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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810371183.6 (22)申请日 2018.04.24 (71)申请人 孟婕 地址 810000 青海省西宁市城西区东交通 巷20号 (72)发明人 孟婕 (74)专利代理机构 淄博佳和专利代理事务所 37223 代理人 蔡士超 (51)Int.Cl. A61K 36/708(2006.01) A61K 31/353(2006.01) A61K 31/122(2006.01) A61P 25/00(2006.01) A61P 29/00(2006.01) A61P 3。
2、9/06(2006.01) (54)发明名称 具有抗神经炎症和抗氧化作用的藏边大黄 提取物 (57)摘要 具有抗神经炎症和抗氧化作用的藏边大黄 提取物， 属于药品纸杯技术领域。 其特征在于： 芦 荟大黄素和(+)-儿茶素的总质量在提取物中所 占的质量百分比为90%97%。 本提取物中藏边大 黄中芦荟大黄素和(+)-儿茶素的成分能够诱导 小胶质细胞分泌IL-10。 (+)-儿茶素和芦荟大黄 素的抗炎和抗氧化活性是由于它们有诱导IL-10 产生和分泌的能力。 这种抗炎和抗氧化作用的机 理是能使小胶质细胞产生和分泌神经保护因子 IL-10。 而IL-10相关病毒的基因传递能显著减少 神经炎症， 增强。
3、神经再生并改善转基因AD小鼠模 型的认知功能障碍。 权利要求书1页 说明书7页 CN 108379353 A 2018.08.10 CN 108379353 A 1.具有抗神经炎症和抗氧化作用的藏边大黄提取物， 其特征在于： 芦荟大黄素和(+)- 儿茶素的总质量在提取物中所占的质量百分比为90%97%。 2.根据权利要求1所述的具有抗神经炎症和抗氧化作用的藏边大黄提取物， 其特征在 于： 所述的芦荟大黄素和(+)-儿茶素的质量比为3135: 9599。 3.根据权利要求1所述的具有抗神经炎症和抗氧化作用的藏边大黄提取物， 其特征在 于： 所述的芦荟大黄素和(+)-儿茶素的总质量在提取物中所占的。
4、质量百分比为95%97%。 4.根据权利要求1所述的具有抗神经炎症和抗氧化作用的藏边大黄提取物， 其特征在 于： 提取步骤为： 1） 将藏边大黄粉和质量浓度2545%的硫酸水溶液按质量比1:47混合， 250400加 热5070min， 抽滤， 滤饼水洗后干燥； 滤液中加入乙醇回流提取2040min得到乙醇提取物； 2） 滤饼经干燥后加入乙醚回流提取100140min， 得乙醚提取液； 将乙醚提取液以碱振 荡提取， 取出的水层加盐酸至pH56， 得沉淀； 沉淀经水洗干燥后在冰醋酸或乙酸乙酯中结 晶得橙色长针状结晶； 在乙醇提取物中加入质量浓度1.2%1.8%的咖啡因水溶液得到鞣质-咖啡因水溶液。
5、； 用 乙醚溶液振荡提取， 使乙醚层和水层充分分离； 乙醚溶液提取后的水层再用氯仿溶液振荡 提取， 使氯仿层和水层充分分离； 氯仿溶液提取后的水层再用乙酸乙酯溶液振荡提取， 使乙 酸乙酯层和水层充分分离； 取出乙酸乙酯层， 结晶并干燥， 得白色结晶； 3） 将橙色长针状结晶和白色结晶混合即得。 5.根据权利要求4所述的具有抗神经炎症和抗氧化作用的藏边大黄提取物， 其特征在 于： 步骤1） 中所述的干燥温度为6575。 6.根据权利要求4所述的具有抗神经炎症和抗氧化作用的藏边大黄提取物， 其特征在 于： 步骤2） 中将乙醚提取液以碱振荡提取步骤具体为将乙醚提取液以碳酸氢钠溶液振荡提 取， 取出水。
6、层后的乙醚层再以碳酸钠溶液振荡提取， 取出水层得到乙醚层， 再经氢氧化钠溶 液振荡提取34次。 7.根据权利要求6所述的具有抗神经炎症和抗氧化作用的藏边大黄提取物， 其特征在 于： 所述的碳酸氢钠溶液的质量浓度为4.5% 5.5% ； 所述的碳酸钠溶液的质量浓度为4.5 5.5% ； 所述的氢氧化钠的质量浓度为0.2% 0.3%。 8.根据权利要求4所述的具有抗神经炎症和抗氧化作用的藏边大黄提取物， 其特征在 于： 所述的咖啡因水溶液的质量浓度1.4%1.5%。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 108379353 A 2 具有抗神经炎症和抗氧化作用的藏边大黄提取物 技术领域 0001。
7、 具有抗神经炎症和抗氧化作用的藏边大黄提取物， 属于药品纸杯技术领域。 背景技术 0002 越来越多的证据表明， 活化的小胶质细胞与慢性神经炎症和许多神经疾病的引起 密切相关， 包括阿尔茨海默病 （AD） 。 此外， 研究结果表明， 由活化的小胶质细胞介导的神经 炎症在AD的发病机制和进展中起着重要作用。 同时， 证据表明， 神经炎症并不是AD的结果， 而是该疾病的关键致病因素。 0003 药用植物被认为是抗炎剂的重要资源， 因为它们含有多种天然多酚， 其具有抗炎 和抗氧化作用。 在中国青藏高原东部流行的藏边大黄 （Rt） 是一种具有泻药， 抗菌， 解热和止 血作用的传统药物。 用不同的溶剂能。
8、从Rt提取出不同的化合物， 并具有不同的生物功能， 比 如已知的， 番泻苷 （bianthrones） 和蒽醌苷被认为是泻药的主要组分， 而游离的蒽醌则具有 抗炎作用。 发明内容 0004 本发明要解决的技术问题是： 克服现有技术的不足， 提供一种提取率高、 药效明显 的具有抗神经炎症和抗氧化作用的藏边大黄提取物。 0005 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是： 该具有抗神经炎症和抗氧化作用的 藏边大黄提取物， 其特征在于： 芦荟大黄素和(+)-儿茶素的总质量在提取物中所占的质量 百分比为90%97%。 0006 发明人发现藏边大黄中芦荟大黄素和(+)-儿茶素的成分能够诱导小胶质细胞分 泌。
9、白介素-10 （IL-10） 。 (+)-儿茶素是一种天然存在的多酚化合物， (+)-儿茶素显示出能减 少促炎细胞因子 （包括IL-1 和TNF- ） 的产生， 并增强抗炎细胞因子IL-10的产生。 (+)-儿茶 素抑制小鼠小胶质细胞BV-2 （MG6） 细胞产生促炎介质。 芦荟大黄素是植物中含有多酚结构 的主要蒽醌类成分； (+)-儿茶素和芦荟大黄素的抗炎和抗氧化活性是由于它们有诱导IL- 10产生和分泌的能力。 这种抗炎和抗氧化作用的机理是能使小胶质细胞产生和分泌神经保 护因子IL-10。 而IL-10相关病毒的基因传递能显著减少神经炎症， 增强神经再生并改善转 基因AD小鼠模型的认知功能。
10、障碍。 有利于AD发展的IL-10基因多态性过程加强了老年人炎 症与认知功能下降之间的联系。 IL-10能够通过阻止受损线粒体中复合体II的活性氧过度 生成并限制巨噬细胞IL-10能够通过抑制活化的小胶质细胞中NF- B和STAT-1信号传导途 径的激活来减少IL-1 和TNF- 的产生。 这些发现支持着IL-10可能改善与AD相关的神经炎 症， 认知功能障碍和神经变性的观点。 因此， 通过诱导小胶质细胞产生IL-10， Rt可用于抗AD 相关的过度炎症和氧化反应的药理干预。 0007 优选的， 所述的芦荟大黄素和(+)-儿茶素的质量比为3135: 9599。 优选的芦荟 大黄素和(+)-儿茶。
11、素的质量比能达到更好的抗神经炎症和抗氧化作用的效果。 0008 优选的， 所述的芦荟大黄素和(+)-儿茶素的总质量在提取物中所占的质量百分比 说 明 书 1/7 页 3 CN 108379353 A 3 为95%97%。 优选的纯度能达到更好的抗神经炎症和抗氧化作用的效果。 0009 具有抗神经炎症和抗氧化作用的藏边大黄提取物的提取步骤为： 1） 将藏边大黄粉和质量浓度2545%的硫酸水溶液按质量比1:47混合， 250400加 热5070min， 抽滤， 滤饼水洗后干燥； 滤液中加入乙醇回流提取2040min得到乙醇提取物； 2） 滤饼经干燥后加入乙醚回流提取100140min， 得乙醚提取。
12、液； 将乙醚提取液以碱振 荡提取， 取出的水层加盐酸至pH56， 得沉淀； 沉淀经水洗干燥后在冰醋酸或乙酸乙酯中结 晶得橙色长针状结晶； 在乙醇提取物中加入质量浓度1.2%1.8%的咖啡因水溶液得到鞣质-咖啡因水溶液； 用 乙醚溶液振荡提取， 使乙醚层和水层充分分离； 乙醚溶液提取后的水层再用氯仿溶液振荡 提取， 使氯仿层和水层充分分离； 氯仿溶液提取后的水层再用乙酸乙酯溶液振荡提取， 使乙 酸乙酯层和水层充分分离； 取出乙酸乙酯层， 结晶并干燥， 得白色结晶； 3） 将橙色长针状结晶和白色结晶混合即得。 0010 本发明提供的提取方法能够得到芦荟大黄素和(+)-儿茶素的质量比为3135: 9。
13、5 99， 且芦荟大黄素和(+)-儿茶素的总质量所占的质量百分比为95%97%的提取物。 0011 优选的， 步骤1） 中干燥温度为6575。 优选的干燥温度能够更好的保留芦荟大 黄素的活性。 0012 优选的， 步骤2） 中将乙醚提取液以碱振荡提取具体为将乙醚提取液以碳酸氢钠溶 液振荡提取， 取出水层后的乙醚层再以碳酸钠溶液振荡提取， 取出水层得到乙醚层， 再经氢 氧化钠溶液振荡提取34次。 优选的碱振荡提取工艺能够更加高效的提取芦荟大黄素， 且保 持较高的纯度。 0013 优选的， 所述的碳酸氢钠溶液的质量浓度为4.5% 5.5% ； 所述的碳酸钠溶液的质 量浓度为4.55.5% ； 所述。
14、的 氢氧化钠的质量浓度为0.2% 0.3%。 优选的各碱的浓度对的 提取效率更高。 0014 优选的， 所述的咖啡因水溶液的质量浓度1.4%1.5%。 优选的咖啡因水溶液浓度能 够更加高效的提取(+)-儿茶素， 且保持较高的纯度。 0015 与现有技术相比， 本发明的具有抗神经炎症和抗氧化作用的藏边大黄提取物所具 有的有益效果是： 本提取物中藏边大黄中芦荟大黄素和(+)-儿茶素的成分能够诱导小胶质 细胞分泌IL-10。 (+)-儿茶素是一种天然存在的多酚化合物， (+)-儿茶素显示出能减少促炎 细胞因子 （包括IL-1 和TNF- ） 的产生， 并增强抗炎细胞因子IL-10的产生。 (+)-儿。
15、茶素抑制 小鼠小胶质细胞BV-2细胞产生促炎介质。 芦荟大黄素是植物中含有多酚结构的主要蒽醌类 成分； (+)-儿茶素和芦荟大黄素的抗炎和抗氧化活性是由于它们有诱导IL-10产生和分泌 的能力。 这种抗炎和抗氧化作用的机理是能使小胶质细胞产生和分泌神经保护因子IL-10。 而IL-10相关病毒的基因传递能显著减少神经炎症， 增强神经再生并改善转基因AD小鼠模 型的认知功能障碍。 具体实施方式 0016 下面结合具体实施例对本发明做进一步说明， 其中实施例1为最佳实施。 0017 实施例1 1） 将藏边大黄粉和质量浓度35%的硫酸水溶液按质量比1:5混合， 320加热60min， 抽 说 明 书。
16、 2/7 页 4 CN 108379353 A 4 滤， 滤饼水洗后干燥， 干燥温度为70； 滤液中加入乙醇回流提取30min得到乙醇提取物； 2） 滤饼经干燥后加入乙醚回流提取115min， 得乙醚提取液； 将乙醚提取液以 质量浓度 为5% 的碳酸氢钠溶液振荡提取， 取出水层后的乙醚层再以质量浓度为5% 的碳酸钠溶液振 荡提取， 取出水层得到乙醚层， 再经质量浓度为0.25%的氢氧化钠溶液振荡提取3次； 取出的 水层加盐酸至pH6， 得沉淀； 沉淀经水洗干燥后在冰醋酸或乙酸乙酯中结晶得橙色长针状结 晶； 在乙醇提取物中加入质量浓度1.5%的咖啡因水溶液得到鞣质-咖啡因水溶液； 用乙醚 溶液振。
17、荡提取， 使乙醚层和水层充分分离； 乙醚溶液提取后的水层再用氯仿溶液振荡提取， 使氯仿层和水层充分分离； 氯仿溶液提取后的水层再用乙酸乙酯溶液振荡提取， 使乙酸乙 酯层和水层充分分离； 取出乙酸乙酯层， 结晶并干燥， 得白色结晶； 3） 将橙色长针状结晶和白色结晶混合即得提取物， 检测提取物中芦荟大黄素和(+)-儿 茶素的总质量所占的质量百分比为97%， 芦荟大黄素和(+)-儿茶素的质量比为33: 97。 0018 实施例2 1） 将藏边大黄粉和质量浓度30%的硫酸水溶液按质量比1:6混合， 300加热55min， 抽 滤， 滤饼水洗后干燥， 干燥温度为67； 滤液中加入乙醇回流提取25min。
18、得到乙醇提取物； 2） 滤饼经干燥后加入乙醚回流提取120min， 得乙醚提取液； 将乙醚提取液以 质量浓度 为4.8% 的碳酸氢钠溶液振荡提取， 取出水层后的乙醚层再以质量浓度为4.8% 的碳酸钠溶 液振荡提取， 取出水层得到乙醚层， 再经质量浓度为0.27%的氢氧化钠溶液振荡提取4次； 取 出的水层加盐酸至pH5.5， 得沉淀； 沉淀经水洗干燥后在冰醋酸或乙酸乙酯中结晶得橙色长 针状结晶； 在乙醇提取物中加入质量浓度1.5%的咖啡因水溶液得到鞣质-咖啡因水溶液； 用乙醚 溶液振荡提取， 使乙醚层和水层充分分离； 乙醚溶液提取后的水层再用氯仿溶液振荡提取， 使氯仿层和水层充分分离； 氯仿溶液。
19、提取后的水层再用乙酸乙酯溶液振荡提取， 使乙酸乙 酯层和水层充分分离； 取出乙酸乙酯层， 结晶并干燥， 得白色结晶； 3） 将橙色长针状结晶和白色结晶混合即得提取物， 检测提取物中芦荟大黄素和(+)-儿 茶素的总质量所占的质量百分比为95%， 芦荟大黄素和(+)-儿茶素的质量比为34: 96。 0019 实施例3 1） 将藏边大黄粉和质量浓度40%的硫酸水溶液按质量比1:4.5混合， 350加热65min， 抽滤， 滤饼水洗后干燥， 干燥温度为72； 滤液中加入乙醇回流提取35min得到乙醇提取物； 2） 滤饼经干燥后加入乙醚回流提取135min， 得乙醚提取液； 将乙醚提取液以 质量浓度 为。
20、5.2% 的碳酸氢钠溶液振荡提取， 取出水层后的乙醚层再以质量浓度为5.2% 的碳酸钠溶 液振荡提取， 取出水层得到乙醚层， 再经质量浓度为0.23%的氢氧化钠溶液振荡提取3次； 取 出的水层加盐酸至pH6， 得沉淀； 沉淀经水洗干燥后在冰醋酸或乙酸乙酯中结晶得橙色长针 状结晶； 在乙醇提取物中加入质量浓度1.4%的咖啡因水溶液得到鞣质-咖啡因水溶液； 用乙醚 溶液振荡提取， 使乙醚层和水层充分分离； 乙醚溶液提取后的水层再用氯仿溶液振荡提取， 使氯仿层和水层充分分离； 氯仿溶液提取后的水层再用乙酸乙酯溶液振荡提取， 使乙酸乙 酯层和水层充分分离； 取出乙酸乙酯层， 结晶并干燥， 得白色结晶；。
21、 3） 将橙色长针状结晶和白色结晶混合即得提取物， 检测提取物中芦荟大黄素和(+)-儿 说 明 书 3/7 页 5 CN 108379353 A 5 茶素的总质量所占的质量百分比为96%， 芦荟大黄素和(+)-儿茶素的质量比为32: 98。 0020 实施例4 1） 将藏边大黄粉和质量浓度25%的硫酸水溶液按质量比1:7混合， 250加热70min， 抽 滤， 滤饼水洗后干燥， 干燥温度为65； 滤液中加入乙醇回流提取40min得到乙醇提取物； 2） 滤饼经干燥后加入乙醚回流提取140min， 得乙醚提取液； 将乙醚提取液以 质量浓度 为4.5% 的碳酸氢钠溶液振荡提取， 取出水层后的乙醚层再。
22、以质量浓度为4.5% 的碳酸钠溶 液振荡提取， 取出水层得到乙醚层， 再经质量浓度为0.2% 的氢氧化钠溶液振荡提取3次； 取 出的水层加盐酸至pH5， 得沉淀； 沉淀经水洗干燥后在冰醋酸或乙酸乙酯中结晶得橙色长针 状结晶； 在乙醇提取物中加入质量浓度1.8%的咖啡因水溶液得到鞣质-咖啡因水溶液； 用乙醚 溶液振荡提取， 使乙醚层和水层充分分离； 乙醚溶液提取后的水层再用氯仿溶液振荡提取， 使氯仿层和水层充分分离； 氯仿溶液提取后的水层再用乙酸乙酯溶液振荡提取， 使乙酸乙 酯层和水层充分分离； 取出乙酸乙酯层， 结晶并干燥， 得白色结晶； 3） 将橙色长针状结晶和白色结晶混合即得提取物， 检测。
23、提取物中芦荟大黄素和(+)-儿 茶素的总质量所占的质量百分比为90%， 芦荟大黄素和(+)-儿茶素的质量比为35: 95。 0021 实施例5 1） 将藏边大黄粉和质量浓度45%的硫酸水溶液按质量比1:4混合， 400加热50min， 抽 滤， 滤饼水洗后干燥， 干燥温度为75； 滤液中加入乙醇回流提取20min得到乙醇提取物； 2） 滤饼经干燥后加入乙醚回流提取100min， 得乙醚提取液； 将乙醚提取液以 质量浓度 为5.5% 的碳酸氢钠溶液振荡提取， 取出水层后的乙醚层再以质量浓度为5.5% 的碳酸钠溶 液振荡提取， 取出水层得到乙醚层， 再经质量浓度为0.3%的氢氧化钠溶液振荡提取4次。
24、； 取 出的水层加盐酸至pH5， 得沉淀； 沉淀经水洗干燥后在冰醋酸或乙酸乙酯中结晶得橙色长针 状结晶； 在乙醇提取物中加入质量浓度1.2%的咖啡因水溶液得到鞣质-咖啡因水溶液； 用乙醚 溶液振荡提取， 使乙醚层和水层充分分离； 乙醚溶液提取后的水层再用氯仿溶液振荡提取， 使氯仿层和水层充分分离； 氯仿溶液提取后的水层再用乙酸乙酯溶液振荡提取， 使乙酸乙 酯层和水层充分分离； 取出乙酸乙酯层， 结晶并干燥， 得白色结晶； 3） 将橙色长针状结晶和白色结晶混合即得提取物， 检测提取物中芦荟大黄素和(+)-儿 茶素的总质量所占的质量百分比为91%， 芦荟大黄素和(+)-儿茶素的质量比为31: 99。
25、。 0022 下面通过实验验证本提取物的抗神经炎症和抗氧化作用。 0023 白细胞介素-10 （IL-10） 可抑制脂多糖 （LPS） 诱导的小胶质细胞产生多种炎症因子 和细胞受体的表达。 此外， 与野生型小鼠相比， 在IL-10缺陷型小鼠中外周注射LPS会引起显 著的认知缺陷。 IL-10通过激活其受体 （IL-10R） 而行使其作用。 结合后， 受体寡聚成由两个 配体结合亚基 （IL-10R1） 和两个辅助亚基 （IL-10R2） 组成的四聚体， 后者又激活细胞内信号 级联反应。 因此， IL-10被认为是一种有效的小神经胶质细胞负分泌调节剂。 0024 在本实验中， 使用AD患者老年斑内。
26、源性刺激物刺激小鼠脑海马切片培养物和培养 型的小胶质细胞来验证Rt潜在的抗神经炎症和抗氧化作用。 0025 2 实验 2-1. 细胞毒性测试 说 明 书 4/7 页 6 CN 108379353 A 6 将MG6 （小胶质细胞系） 种于96孔板 （510 3个细胞/孔） 过夜。 用不同浓度范围为5-500 g/ ml的Rt治疗24小时， 并用CCK-8 试剂盒 （日本Dojindo） 进行细胞活力测定。 用酶标仪在 450nm波长处读取光密度。 根据实验结果， Rt浓度为10 g/ ml对MG6细胞没有显著性毒性。 0026 2-2 小鼠脑切片实验 处死雄性C57 / BL6小鼠 （10个月龄。
27、） 并取出大脑。 所有动物均按照九州大学动物保护 和使用委员会批准的方案处理。 用震荡切片机 （VT1000S; Walzlar， Leica） 切割小鼠大脑为 200 m厚的切片， 在显微镜下仔细挑出完整的脑切片后， 放置在4的冷却的解剖缓冲液 （50HEPES-缓冲MEM， 1青霉素 - 链霉素， 10mM Tris， pH 7.2） 中孵育30分钟。 然后小心 地将切片转移到含有0.5ml培养基 （50HEPES-缓冲MEM， 25热灭活马血清， 25HBSS， 1mM L-谷氨酰胺， pH7.4） 的24-孔板中， 放置在37， 5CO2的细胞培养箱中培养。 制备后第二 天， 更换培养。
28、基， 并用本提取物治疗24h之后， 再用CGA （10nM） 和PST （10nM） 刺激脑切片。 刺激 48小时后收集脑片并裂解保存用于Western实验。 在制备脑片样品中， 用Mac1-Sap （1.3nM） 刺激部分脑片， 其目的是去除脑片中的小胶质细胞。 0027 2-3. 小胶质细胞培养 将小鼠的小神经胶质细胞系MG6 （Riken Cell Bank， Tsukuba， Japan） 培养于100 mol/ L -巯基乙醇， 10 g/ mL胰岛素， 1青霉素 - 链霉素 （Invitrogen， Grand Island， NY， USA） ， 4500mg / L葡萄糖 （I。
29、nvitrogen） 和10FBS的培养液中。 原代小胶质细胞提取是从三 天龄的C57 / BL6型小鼠的大脑皮层中分离取得， 并进行培养。 0028 2-4. 实时定量荧光PCR （Real time-PCR） 根据说明用RNAiso Plus提取总RNA。 使用QuantiTect逆转录试剂盒将提取的1000ng 的 RNA逆转录为cDNA。 在95经历共5分钟的变性过程后， 开始温度循环。 每个循环由95 变性5s， 60退火10s和30s延伸组成。 总共进行40次循环。 使用RG-3000A软件程序来进 行数据评估。 0029 2-5. 免疫印迹试验 （Western blotting。
30、） MG6细胞以5105个/mL的密度培养。 用本提取物预治疗24小时后， 在不同的时间点用 CGA （10nmol/L） 刺激MG6小胶质细胞。 并收集各个时间点的样品。 将样品在15或12十二 烷基硫酸钠 （SDS） 聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳， 之后将SDS凝胶上的蛋白质转移到硝酸纤维 素膜上。 封闭后， 将膜浸泡于目标抗体中， 在4环境下温育并过夜。 0030 2-6. 酶联免疫吸附测定 （ELISA ） 按照试剂盒提供的方案， 通过酶联免疫吸附测定 （ELISA） 试剂盒测量细胞因子IL-1 和 IL-10的表达量。 用酶标仪测定450nm处吸光度。 0031 2-7. 免疫染色 （i。
31、mmunostaining） 经过本提取物预处理的MG6小胶质细胞和没有经过Rt预处理的细胞， 都用CGA刺激48小 时后， 用4多聚甲醛固定。 然后在4环境下将它们与p65抗体温育并过夜。 之后用共焦激 光扫描显微镜拍摄荧光图像。 0032 2-8. NO2-/NO3- 化验 （NO2-/NO3- assay） MG6 细胞以510 5个/ mL的密度培养。 经本提取物预处理24小时后， 用CGA （10nmol / L） 刺激小胶质细胞72小时， 收集细胞的上清液。 通过NO2- / NO3-试剂盒 （RD Systems） 测量NO2-和NO3-的表达量。 用酶标仪测定540nm处的吸光。
32、度。 说 明 书 5/7 页 7 CN 108379353 A 7 0033 3.提取物对CGA和PST刺激后的脑切片中表达IL-1 的抑制作用。 0034 为了验证本提取物的抗神经炎症作用， 研究了本提取物对刺激后的脑切片中IL-1 表达的影响。 在用CGA （10nmol/L） 刺激48小时后， 脑切片在中IL-1 的蛋白质水平显着增 加。 本提取物显著抑制CGA刺激的脑切片中IL-1 的蛋白质水平。 PST （10nmol/L） 也显著增 加了脑切片中IL-1 的蛋白质水平， 与CGA相似。 此外， 本提取物显著抑制PST诱导的IL-1产 生。 相反， CGA和PST未能显着提高Mac1。
33、-sap处理的脑切片中IL-1 的蛋白质水平， 表明小胶 质细胞是CGA或PST处理后IL-1 的来源细胞。 0035 本提取物对CGA刺激后的小胶质细胞促炎和氧化应激表达的抑制作用。 0036 为了验证Rt能够调节抗炎细胞因子IL-10的产生。 单独的CGA刺激不能增加mRNA水 平的IL-10， 而CGA和本提取物的组合明显增加的mRNA水平IL-10， 表明本提取物能够上调 IL-10的表达。 正如预期的那样， MG6细胞中IL-10的mRNA水平的表达在12小时时显着增加， 并在用5 g/ml Rt单独处理后24小时达到峰值。 相反， MG6细胞培养基中IL-10的平均水平在 24小时。
34、时也显著增加， 并且在本提取物 （以Rt计浓度为5 g/ ml的） 处理后48小时达到峰值。 在MG6细胞和原代培养的小鼠小胶质细胞的培养基中， 用本提取物 （以Rt计浓度为5 g/ ml） 处理后48小时， IL-10分泌的平均水平显着增加。 0037 验证IL-10在本提取物对CGA刺激的小胶质细胞的抗炎作用中的潜在作用。 0038 发明人测定了CGA刺激的MG6细胞中IL-10的中和抗体对本提取物介导的TNF- 和 IL-1 表达的抑制作用。 在本提取物存在下， IL-10的中和抗体有效地抑制了CGA刺激后的 MG6细胞中mRNA水平的TNF- 和IL-1 的表达。 这些结果强烈表明IL。
35、-10在本提取物对小胶 质细胞中的抗炎特性中起的关键作用。 0039 4 发明人测定本提取物对CGA处理诱导小胶质细胞中p65核转位的影响。 本提取物 （以Rt计浓度为10 g/ml） 显著抑制CGA诱导的MG6细胞中p65的核易位。 为了研究本提取物对 活化的小胶质细胞的抗炎作用的机制， 发明人测定了CGA处理后MG6细胞的NF- B和STAT-1 活化的可能途径， 因为这两种信号传导途径可以调节TNF- ， IL-1和NO的表达。 NF- B的磷 酸化通常在30分钟时发生并达到峰值， 而STAT1的磷酸化在6小时内发生并达到峰值。 在CGA 刺激的MG6细胞中， 本提取物 （以Rt计浓度为。
36、10 g/ml） 预治疗显著的降低了NF- B磷酸化和 STAT-1磷酸化的平均水平。 此外， 在本提取物存在下， IL-10的中和抗体显著的抑制了CGA刺 激后的MG6细胞中I B 磷酸化和STAT1磷酸化的平均水平。 这些观察结果表明IL-10通过抑 制NF- B和STAT1活化途径在本提取物诱导的抗炎抗氧化的作用中起关键作用。 0040 实验中发明人证明了本提取物对CGA刺激的脑切片， MG6细胞和原代培养的小胶质 细胞有抗神经炎症作用。 以Rt计浓度为10 g/ml的本提取物显著抑制了CGA诱导脑切片中 IL-1 的产生。 同时， 本提取物也抑制CGA诱导后的小胶质细胞产生主要的神经毒。
37、性分子， TNF- ， IL-1 和NO的表达。 此外， 发明人证明本提取物能单独在mRNA和蛋白质水平上调IL- 10， 且不伴随促炎和氧化分子的上调。 IL-10的中和抗体可显著抑制本提取物的抗神经炎症 和抗氧化作用。 这些结果表明， 本提取物通过诱导IL-10的产生和分泌来抑制活化的小胶质 细胞的神经炎症和氧化反应， 其中， IL-10是小神经胶质的有效负性自分泌调节剂。 0041 由于NF- B和STAT-1是产生TNF- ， IL-1 ， NO所需的转录因子， NF- B和STAT-1信号 传导途径的激活被认为是小胶质细胞趋向神经毒性极化的关键因素。 在CGA刺激的小胶质 细胞中， 。
38、本应被本提取物预治疗所抑制的NF- B和STAT-1信号传导通路， 却因IL-10中和抗 说 明 书 6/7 页 8 CN 108379353 A 8 体的加入而活化。 这些结果表明， 通过抑制NF- B和STAT1信号传导途径， 本提取物诱导产生 的IL-10负责本提取物在活化小胶质细胞中的起抗炎和抗氧化作用。 0042 以上所述， 仅是本发明的较佳实施例而已， 并非是对本发明作其它形式的限制， 任 何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等 效实施例。 但是凡是未脱离本发明技术方案内容， 依据本发明的技术实质对以上实施例所 作的任何简单修改、 等同变化与改型， 仍属于本发明技术方案的保护范围。 说 明 书 7/7 页 9 CN 108379353 A 9 。