感，肿瘤增殖明显被抑瘤，而临床上该两名胃癌患者使用5-FU治疗后，症状明显改善。
因此，病人来源的胃癌异种移植斑马鱼模型的药物评价结果与临床效果高度关联。
实施例3：两例人类胃癌细胞株(SGC-7901和AGS)的异种移植斑马鱼模型用于评估5-FU(5-氟尿嘧啶)的抗癌效果
1.药物处理斑马鱼胚胎
选用4000μM和400μM的5-FU作用于(浸泡)已注射胃癌细胞株(SGC-7901和AGS)的斑马鱼胚胎(按实施例1的方法构建)，连续作用三天，并用0.1％DMSO作为溶剂对照。
2.荧光显微镜观察抑瘤效果
观察比较处理后的斑马鱼胚胎中红色病人来源的细胞的增殖、扩散的情况。在荧光显微镜下对红色细胞进行拍照，并用Image Pro Plus软件对红色荧光强度定量，计算5-FU的抗肿瘤效果,，计算公式：药物的肿瘤抑制率＝(药物处理组的荧光强度/对照组的荧光强度)*100％(见图4)。
人类胃癌细胞株异种移植斑马鱼模型结果显示，在注射后7天时，两个胃癌细胞株对5-FU均比较敏感。因此，用细胞株建立的异种移植斑马鱼模型评价临床药物5-FU的抗胃癌效果与实际临床疗效之间有差异，不能用于指导胃癌的临床用药。
实施例4：病人来源的胃癌异种移植动物模型用于评估姜黄素的抗胃癌效果
1、将四组，每组四只随机抽取的受精后两天龄的斑马鱼胚胎分别置于含0.1％DMSO的姜黄素水溶液中，姜黄素浓度分别为10μM、30μM、50μM、70μM，持续处理三天，观测斑马鱼胚胎的死亡情况，确定胚胎安全范围内的最高姜黄素浓度为50μM。
2、将已注射病人来源的胃癌原代细胞的斑马鱼胚胎置于步骤1所述的10μM和50μM的含0.1％DMSO的姜黄素水溶液中，连续作用三天；将已注射人源化胃癌原代细胞的斑马鱼胚胎置于0.1％DMSO的水溶液，连续作用三天，作为溶剂对照组。
3、观察比较处理后的斑马鱼胚胎中病人来源的胃癌细胞的增殖、扩散的情况。此例胃癌细胞为原位增殖，在荧光显微镜下对人来源的胃癌细胞进行拍照(见图5)，并用Image Pro Plus软件对荧光强度定量，计算姜黄素的抗肿瘤效果(见图6)。