番荔枝多糖ASPA801对小鼠巨噬细胞和树突状细胞免疫功能的影响及作用机制.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810445490.4 (22)申请日 2018.05.04 (71)申请人 于荣敏 地址 510632 广东省广州市天河区石牌街 道黄埔大道西601号暨南大学药学院 327室 (72)发明人 于荣敏 黄春华 宋丽艳 (51)Int.Cl. A61K 31/715(2006.01) A61P 37/04(2006.01) G01N 33/577(2006.01) (54)发明名称 番荔枝多糖ASPA80-1对小鼠巨噬细胞和树 突状细胞免疫功能的影响及作用机制 (57)摘要 。

2、本发明涉及ASPA80-1是从热带水果番荔枝 成熟果实中提取的多糖。 本论文公开了ASPA80-1 增强免疫细胞免疫调节功能中的应用。 本发明的 重要之处是ASPA80-1可增强RAW264.7巨噬细胞 和树突状细胞的免疫调节功能。 内容包括： (1) ASPA80-1可促进RAW264.7细胞分化， 上调CD11c、 CD86和MHC II分子的表达， 增强吞噬功能， 促进 NO的分泌， 活化RAW264.7细胞； (2)ASPA80-1可改 变树突状细胞的形态， 上调CD86和MHC II分子的 表达， 降低吞噬功能， 促进NO的分泌， 促进树突状 细胞的成熟。 作用机制研究结果显示： A。

3、SPA80-1 可上调RAW264.7细胞p-ERK、 p-JNK、 p-P38及p- NF-B蛋白的表达， 促进NF-B的入核， 活化 RAW264 .7细胞； ASPA80-1可上调树突状细胞 TLR2、 p-JNK、 p-P38及p-NF-B蛋白的表达， 促进 NF-B的入核， 促进树突状细胞的成熟。 综上可 知： ASPA80-1具有制备免疫增强剂药物的应用前 景。 权利要求书1页 说明书10页 附图9页 CN 108379287 A 2018.08.10 CN 108379287 A 1.番荔枝多糖ASPA80-1对小鼠巨噬细胞和树突状细胞免疫功能的影响及作用机制。 2.根据权利要求。

4、1所述的应用， 其特征在于所述的体外实验所用的细胞株为RAW264.7 巨噬细胞及C57BL/6小鼠骨髓衍生树突状细胞(BMDC)。 3.根据权利要求1所述的应用， 其特征在于所述ASPA80-1为热带水果番荔枝成熟果实 中提取的多糖， 来源于暨南大学中药生物技术研究所。 4.根据权利要求1所述的应用， 其特征在于所述ASPA80-1作为免疫增强剂在增强免疫 细胞免疫调节功能中的用途。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 108379287 A 2 番荔枝多糖ASPA80-1对小鼠巨噬细胞和树突状细胞免疫功能 的影响及作用机制 技术领域 0001 本发明涉及医药技术领域， 具体涉及番荔枝。

5、多糖ASPA80-1对小鼠巨噬细胞和树突 状细胞免疫功能的影响及作用机制。 背景技术 0002 多糖主要从植物、 微生物及动物中分离而得， 不仅能为机体提供能源， 还是构成细 胞的重要成分。 多糖来源广， 含量高， 大多数多糖毒副作用小、 安全性高， 是比较理想的药物 及保健食品基料。 大量糖类结构及生物活性的研究揭示了糖类是重要的信息分子， 多糖及 其衍生物因其复杂多样的化学结构而具有独特的生物学特性， 能参与细胞间的相互识别， 具有免疫调节、 抗肿瘤、 抗氧化等作用， 受到了国内外学者的广泛关注。 越来越多具有不同 活性的多糖被发现或已用于临床， 目前国内上市的植物多糖及真菌多糖主要作为免。

6、疫增强 剂使用。 0003 番荔枝(Annona squamosa)为双子叶植物纲木兰亚纲番荔枝科番荔枝属植物。 成 熟的番荔枝果实为圆球状或心状圆锥形聚合浆果， 直径5-10厘米； 果皮呈黄绿色， 无毛， 表 面有白色粉霜。 番荔枝果实富含糖类， 氨基酸， 蛋白质， 维生素， 矿物质和粗纤维等； 果肉呈 乳白色， 鲜美香甜， 口感独特， 被誉为 “南国珍果” 。 据 中国中药资源志要 记载， 其根、 叶、 果 实及种子皆可入药。 番荔枝的根， 性味苦、 寒， 具有清热解毒、 解郁、 止血的功效， 可用于治疗 痢疾和精神抑郁； 其叶， 性味苦、 涩、 凉， 具有收敛、 解毒的功效， 可用于小儿。

7、脱肛及恶疮肿 毒； 其果实、 种子可用于疮毒， 杀虫。 据 中华本草 记载， 番荔枝具有补脾胃， 清热解毒， 杀虫 之功效。 现代药理研究中发现番荔枝具有抗肿瘤、 杀虫、 抑菌、 降血糖、 抗氧化等药理活性。 0004 巨噬细胞及树突状细胞是机体重要的免疫细胞， 不但能对抗原进行加工、 处理及 呈递、 激活淋巴细胞免疫应答、 清除病原体， 还能识别入侵机体的外源性病原体并加以吞噬 或通过产生毒性分子及细胞因子进行消灭， 在特异性及非特异性免疫中发挥着重要的作 用。 因此， 可以将巨噬细胞和树突状细胞作为切入点， 研究多糖对巨噬细胞和树突状细胞免 疫调节功能的影响， 进而研究多糖的免疫调节活性。。

8、 0005 中医理论认为， 脾胃乃后天之本， 气血生化之源， 胃主受纳， 脾主运化， 是人体五脏 六腑气机运动之枢纽。灵枢五邪 记载：“邪在脾胃， 则病肌肉痛” ， 即脾胃虚弱， 会导致多 种病证， 说明机体的体质强弱， 与脾胃的功能正常与否关系极大。 而且，内经 记载：“五味 人胃， 甘先入脾， 脾欲甘” ， 甘有补益、 和中、 缓急的作用。 据 中华本草 中记载， 番荔枝功能 主治补脾胃， 清热解毒， 杀虫。 因此， 我们从番荔枝中提取的多糖， 属甘味， 具有补益、 和中、 缓急， 增强免疫调节能力， 增强体质之功效。 0006 本发明所涉及的ASPA80-1是通过酸提取法从番荔枝果实中提。

9、取的多糖， 文献调研 显示， 尚未见番荔枝多糖ASPA80-1增强免疫调节作用的研究报道。 发明内容 说 明 书 1/10 页 3 CN 108379287 A 3 0007 本发明的目的在于提供一种番荔枝多糖ASPA80-1在制备免疫增强剂药物中的应 用。 0008 本发明是通过如下的技术方案来实现的： 通过形态学观察、 中性红实验、 激光共聚 焦、 Griess法研究ASPA80-1对RAW264.7巨噬细胞的活化作用； 采用形态学观察、 流式细胞 术、 Griess法研究ASPA80-1促进树突状细胞成熟； 采用Western blotting法研究ASPA80-1 对 RAW264.7。

10、巨噬细胞及树突状细胞中MAPKs及NF- B信号通路的影响， 探究其作用机制。 0009 本发明相对于现有技术有益效果在于： 0010 (1)首次进行番荔枝多糖ASPA80-1对RAW264.7巨噬细胞免疫调节功能影响的研 究， 发现ASPA80-1可通过改变RAW264.7巨噬细胞的形态， 上调CD11c、 CD86和MHC II共刺激 分子及抗原提呈分子的表达， 增强吞噬功能， 促进NO的分泌， 活化RAW264.7巨噬细胞， 其作 用机制可能与上调RAW264.7巨噬细胞p-ERK、 p-JNK、 p-P38及p-NF- B蛋白的表达， 促进NF- B的入核有关。 0011 (2)首次进。

11、行番荔枝多糖ASPA80-1对树突状细胞成熟影响的研究， 发现ASPA80-1 可改变树突状细胞的形态， 上调CD86和MHC II共刺激分子及抗原提呈分子的表达， 降低吞 噬功能， 促进NO的分泌， 促进树突状细胞的成熟， 其作用机制可能与上调树突状细胞TLR2、 p-JNK、 p-P38及p-NF- B蛋白的表达， 促进NF- B的入核有关。 0012 本发明为番荔枝多糖的开发利用提供理论基础与实验依据， 对研制新的免疫增强 剂具有重要意义。 附图说明 0013 图1为实施例1中ASPA80-1对RAW264.7巨噬细胞形态的影响。 0014 图2为实施例2中ASPA80-1对RAW264。

12、.7巨噬细胞CD11c、 CD86及MHC II表达的影响。 0015 图3为实施例3中中性红吞噬实验检测ASPA80-1对RAW264.7巨噬细胞吞噬功能的 影响。 0016 图4为实施例4中FITC-dextran吞噬实验检测ASPA80-1对RAW264.7巨噬细胞吞噬 功能的影响。 0017 图5为实施例5中Griess法检测ASPA80-1对RAW264.7巨噬细胞分泌NO的影响。 0018 图6为实施例6中免疫印迹分析检测ASPA80-1对RAW264.7巨噬细胞MAPKs信号通路 蛋白的影响。 0019 图7为实施例6中免疫印迹分析检测ASPA80-1对RAW264.7巨噬细胞N。

13、F- B信号通路 蛋白的影响。 0020 图8为实施例7中ASPA80-1对树突状细胞形态的影响。 0021 图9为实施例8中MTT法检测ASPA80-1对树突状细胞活力的影响。 0022 图10为实施例9中流式细胞术检测ASPA80-1对树突状细胞CD86及MHC II表达的影 响。 0023 图11为实施例10中流式细胞术检测ASPA80-1对树突状细胞吞噬功能的影响。 0024 图12为实施例11中Griess法检测ASPA80-1对树突状细胞分泌NO的影响。 0025 图13为实施例12中免疫印迹分析检测ASPA80-1对树突状细胞MAPKs信号通路的影 响。 说 明 书 2/10 页。

14、 4 CN 108379287 A 4 0026 图14为实施例12中免疫印迹分析检测ASPA80-1对树突状细胞NF- B信号通路的影 响。 0027 图15为实施例12中免疫印迹分析检测ASPA80-1对树突状细胞TLR2及TLR4蛋白的 影响。 具体实施方式： 0028 下面结合技术方案和图表详细说明本发明的具体实施例。 0029 以下实验所用的ASPA80-1是由暨南大学中药生物技术研究所提供。 0030 实施例1 0031 ASPA80-1对RAW264.7巨噬细胞形态的影响 0032 1)RAW264.7细胞用高糖DMEM培养基(含100U/mL青霉素、 0.1mg/mL链霉素和 。

15、10 胎牛血清)置于细胞培养箱中(37、 5CO2)静置培养。 六孔板每孔铺上约占孔底面积20 的RAW264.7细胞。 过夜贴壁后， 弃去旧培养基， 然后六个孔依次设置为NC、 11.11 g/mL ASPA80-1、 33.33 g/mL ASPA80-1、 100 g/mL ASPA80-1、 300 g/mL ASPA80-1及900 g/mL ASPA80-1。 将板置于细胞培养箱中(37、 5CO2)培养。 0033 2)在倒置相差显微镜下观察细胞的形态变化并拍照。 0034 形态观察结果： 倒置显微镜观察番荔枝多糖ASPA80-1(11.11、 33.33、 100、 300及 。

16、900 g/mL)作用RAW264.7巨噬细胞24h后的形态变化。 如图1所示， 阴性对照组的RAW264.7 巨噬细胞形态小， 少有突起， 主要呈圆形， 部分呈梭形， 维持着RAW264.7巨噬细胞的正常形 态。 与阴性对照组相比， ASPA80-1处理组细胞形态有明显的变化。 RAW264.7巨噬细胞呈树突 样分化， 细胞周围伸出的树枝状突起增多， 体积增大， 细胞呈星形或者不规则形态， 出现树 突状细胞形态的细胞比例随多糖浓度增加而增加。 ASPA80-1改变RAW264.7巨噬细胞的形态 可能与巨噬细胞的活化有关， 活化的巨噬细胞往往伴随着吞噬功能、 抗原提呈等免疫调节 功能增强。 0。

17、035 实施例2 0036 ASPA80-1对RAW264.7巨噬细胞CD11c、 CD86及MHC II表达的影响 0037 收集RAW264.7巨噬细胞， 小心吹打成单细胞悬液， 吸取10 L于细胞计数板上计数， 调整细胞密度为3105cells/mL， 接种于12孔板， 每孔1mL细胞悬液， 置于细胞培养箱中培 养， 使其贴壁。 次日， 弃除旧培养基后， 分别加入DMEM完全培养基或一系列浓度的番荔枝多 糖溶液2mL(终浓度分别为31.25、 62.5、 125、 250及500 g/mL)， 于37， 5CO2培养箱中继续 培养48h后， 收集细胞， 1500rpm离心5min， PB。

18、S洗1次。 然后分别加入荧光标记的单克隆抗体 FITC-CD11c、 APC-CD86及PE-MHC II， 在4下避光孵育30min， PBS 洗3次后， 加入400 L PBS 重悬细胞， 于流式细胞检测仪测定细胞表面分子的表达。 0038 结果显示： 通过流式细胞术检测RAW264.7巨噬细胞抗原提呈相关分子CD11c、 CD86 及MHC II的表达。 如图2所示， ASPA80-1(100、 300及900 g/mL)处理RAW264.7巨噬细胞48h 后， RAW264.7巨噬细胞表面CD11c、 CD86及MHC II的表达上调， 且具有一定的剂量依赖性。 0039 实施例3 0。

19、040 中性红吞噬实验检测ASPA80-1对RAW264.7巨噬细胞吞噬功能的影响 0041 收集RAW264.7巨噬细胞， 小心吹打成单细胞悬液， 调整RAW264.7巨噬细胞密度为 说 明 书 3/10 页 5 CN 108379287 A 5 1x105 cells/mL， 接种于96孔细胞板， 每孔100 L细胞悬液， 使其贴壁。 次日， 弃除旧培养基 加入不同浓度的番荔枝多糖溶液200 L， 正常组加入等体积的完全培养基， 对照组则加入1 g/mL 的LPS， 每组分别设置3个复孔。 加药后， 于37， 5CO2培养箱中继续培养24h。 吸出细 胞培养液， 每孔加入0.1中性红溶液1。

20、00 L， 于37， 5CO2培养箱继续培养20min， 弃除中 性红溶液， 用预温PBS洗涤3次， 加入200 L酸乙醇裂解液， 裂解1h， 于酶标仪540 nm处检测OD 值。 0042 结果显示： 通过中性红实验考察ASPA80-1对RAW264.7巨噬细胞吞噬中的影响。 如 图3 所示， 番荔枝多糖ASPA80-1能增强RAW264.7巨噬细胞吞噬中性红的能力， 且随着剂量 的增加， 吞噬能力也增强。 与对照组相比， ASPA80-1在剂量为100-900 g/mL时， 可明显增强 RAW264.7巨噬细胞的吞噬能力。 0043 实施例4 0044 FITC-dextran吞噬实验检测。

21、ASPA80-1对RAW264.7巨噬细胞吞噬功能的影响 0045 收集RAW264.7巨噬细胞， 制备成单细胞悬液， 调整细胞密度为1.5105cells/mL， 每孔 200 L细胞悬液接种于激光共聚焦皿的小孔内， 加入之前先用培养基进行润湿， 置于 细胞培养箱中培养， 使其贴壁。 次日， 弃除旧培养基， 加入一系列浓度番荔枝多糖溶液200 L (终浓度分别为33.33、 100及300 g/mL)和LPS(1 g/mL)， 阴性对照组则加入等体积的完全培 养基。 作用24h后， 加入终浓度为1mg/mL FITC-Dextran(40000Da)， 于37， 5CO2培养箱中 继续培养1。

22、h。 1h后， PBS洗两遍， 加入4多聚甲醛室温固定20min， PBS再次洗涤三次， DAPI室 温标记5min后， PBS洗涤2次， 于激光共聚焦上观察细胞吞噬FITC-dextran 荧光颗粒的情 况。 0046 结果显示： 通过激光共聚焦观察了RAW264.7巨噬细胞对FITC-dextran荧光颗粒的 吞噬情况。 如图4所示， ASPA80-1刺激RAW264.7巨噬细胞24h后， 多糖组的绿色荧光较未处理 组强， 表明ASPA80-1在33.33-300 g/mL能增强RAW264.7巨噬细胞的吞噬能力， 与吞噬中性 红的结果一致。 0047 实施例5 0048 Griess法检。

23、测ASPA80-1对RAW264.7巨噬细胞分泌NO的影响 0049 收集RAW264.7巨噬细胞， 制备成单细胞悬液， 调整细胞密度为1106cells/mL， 均 匀的接种在96孔板内， 每孔100 L细胞悬液， 置于细胞培养箱中培养， 使其贴壁。 次日， 弃除 旧培养基后， 加入不同浓度的番荔枝多糖溶液200 L(终浓度分别为11.11、 33.33、 100、 300 及900 g/mL)或1 g/mL的LPS溶液， 正常对照组则加入等体积的完全培养基。 于37， 5 CO2培养箱中培养24h后， 取出96孔板， 于操作台内收集细胞的上清液。 根据NO试剂盒的说明 书测定NO的含量。 。

24、0050 结果显示： Griess法检测番荔枝多糖ASPA80-1处理RAW264.7巨噬细胞24h后分泌 NO 的情况。 如图5所示， ASPA80-1能促进RAW264.7巨噬细胞NO的产生且具有剂量依赖性。 与 正常对照组相比， ASPA80-1在100-900 g/mL的浓度范围内具有显著性差异。 0051 实施例6 0052 免疫印迹分析检测ASPA80-1对RAW264.7巨噬细胞MAPKs及NF- B信号通路蛋白的 影响 0053 (1)总蛋白的提取 说 明 书 4/10 页 6 CN 108379287 A 6 0054 收集RAW264.7巨噬细胞， 小心吹打成细胞悬液， 吸。

25、取10 L于细胞计数板上计数， 调 整细胞密度为2106cells/mL， 接种于6孔板， 每孔1mL细胞悬液， 置于培养箱中培养， 使其 贴壁。 次日， 弃除旧培养基后， 分别加入DMEM完全培养基或一系列浓度的番荔枝多糖溶液 2mL(终浓度分别为3.7、 11.11、 33.33、 100及300 g/mL)， 于37， 5CO2培养箱中继续培养 8h。 取出6孔板， 弃除旧培养基， 预冷的PBS洗1次， 每孔加入100 L含1PMSF 及1Na2VO3的 SDS细胞裂解液， 吹打混匀， 冰上裂解5min， 期间多次吹打混匀。 收集细胞裂解液于1.5mL的 EP管， 超声3次， 每次5s，。

26、 使其裂解完全。 然后置于4， 调整转速为12000rpm， 离心10min， 吸 取上层的液体， 即可得到总蛋白。 0055 (2)核蛋白的提取 0056 取对数生长期的RAW264.7巨噬细胞， 按2106 eells/mL的细胞密度接种于六孔 板中， 培养过夜， 加入不同浓度的番荔枝多糖， 使其终浓度分别为0、 33.33、 100及300 g/mL， 继续于37培养4h， 收集细胞， PBS洗一遍， 离心， 弃净上清， 加入200 L添加了PMSF的细胞浆 蛋白抽提试剂A。 涡旋5s， 分散细胞， 冰浴15min。 加入10 L细胞浆蛋白抽提试剂 B， 涡旋5s， 冰浴1min。 涡旋。

27、5s， 4， 12000rpm离心5min， 小心吸取上清得浆蛋白。 对于沉淀， 加入50 L添 加了PMSF的细胞核蛋白抽提试剂， 涡旋15-30s， 每隔1-2min， 涡旋15-30s， 共30min。 4， 12000rpm离心5min， 小心吸取上清得核蛋白。 0057 (3)蛋白定量 0058 按照BCA蛋白定量试剂盒的说明书进行操作， 按1 50的比例将B液和A液混合成BCA 工作液， 每孔200 L加入到96孔板中。 再依次加入蛋白标准品及目的蛋白待测样品， 于37 生化培养箱中反应30min， 于酶标仪562nm检测OD值， 根据标准曲线调整蛋白样品的浓度， 使 其一致， 加。

28、入相应体积的5buffer， 涡旋混匀后， 煮沸10min使其变性， 于-20的条件下保 存备用。 0059 (4)电泳： 0060 1)制备凝胶： 根据目的蛋白分子量的大小， 配制相应浓度的凝胶， 配方如下所示。 0061 表1.SDS-PAGE分离胶配方(10mL) 0062 0063 表2.SDS-PAGE浓缩胶配方(4mL) 说 明 书 5/10 页 7 CN 108379287 A 7 0064 0065 2)上样、 电泳： 安装电泳装置， 小心的把目的蛋白及预染Marker加入到相应的泳道 里， 调整电压为60V， 开始电泳， 当蛋白跑至分离胶时， 升高电压至110V， 继续电泳，。

29、 直至样品 接近凝胶板的底部。 0066 4)转膜： 电泳结束后， 准备 “三明治” ， 活化PVDF膜， 切取相应的目的蛋白胶体并置 于转膜液中。“三明治” 制备完毕， 置于转膜体系中， 接通电源， 调整电流为200mA， 在冰浴条 件下进行转膜。 0067 5)封闭： 快速取出PVDF膜， 置于盛有5脱脂奶粉封闭液的皿中， 在低转速的摇床 上封闭2h。 0068 6)孵育一抗： 封闭结束， 将PVDF膜放入杂交袋并加入相应的一抗， 一抗的稀释比例 为 1 1000， 4条件下孵育过夜。 0069 7)孵育二抗： 取出PVDF膜， 使用1TBST进行洗膜， 洗涤5次， 每次10min。 再次。

30、置于 杂交袋内， 加入相同来源二抗， 二抗的稀释比例为1 2000， 在低转速的摇床上室温孵育2h。 2h后， 取出PVDF膜， 用1TBST洗涤5次， 每次10min。 0070 8)显影： 根据ECL发光液说明书配制发光液并将其滴加在PVDF膜上， 在暗室中， 进 行压片、 显影和定影。 0071 结果显示： 0072 1)ASPA80-1作用RAW264.7巨噬细胞8h后， 对MAPKs通路的相关蛋白进行考察。 如图 6所示， ASPA80-1在3.7-300 g/mL的浓度范围内均能促使MAPKs通路中的ERK、 JNK 和P38蛋 白发生磷酸化， 上调p-ERK、 p-JNK和p-P。

31、38蛋白的表达。 结果表明ASPA80增强 RAW264.7巨噬 细胞的免疫调节功能可能与MAPKs通路中的ERK、 JNK和P38的激活有关。 0073 2)由图7可见， ASPA80-1作用RAW264.7巨噬细胞8h后p-NF- B蛋白的表达上调， 表 明ASPA80-1在3.7-300 g/mL的浓度范围内能使NF- B发生磷酸化， 增强其转录活性。 通过提 取核蛋白， 检测细胞核内的NF- B含量， 进一步考察ASPA80-1对NF- B的影响。 结果表明， ASPA80-1作用RAW264.7巨噬细胞4h后， 能上调细胞核内NF- B的表达， 说明 ASPA80-1能促 进NF- 。

32、B的入核， 启动转录。 综上， ASPA80-1增强RAW264.7巨噬细胞免疫调节功能可能与NF- B信号通路有关。 0074 实施例7 0075 ASPA80-1对树突状细胞形态的影响 0076 1)树突状细胞的体外诱导培养是根据Inaba等的方法稍微修改后进行的。 取4-6周 龄 C57BL/6小鼠， 颈椎脱臼处死后， 置于75酒精中消毒3min， 无菌条件下取出股骨和胫 骨， 用注射器吸取培养基反复冲洗骨髓腔， 过200目细胞钢筛后收集细胞悬液于15mL离心 说 明 书 6/10 页 8 CN 108379287 A 8 管， 1500rpm离心5min， 弃上清， 加入1mL Tri。

33、s-NH4Cl裂解红细胞， PBS洗2遍后， 细胞重悬于 rm GM-CSF及rm IL-4终浓度均为10ng/mL的RPMI-1640完全培养基中， 每孔3mL接种于6孔 板， 在细胞培养箱中进行培养。 第3天进行2/3量换液， 吸掉未贴壁的细胞。 第5天， 再次进行 2/3量换液， 继续培养至第6天， 轻轻吹打收集悬浮及半贴壁细胞， 即为体外诱导的树突状细 胞， 用于下一步实验。 0077 2)继续培养至第6天收集的树突状细胞接种于6孔板， 然后加入一系列浓度的番荔 枝多糖溶液ASPA80-1， 六个浓度依次设置为NC、 31.25 g/mL ASPA80-1、 62.5 g/mL ASP。

34、A80- 1、 125 g/mL ASPA80-1、 250 g/mL ASPA80-1及500 g/mL ASPA80-1。 将板置于细胞培养箱 中 (37、 5CO2)培养。 0078 3)在倒置相差显微镜下观察细胞的形态变化并拍照。 0079 形态观察结果： ASPA80-1作用树突状细胞24h后， 能使树突状细胞的形态发生变 化。 如图8可见， ASPA80-1均能改变细胞的形态， 使细胞膜向外伸展、 细胞表面长出毛刺状突 起、 体积变大， 细胞呈星形或不规则形态， 呈现典型的成熟树突状细胞形态， 表明ASPA80-1 可能促进树突状细胞的形态成熟。 0080 实施例8 0081 MT。

35、T法检测ASPA80-1对树突状细胞活力的影响 0082 收集培养至第6天的树突状细胞， 小心吹打成单细胞悬液， 调整细胞密度5 104cells/mL 接种于96孔板中， 每孔100 L细胞悬液， 分别加入不同浓度的番荔枝多糖溶液 100 L(终浓度分别为31.25、 62.5、 125、 250及500 g/mL)、 RPMI1640完全培养基或LPS(1 g/ mL) 溶液， 于37， 5CO2培养箱中培养24h后， 每孔加20 L 5mg/mL的MTT溶液， 于37， 5CO2培养箱中继续培养4h。 在3000rpm的条件下， 离心5min， 小心吸除上清， 每孔加入150 LDMSO。

36、溶解生成的甲瓒结晶， 低速振荡10min后， 于酶标仪570nm处检测OD值。 按照如下公式 求取细胞存活率： 0083 细胞存活率(Viability， )(加药组A570nm-调零孔A570nm)/(阴性对照组A570nm-调 零孔 A570nm)100 0084 结果显示： 通过MTT实验检测ASPA80-1(31.25、 62.5、 125、 250及500 g/mL)对树突 状细胞活力的影响。 如图9所示， ASPA80-1作用树突状细胞24h后能轻微促进树突状细胞的 增殖， 表明， ASPA80-1在31.25-500 g/mL的浓度范围内对树突状细胞没有细胞毒性。 0085 实施。

37、例9 0086 流式细胞术检测ASPA80-1对树突状细胞CD86及MHC II表达的影响 0087 收集培养至第六天的树突状细胞， 小心吹打成单细胞悬液， 调整细胞密度为5 105cells/mL 接种于12孔板， 每孔1mL细胞悬液， 分别加入RPMI 1640完全培养基或一系列 浓度的番荔枝多糖溶液1mL(终浓度分别为31.25、 62.5、 125、 250及500 g/mL)。 37， 5CO2 培养箱中继续培养24h后， 收集细胞， 1500rpm离心5min， PBS洗1次。 然后加入荧光标记的单 克隆抗体FITC-CD11c和APC-CD86或FITC-CD11c和PE-MHC。

38、 II进行双染， 在4下避光孵育 30min， PBS洗3次后， 加入400 L PBS重悬细胞， 通过流式细胞术测定CD86及 MHC II的表达。 0088 结果显示： 0089 通过流式细胞术检测ASPA80-1作用24h后CD11c+树突状细胞中CD86及MHC II的表 达情况， 从而进一步考察ASPA80-1能否促进DCs的成熟。 如图10所示， ASPA80-1在125、 250 说 明 书 7/10 页 9 CN 108379287 A 9 和500 g/mL的浓度下均可促进CD11c+树突状细胞表面CD86及MHC II的表达， 与正常对照组 相比具有显著性差异， 而且具有剂。

39、量依赖性。 0090 实施例10 0091 流式细胞术检测ASPA80-1对树突状细胞吞噬功能的影响 0092 收集树突状细胞， 小心吹打重悬成单细胞悬液， 调整细胞密度为以5105cells/ mL， 接种于12孔板， 每孔1mL细胞悬液， 加入1mL番荔枝多糖溶液(终浓度为250 g/mL)或LPS 溶液(终浓度1 g/mL)， 阴性对照组则加入等体积的完全培养基。 作用24h后， 加入 FITC- dextran(40000Da)并使其终浓度为1mg/mL， 于37， 5CO2培养箱中继续培养1h。 1h后PBS 洗两遍， 加入FITC荧光标记的单克隆抗体CD11c， 在4的条件下孵育3。

40、0min， 注意避光， 然后 用PBS洗涤3次， 加入400 L PBS重悬细胞， 通过流式细胞术检测吞噬情况。 0093 结果显示： 0094 通过流式细胞术检测ASPA80-1作用后树突状细胞吞噬功能的情况， 如图11所示， 经250 g/mL的ASPA80-1作用24h后， 树突状细胞的吞噬能力显著下降， 再次证明ASPA80-1 能促进树突状细胞的成熟。 0095 实施例11 0096 Griess法检测ASPA80-1对树突状细胞分泌NO的影响 0097 收集培养至第六天的树突状细胞， 制备成单细胞悬液， 吸取10 L进行计数， 调整细 胞密度为1106cells/mL， 均匀的接种。

41、在96孔板中， 每孔加入100 L细胞悬液， 同时分别加 入 100 L不同浓度的番荔枝多糖溶液(终浓度分别为31.25、 62.5、 125、 250及500 g/mL) 或 LPS溶液(终浓度为1 g/mL)， 正常对照组则加入等体积的完全培养基。 于37， 5CO2培养 箱中培养24h后， 取出96孔板， 3000rpm离心5min。 离心完成后， 于操作台内收集细胞的上清 液。 根据NO试剂盒的说明书测定NO的含量。 0098 结果显示： 检测了不同浓度的ASPA80-1处理树突状细胞24h后其分泌NO的情况。 如 图12所示， 与正常对照组相比， ASPA80-1在浓度为31.25-。

42、500 g/mL时， 能显著增强树突状细 胞产生NO的能力。 ASPA80-1能剂量依赖性地促进树突状细胞中NO的分泌， 表明 ASPA80-1可 促进树突状细胞的成熟， 从而发挥免疫调节功能。 0099 实施例12 0100 免疫印迹分析检测ASPA80-1对树突状细胞TLR2、 TLR4、 MAPKs及NF- B信号通路的 影响 0101 (1)总蛋白的提取 0102 收集树突状细胞， 小心吹打成单细胞悬液， 吸取10 L于细胞计数板上计数， 调整细 胞密度为2106cells/mL， 接种于6孔板， 每孔1mL细胞悬液。 称取番荔枝多糖， 加入培养基 溶解， 过0.22 m膜， 得到1m。

43、g/mL的多糖母液。 吸取母液进行二倍稀释， 得到一系列浓度的番 荔枝多糖溶液(浓度分别为62.5、 125、 250、 500及1000 g/mL)， 每孔加入1mL相应的番荔枝多 糖溶液， 使得番荔枝多糖溶液的终浓度分别为31.25、 62.5、 125、 250及500 g/mL， 加入含细 胞因子的完全培养基作为正常对照组。 于细胞培养箱中培养30min。 收集各组细胞于不同的 离心管， 预冷的PBS洗1次， 4， 1500rpm的条件下离心5min， 弃除上清液， 每孔加入100 L含 1PMSF及1Na2VO3的SDS细胞裂解液， 吹打混匀， 冰上裂解5min， 期间多次吹打混匀，。

44、 超声3 次， 每次5s， 使其裂解完全。 然后12000rpm离心10min， 吸取上层的液体， 即可得到总蛋白。 说 明 书 8/10 页 10 CN 108379287 A 10 0103 (2)核蛋白的提取 0104 收集树突状细胞， 小心吹打成单细胞悬液， 吸取10 L于细胞计数板上计数， 调整细 胞密度为2106cells/mL， 接种于6孔板， 每孔1mL细胞悬液。 称取番荔枝多糖， 加入培养基 溶解， 过0.22 m滤膜， 得到1mg/mL的多糖母液。 吸取母液进行二倍稀释， 得到一系列浓度的 番荔枝多糖溶液(浓度分别为250及500 g/mL)， 每孔加入1mL相应的番荔枝多。

45、糖溶液， 使得 番荔枝多糖溶液的终浓度分别为125及250 g/mL， 加入含细胞因子的完全培养基作为正常 对照组。 于细胞培养箱中培养4h。 收集细胞， PBS洗一遍， 离心， 弃上清， 加入 200 L添加了 PMSF的细胞浆蛋白抽提试剂A。 涡旋5s， 分散细胞， 冰浴15min后再加入 10 L细胞浆蛋白抽 提试剂B， 涡旋5s， 冰浴1min。 涡旋5s， 4， 12000rpm离心5min， 小心吸取上清得浆蛋白。 对于 沉淀， 加入50 L添加了PMSF的细胞核蛋白抽提试剂， 涡旋 15-30s， 每隔1-2min， 涡旋15- 30s， 共30min。 4， 12000rpm离。

46、心5min， 小心吸取上清得核蛋白。 0105 (3)蛋白定量 0106 按照BCA蛋白定量试剂盒的说明书进行操作， 按1 50的比例将B液和A液混合成BCA 工作液， 每孔200 L加入到96孔板中。 再依次加入蛋白标准品及目的蛋白待测样品， 于37 生化培养箱中反应30min， 于酶标仪562nm检测OD值， 根据标准曲线调整蛋白样品的浓度， 使 其一致， 加入相应体积的5buffer， 涡旋混匀后， 煮沸10min使其变性， 于-20的条件下保 存备用。 0107 (4)电泳： 0108 1)制备凝胶： 根据目的蛋白分子量的大小， 配制相应浓度的凝胶， 配方表3和表4所 示。 0109 。

47、表3.SDS-PAGE分离胶配方(10mL) 0110 0111 表4.SDS-PAGE浓缩胶配方(4mL) 0112 0113 2)上样、 电泳： 安装电泳装置， 小心的把目的蛋白及预染Marker加入到相应的泳道 里， 调整电压为60V， 开始电泳， 当蛋白跑至分离胶时， 升高电压至110V， 继续电泳， 直至样品 说 明 书 9/10 页 11 CN 108379287 A 11 接近凝胶板的底部。 0114 4)转膜： 电泳结束后， 准备 “三明治” ， 活化PVDF膜， 切取相应的目的蛋白胶体并置 于转膜液中。“三明治” 制备完毕， 置于转膜体系中， 接通电源， 调整电流为200mA。

48、， 在冰浴条 件下进行转膜。 0115 5)封闭： 快速取出PVDF膜， 置于盛有5脱脂奶粉封闭液的皿中， 在低转速的摇床 上封闭2h。 0116 6)孵育一抗： 封闭结束， 将PVDF膜放入杂交袋并加入相应的一抗， 一抗的稀释比例 为 1 1000， 4条件下孵育过夜。 0117 7)孵育二抗： 取出PVDF膜， 使用1TBST进行洗膜， 洗涤5次， 每次10min。 再次置于 杂交袋内， 加入相同来源二抗， 二抗的稀释比例为1 2000， 在低转速的摇床上室温孵育2h。 2h后， 取出PVDF膜， 用1TBST洗涤5次， 每次10min。 0118 8)显影： 根据ECL发光液说明书配制发光液。