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1、(10)申请公布号 CN 102293770 A (43)申请公布日 2011.12.28 CN 102293770 A *CN102293770A* (21)申请号 201110139209.2 (22)申请日 2011.05.25 A61K 31/45(2006.01) A61K 31/351(2006.01) A61K 31/382(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61P 19/00(2006.01) A61P 19/08(2006.01) (71)申请人 温州医学院 地址 325035 浙江省温州市茶山高教园区 (72)发明人 吴建章 吴晓凯 李校堃 黄谈笑。
2、 梁广 杨全志 赵承光 魏晓炎 陆正高 彭景 邱君妍 姜鑫 夏梦明 王亚男 (54) 发明名称 新型成纤维细胞生长因子受体酪氨酸激酶抑 制剂 (57) 摘要 本发明属医药技术领域， 具体涉及以下 11 个 化合物在制备成纤维细胞生长因子受体 (FGFR) 酪氨酸激酶抑制剂药物中的应用 ： 3， 5- 二 (2， 4- 二氯苯亚甲基 ) 哌啶 -4- 酮 ； 3， 5- 二 (2- 氯苯 亚甲基 ) 哌啶 -4- 酮 ； 3， 5- 二 (2- 溴苯亚甲基 ) 哌啶 -4- 酮 ； 3， 5- 二 (3， 4- 二氟苯亚甲基 ) 哌 啶 -4- 酮 ； 3， 5- 二 (3- 氟苯亚甲基 ) 哌。
3、啶 -4- 酮 ； 3， 5- 二 (3， 4- 二羟基苯亚甲基 ) 哌啶 -4- 酮 ； 3， 5- 二 (3， 4- 二 羟 基 苯 亚 甲 基 )-1- 甲 基 哌 啶 -4- 酮 ； 3， 5- 二 (3， 4- 二羟基苯亚甲基 )- 四氢 吡喃 -4- 酮 ； 3， 5- 二 (3， 4- 二羟基苯亚甲基 )- 四 氢噻喃 -4- 酮 ； 3， 5- 二 (3， 4- 二氟苯亚甲基 )- 四 氢吡喃 -4- 酮 ； 3， 5- 二 ( 双 (2- 氯乙基 ) 氨基苯 亚甲基 )- 四氢噻喃 -4- 酮。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申。
4、请 权利要求书 2 页 说明书 7 页 附图 3 页 CN 102293770 A1/2 页 2 1.一种新型成纤维细胞生长因子受体(FGFR)酪氨酸激酶抑制剂在制备FGFR异常所引 发的相关疾病中的应用， 其中所述抑制剂为以下所述 11 个化合物 ： L50H1的分子式为C19H13Cl4NO， 化学名称为 ： 3， 5-二(2， 4-二氯苯亚甲基)哌啶-4-酮。 L50H4 的分子式为 C19H13Cl2NO， 化学名称为 ： 3， 5- 二 (2- 氯苯亚甲基 ) 哌啶 -4- 酮。L50H25 的分子式为 C19H13Br2NO， 化学名称为 ： 3， 5- 二 (2- 溴苯亚甲基 )。
5、 哌啶 -4- 酮。L50H34 的分 子式为 C19H13F4NO， 化学名称为 ： 3， 5- 二 (3， 4- 二氟苯亚甲基 ) 哌啶 -4- 酮。L50H13 的分子 式为 C19H13F2NO， 化学名称为 ： 3， 5- 二 (3- 氟苯亚甲基 ) 哌啶 -4- 酮。L50H23 的分子式为 C19H17NO5， 化学名称为 ： 3， 5- 二 (3， 4- 二羟基苯亚甲基 ) 哌啶 -4- 酮。L49H23 的分子式为 C20H19NO5， 化学名称为 ： 3， 5-二(3， 4-二羟基苯亚甲基)-1-甲基哌啶-4-酮。 L60H23的分子 式为 C19H16O6， 化学名称为 。
6、： 3， 5- 二 (3， 4- 二羟基苯亚甲基 )- 四氢吡喃 -4- 酮。L61H23 的分 子式为C19H16O5S， 化学名称为 ： 3， 5-二(3， 4-二羟基苯亚甲基)-四氢噻喃-4-酮。 L60H34的 分子式为 C19H12F4O2， 化学名称为 ： 3， 5- 二 (3， 4- 二氟苯亚甲基 )- 四氢吡喃 -4- 酮。L61H27 的分子式为 C27H30Cl4N2OS， 化学名称为 ： 3， 5- 二 ( 双 (2- 氯乙基 ) 氨基苯亚甲基 )- 四氢噻 喃 -4- 酮。 2. 根据权利要求 1 所述的应用， 其特征在于含有如权利要求 1 中所述的化合物中的一 种或几。
7、种和药学上可以接受的载体。 3.根据权利要求1所述的应用， 所述疾病的病因至少部分地是由FGFR酪氨酸激酶的突 变或过度表达而引起。 4. 根据权利要求 1 所述的应用， 所述疾病包括肿瘤和骨骼系统等疾病 ： 其中肿瘤包括 乳腺癌、 肾癌、 膀胱癌、 口腔癌、 咽喉癌、 食管癌、 胃癌、 结肠癌、 宫颈癌、 卵巢癌、 肺癌、 胰腺 癌、 皮肤癌、 肝癌、 多发性骨髓瘤、 肉瘤、 前列腺癌或脑肿瘤 ； 骨骼系统等疾病包括Autosomal dominanthypophosphataemic rickets、 Lacrimo-auriculo-dentodigital syndrome、 Kall。
8、mannsyndrome、 Apert s syndrome、 Craniosynostosis、 Osteoglophonic dysplasia、 权 利 要 求 书 CN 102293770 A2/2 页 3 Pfeiffer s syndrome、 Glioblastoma、 Crouzon s syndrome。 权 利 要 求 书 CN 102293770 A1/7 页 4 新型成纤维细胞生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂 技术领域 ： 0001 本发明属医药技术领域， 具体涉及以下 11 个化合物在制备成纤维细胞生长因子 受体 (FGFR) 酪氨酸激酶抑制剂药物中的应用 ： 3， 5-。
9、 二 (2， 4- 二氯苯亚甲基 ) 哌啶 -4- 酮 ； 3， 5- 二 (2- 氯苯亚甲基 ) 哌啶 -4- 酮 ； 3， 5- 二 (2- 溴苯亚甲基 ) 哌啶 -4- 酮 ； 3， 5- 二 (3， 4-二氟苯亚甲基)哌啶-4-酮 ； 3， 5-二(3-氟苯亚甲基)哌啶-4-酮 ； 3， 5-二(3， 4-二羟基 苯亚甲基 ) 哌啶 -4- 酮 ； 3， 5- 二 (3， 4- 二羟基苯亚甲基 )-1- 甲基哌啶 -4- 酮 ； 3， 5- 二 (3， 4-二羟基苯亚甲基)-四氢吡喃-4-酮 ； 3， 5-二(3， 4-二羟基苯亚甲基)-四氢噻喃-4-酮 ； 3， 5- 二 (3， 4。
10、- 二氟苯亚甲基 )- 四氢吡喃 -4- 酮 ； 3， 5- 二 ( 双 (2- 氯乙基 ) 氨基苯亚甲 基 )- 四氢噻喃 -4- 酮。 背景技术 ： 0002 以受体酪氨酸激酶 (RTKs) 为靶点的分子靶向抗肿瘤药物研发已成为当今生命科 学和药物科学的热点和前沿领域。研发 RTKs 抑制剂是治疗相关肿瘤的有效办法， 目前， 已 有近 120 种 RTKs 抑制剂药物陆续上市或进入临床试验阶段。因此， RTKs 已经成为新型分 子靶向抗肿瘤药物研发的重要靶点。 0003 细胞膜上的多种生长因子受体的膜内部分都属于 RTKs， 目前临床在用的多种抗肿 瘤作用的生长因子受体抑制剂中， 研究较多。
11、的是表皮生长因子受体 (EGFR)、 人血小板衍生 生长因子受体 (PDGFR)、 人血管内皮细胞生长因子受体 (VEGFR)， 而对成纤维细胞生长因子 受体 (fibroblast growth factor receptor， FGFRs) 的研究相对研究较少。 0004 成纤维细胞生长因子受体 (fibroblast growth factor receptor， FGFRs) 激酶 也是 RTKs 中的一种。碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF) 结合和 FGFR， 在胚胎发生、 发育、 血 管发生等促有丝分裂和缺血保护、 神经调节保护等非促有丝分裂生物学功能方面起重要作 用。但相继发现。
12、肿瘤等多种病变与 FGFR 异常密切相关。FGFR 突变或异常高表达会使其 FGFR 酪氨酸激酶活性异常增高， 使 bFGF/FGFR 信号系统异常活跃， 导致细胞过度增殖和血 管增生等多种病理情况发生。目前已经发现的与 FGFR 异常相关的肿瘤疾病有 ： 神经胶质 瘤、 前列腺癌、 膀胱癌、 多发性骨髓瘤、 结肠癌、 乳腺癌、 肺癌、 宫颈癌和胃癌等肿瘤。与 FGFR 异常相关的骨骼系统等其它疾病有 ： Autosomal dominant hypophosphataemic rickets、 Lacrimo-auriculo-dentodigital syndrome、 Kallmann 。
13、syndrome、 Apert s syndrome、 Craniosynostosis、 Osteoglophonic dysplasia、 Pfeiffer s syndrome、 Glioblastoma、 Crouzon s syndrome。到目前为止对此类疾病有效的治疗办法是 FGFR 抑制剂药物， 抑制异 常高水平的 FGFR 酪氨酸激酶活性。尽管已有 FGFR 抑制剂药物上市， 但是相对于其它生长 因子抑制剂来说， FGFR 抑制剂的开发正处于上升阶段， 并逐渐成为新的热点。 0005 目 前 FGFR 抑 制 剂 方 面 国 外 相 关 授 权 专 利 有 ： EP15563。
14、84B1、 EP1581531B1、 US20050075272、 US7115740 等。国内相关专利有 ： 200780047672.6、 200380106978.6 和 200780051605.1 等。这些专利中所涉及的 FGFR 抑制剂一般都为经典抑制剂， 它们一般都 是受体酪氨酸激酶的 ATP 竞争性抑制剂， 它们模拟 ATP 的结构， 作用于高度保守的 ATP 结 说 明 书 CN 102293770 A2/7 页 5 合域， 该结合域的三维结构和氨基酸序列在几乎所有的受体酪氨酸激酶家族中都是高度保 守的， 因而降低了此类药物的靶向选择性， 增加了其体内毒性， 同时也容易产生耐。
15、药性。鉴 于经典竞争性抑制剂的以上缺点， 近年来研究人员开始寻找可以克服以上缺点的新型 FGFR 抑制剂。 其中新骨架结构或者在激酶上新作用位点药物的研发是新型抑制剂研发的一个主 流方向， 本专利中涉及的这类化合物就是不同于经典抑制剂结构的， 具有全新骨架结构的 FGFR 抑制剂。 发明内容 ： 0006 本发明目的在于提供以下 13 个化合物 ： 3， 5- 二 (2， 4- 二氯苯亚甲基 ) 哌 啶 -4- 酮 ； 3， 5- 二 (2- 氯苯亚甲基 ) 哌啶 -4- 酮 ； 3， 5- 二 (2- 溴苯亚甲基 ) 哌啶 -4- 酮 ； 3， 5-二(3， 4-二氟苯亚甲基)哌啶-4-酮 。
16、； 3， 5-二(3-氟苯亚甲基)哌啶-4-酮 ； 3， 5-二(3， 4- 二羟基苯亚甲基 ) 哌啶 -4- 酮 ； 3， 5- 二 (3， 4- 二羟基苯亚甲基 )-1- 甲基哌啶 -4- 酮 ； 3， 5- 二 (3， 4- 二羟基苯亚甲基 )- 四氢吡喃 -4- 酮 ； 3， 5- 二 (3， 4- 二羟基苯亚甲基 )- 四氢噻 喃 -4- 酮 ； 3， 5- 二 (3， 4- 二氟苯亚甲基 )- 四氢吡喃 -4- 酮 ； 3， 5- 二 ( 双 (2- 氯乙基 ) 氨基 苯亚甲基 )- 四氢噻喃 -4- 酮 ； (2E)-3-(2- 氯苯基 )-1-4-(2E)-3-(2- 氯苯基 。
17、) 丙 -2- 烯 酮 苯基 丙 -2- 烯 -1- 酮 ； (2E)-3-(2- 溴苯基 )-1-4-(2E)-3-(2- 溴苯基 ) 丙 -2- 烯 酮 苯基 丙 -2- 烯 -1- 酮。以上 11 个化合物用于制备 FGFR 酪氨酸激酶抑制剂药物的应 用。 0007 本发明进一步还提供一组以此姜黄类化合物为活性成份的， 用于治疗肿瘤的药物 组合物。 0008 本发明提出的以上 11 个化合物经化学合成的方法制备得到。其结构式为 ： 0009 0010 0011 以上化合物可用于但不局限于制备治疗神经胶质瘤、 成骨肉瘤、 前列腺癌、 肺癌、 说 明 书 CN 102293770 A3/7 。
18、页 6 宫颈癌、 胃癌、 乳腺癌、 肾癌、 或结肠癌药物。 0012 本发明的有益效果为 ： 以上化合物都能够显著抑制 FGFR 四种受体中的 FGFR1 和 FGFR3 酪氨酸激酶活性， 它们的 IC50均达到到小于 15mol/L 的水平， 其中 L61H27 达到 nmol/L 的水平 ； 这些化合物的结构均为不同于经典抑制剂结构的新结构类型的 FGFR 抑 制剂， 经测定化合物 L60H23 为非 ATP 竞争性抑制剂， 该类化合物作用于 ATP 作用 “活性口 袋” 以外的活性位点， 新作用位点药物的研发有可能克服经典抑制剂药物耐药性等问题 ； 这 些化合物对 FGFR 高表达的人胶。
19、质瘤细胞 (U251)、 人成骨肉瘤细胞 (Saos-2)、 人肺癌细胞 (A549)、 人宫颈癌细胞 (HELA)， 均有不同程度的抑制细胞增殖活性， 多个化合物显示出很好 的研究前景 ； L61H27 对化合物 L61H27 对鸡胚绒毛尿囊膜 (CAM) 微血管生成有很好的抑制 作用， 对大鼠离体主动脉环血管生长也有明显的抑制作用。 0013 本发明提出的抑制剂药物组合物含有以上化合物中的一种或几种， 以及一种或多 种药学上可接受的载体。 0014 上文所述药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体， 例如 ： 稀释剂、 赋形 剂如水等， 填充剂如淀粉、 蔗糖等 ； 粘合剂如纤维素衍生物。
20、、 藻酸盐、 明胶和聚乙烯吡咯烷 酮 ； 湿润剂如甘油 ； 崩解剂如琼脂、 碳酸钙和碳酸氢钠 ； 吸收促进剂如季铵化合物 ； 表面活 性剂如十六烷醇 ； 吸附载体如高岭土和皂粘土 ； 润滑剂如滑石粉、 硬脂酸钙 / 镁、 聚乙二醇 等。另外还可以在组合物中加入其它辅剂如香味剂、 甜味剂等。 0015 本发明可以组合物的形式通过口服， 鼻吸入、 直肠或者肠胃外给药的方式施用于 需要这种治疗的患者。用于口服时， 可将其制成常规的固体制剂如片剂、 粉剂、 粒剂、 胶囊 等， 制成液体制剂如水或油悬浮剂或其它液体制剂如糖浆、 酏剂等 ； 用于肠胃外给药时， 可 将其制成注射用的溶液、 水或油性悬浮剂等。
21、。 0016 本发明药物组合物的各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备。 例如使活 性成分与一种或多种载体混合， 然后将其制成所需的剂型。 0017 下面将结合实施例及说明书附图详细说明本发明。 附图说明 ： 0018 图 1MTT 法测定化合物对神经胶质瘤细胞 (U251) 的增值抑制活性 0019 测试时每种细胞均包括 ： 空白组， 不加 bFGF 和化合物 ； 阴性组， 只加 bFGF(20ng/ mL)， 不加化合物 ； 加药测试组， 加 bFGF(20ng/mL)， 加用 DMSO 溶解的化合物， 化合物设置 1M， 5M， 10M 三个浓度。空白组和阴性组均加入与加药测试组相同。
22、体积的 DMSO。纵坐 标表示 MTT 法测定时的 OD 值。 0020 图 2MTT 法测定化合物对肺癌 (A549) 细胞的增值抑制活性 0021 测试时每种细胞均包括 ： 空白组， 不加 bFGF 和化合物 ； 阴性组， 只加 bFGF(20ng/ mL)， 不加化合物 ； 加药测试组， 加 bFGF(20ng/mL)， 加用 DMSO 溶解的化合物， 化合物设置 1M， 5M， 10M 三个浓度。空白组和阴性组均加入与加药测试组相同体积的 DMSO。纵坐 标表示 MTT 法测定时的 OD 值。 0022 图 3MTT 法测试 L61H27 对 bFGF 诱导的 A549 细胞生长抑制的。
23、时间生长曲线实验 组包括 ： 阴性组， 不加 bFGF 和化合物 ； bFGF 组， 只加 bFGF(20ng/mL)， 不加化合物 ； 加药测试 组， 加bFGF(20ng/mL)， 加用DMSO溶解的化合物， 有1M， 10M二个浓度的化合物组。 空白 说 明 书 CN 102293770 A4/7 页 7 组和阴性组均加入与加药测试组相同体积的 DMSO。分别在第 0， 3， 6 天进行测定， 把每组不 同时间点测定的 OD 值连成曲线。 0023 图 4MTT 法测试 L61H27 对 bFGF 诱导的 U251 细胞生长抑制的时间生长曲线实验 组包括 ： 阴性组， 不加 bFGF 和。
24、化合物 ； bFGF 组， 只加 bFGF(20ng/mL)， 不加化合物 ； 加药测试 组， 加bFGF(20ng/mL)， 加用DMSO溶解的化合物， 有1M， 10M二个浓度的化合物组。 空白 组和阴性组均加入与加药测试组相同体积的 DMSO。分别在第 0， 3， 6 天进行测定， 把每组不 同时间点测定的 OD 值连成曲线。 0024 图 5 化合物对 Saos-2 中 FGFR1 和 Erk1/2 磷酸化水平的影响 0025 在 6cm 培养皿中加入 Saos-2 细胞， 培养过夜， 饥饿 24h， 加 5M 的化合物 L61H27 作用 16h 后， 再加 bFGF(20ng/mL。
25、) 刺激 10min， 收蛋白， 弃去培养基， PBS 洗两遍， 加裂解 (60L/ 皿 )， 刮蛋白离心取上清， Western blotting 检测。 “其它” 代表我们所测试的其它 化合物。 0026 图 6 化合物 L61H27 对鸡胚 CAM 血管生成的抑制活性 0027 种蛋 37孵育 6 天， 从鸡蛋气室正上方打开一小口， 将滤纸置于尿囊膜上血管 密度少的位置， 加药到滤纸上 (20L/ 蛋 )， 用无菌胶布封住破损蛋壳部位 ； 24 小时后， 加 20ng/ml 的 bFGF(20L/ 蛋 ) ； 继续培养 3 天， 打开气室上蛋壳， 使上方尿囊膜尽量暴露， 用 4多聚甲醛固。
26、定半小时， 相机拍照。 具体实施方式 ： 0028 本发明在以下的实施例中进一步说明。这些实施例只是为了说明的目的， 而不是 用来限制本发明的范围。 0029 实施例 1 0030 化合物的合成通法 0031 化合物 L50H1、 L50H4、 L50H25、 L50H34、 L60H34 和 L61H27 的合成 ： 0032 将 2mmol 相应的取代苯甲醛溶于 10mL 无水乙醇中， 分别加入相应的哌啶 -4- 酮、 四氢噻喃-4-酮和四氢吡喃-4-酮各1mmol， 5-8下缓慢加入甲醇钠溶液5-10滴， 5-8反 应 5-24h 后， 用 TLC 检测反应的进行。反应完后， 加入 1-。
27、2 倍反应液体积的水， 析出黄色沉 淀， 抽滤， 30真空干燥过夜后得黄色粉末状产物， 经硅胶柱色谱纯化后得纯度均大于 98 的化合物。 0033 L50H23、 L49H23、 L60H23 和 L61H23 的合成 ： 0034 将 2mmol 相应的 3， 4- 二羟基苯甲醛溶于 10mL 无水乙醇中， 分别加入相应的哌 啶-4-酮、 1-甲基哌啶-4-酮、 四氢噻喃-4-酮和四氢吡喃-4-酮各1mmol至溶解， 通入HCl 至饱和， 加热回流反应5-10h， 用TLC检测反应的进行。 反应完后， 浓缩反应液至2毫升左右 时， 加入拌样硅胶， 经硅胶柱色谱纯化后得纯度均大于 98的化合物。
28、。 0035 L49H23 ： (3E， 5E)-3， 5-bis(3， 4-dihydroxybenzylidene)-1-methylpiperidin-4- oneBrown power， 49.5 yield， mp 270碳化变黑 .1H-NMR(DMSO)， d ： 6.923(d， J 8.4Hz， 2H， Ar-H62)， 6.875(s， 2H， Ar-H22)， 6.697(d， J 8.4Hz， 2H， Ar-H52)， 3.659(s， 4H， CH2-N-CH2).ESI-MS m/z ： 354.1(M+1)+， calcd for C20H19NO5： 353.1。
29、3. 0036 L50H1 ： (3E， 5E)-3， 5-bis(2， 4-dichlorobenzylidene)piperidin-4-one 说 明 书 CN 102293770 A5/7 页 8 0037 orange yellow power， 63.5 yield， mp 166.7 170.0 .1H-NMR(CDCl3)， d ： 1H-NMR(CDCl 3)， d ： 7.876(s， 2H， Ar-CH C2)， 7.479(d， J 1.8Hz， 2H， Ar-H 32)， 7.282(dd， J 1.8， 8.4Hz， 2H， Ar-H62)， 7.145(d， J 。
30、7.8Hz， 2H， Ar-H52)， 3.969(s， 4H， CH2-N-CH2).ESI-MS m/z ： 414.0， 412.1， 416.0(M+1)+， calcd for C19H13Cl4NO ： 413.12. 0038 L50H4 ： (3E， 5E)-3， 5-bis(2-chlorobenzylidene)piperidin-4-one 0039 light yellow power， 22.9 yield， mp 112.8 118.8 .1H-NMR(CDCl3)， d ： 1H-NMR(CDCl 3)， d ： 8.010(s， 2H， Ar-CH C2)， 7。
31、.458(d， J 9.0Hz， 2H， Ar-H 62)， 7.285 7.322(m， 4H， Ar-H32， Ar-H42)， 7.231 7.262(m， 2H， Ar-H52)， 3.659(s， 4H， CH2-N-CH2).ESI-MS m/z ： 344.1， 346.1， 345.1， 347.1(M+1)+， calcd forC19H15Cl2NO ： 344.23. 0040 L50H23 ： (3E， 5E)-3， 5-bis(3， 4-difluorobenzylidene)piperidin-4-one 0041 brownish red crystal， 31 。
32、yield， mp 81.6 84.5 .1H-NMR(DMSO)， d ： 9.563(brs， 2H， OH-4)， 9.241(brs， 2H， OH-3)， 6.807(d， J 7.8Hz， 2H， Ar-H62)， 6.805(s， 2H， Ar-H22)， 6.756(d， J 8.4Hz， 2H， Ar-H52)， 3.872(s， 4H， CH2-N-CH2).ESI-MS m/z ： 337.8(M-1)-， calcd for C19H13F4NO ： 339.34. 0042 L50H13 ： (3E， 5E)-3， 5-bis(3-fluorobenzylidene)。
33、piperidin-4-one 0043 light yellow power， 47 yield， mp116.5 122.1 .1H-NMR(CDCl3)， d ： 7.741(s， 2H， Ar-CH C2)， 7.371 7.408(m， 2H， Ar-H22)， 7.165(d， J 7.8Hz， 2H， Ar-H62)， 7.064 7.087(m， 4H， Ar-H42， Ar-H52)， 4.138(s， 4H， CH2-N-CH2).ESI-MS m/ z ： 312.1(M+1)+， calcd for C19H15F2NO ： 311.33. 0044 L50H25 ： 。
34、(3E， 5E)-3， 5-bis(2-bromobenzylidene)piperidin-4-one 0045 light yellow power， 13.28 yield， mp144.6 152.0 .1H-NMR(CDCl3)， d ： 7.903(s， 2H， Ar-CH C2)， 7.655(d， J 7.8Hz， 2H， Ar-H32)， 7.338(t， J 7.8Hz， 2H， Ar-H52)， 7.165 7.231(m， 4H， Ar-H42， Ar-H62)， 3.978(s， 4H， N-CH22)， 1.791(brs， 1H， N-H).ESI-MS m/z 。
35、： 434.03， 432.05， 436.01(M+1)+， calcd for C19H15Br2NO ： 433.14. 0046 L50H34 ： (3E， 5E)-3， 5-bis(3， 4-difluorobenzylidene)piperidin-4-one 0047 light yellow power， 60.54 yield， mp155.2 162.9 .1H-NMR(CD3)2CO)， d ： 7.588(s， 2H， Ar-CH C2)， 7.359 7.588(m， 6H， Ar-H22， Ar-H52， Ar-H62)， 4.111(s， 4H， CH2-N-CH。
36、2).ESI-MS m/z ： 348.2(M+1)+， calcd for C19H13F4NO ： 347.31. 0048 L60H23 ： (3E， 5E)-3， 5-bis(3， 4-dihydroxybenzylidene)-tetrahydropyran-4-on e 0049 Kelly power， 75.17yield， mp 253变黑碳化300lit.1H-NMR(DMSO)， d ： 9.563(brs， 2H， OH-4)， 9.241(brs， 2H， OH-3)， 6.807(d， J 7.8Hz， 2H， Ar-H62)， 6.805(s， 2H， Ar-H2。
37、2)， 6.756(d， J 8.4Hz， 2H， Ar-H52)， 4.836(s， 4H， CH2-O-CH2). 0050 ESI-MS m/z ： 339.1(M-1)-， calcd for C19H16O6： 340.33. 0051 L60H34 ： (3E， 5E)-3， 5-bis(3， 4-difluorobenzylidene)-tetrahydropyran-4-one 0052 Yellow power， 40.44 yield， mp178.05 180.3 .1H-NMR(CDCl3)， d ： 7.716(s， 2H， Ar-CH C2)， 7.057 7.14。
38、3(m， 6H， Ar-H22， Ar-H52， Ar-H62)， 4.886(s， 4H， CH2-O-CH2).ESI-MS m/z ： 338.4， 360.3(M+1)+， calcd for C19H12F4O2： 348.29. 0053 L61H23 ： (3Z， 5Z)-3， 5-bis(3， 4-dihydroxybenzylidene)-tetrahydrothiopyran- 说 明 书 CN 102293770 A6/7 页 9 4-one 0054 K e l l y p o w e r ， 2 0 . 3 7 y i e l d ，m p 2 1 0变黑碳化 223。
39、-225 lit.1H-NMR(DMSO)， d ： 6.858(d， J 7.8Hz， 2H， Ar-H62)， 6.789(s， 2H， Ar-H22)， 6.796(d， J 8.4Hz， 2H， Ar-H52)， 3.954(s， 4H， CH2-S-CH2).ESI-MS m/z ： 355.0(M-1)-， calcdfor C19H16O5S ： 356.39. 0055 L61H27 ： (3Z， 5Z)-3， 5-bis(4-(bis(2-chloroethyl)amino)benzylidene)-tetrah ydrothiopyran-4-one 0056 salmon。
40、 pink power， 1.94 yield， mp 54.6 59.7 .1H-NMR(CDCl3)， d ： (CDCl3)， d ： 7.709(s， 2H， Ar-CH C2)， 7.55(d， J 8.4Hz， 2H， Ar-H2， Ar-H6)， 6.65(d， J 8.4Hz， 2H， Ar-H3， Ar-H5)， 3.954(s， 4H， CH2-S-CH2)ESI-MS m/z ： 573.2， 571.3， 575.2(M+1)+， calcd for C27H30Cl4N2OS ： 572.42. 0057 实施例 2 0058 化合物对 FGFR1 和 FGFR3 酪。
41、氨酸激酶的抑制活性 0059 对所合成的所有化合物进行了 FGFR1 酪氨酸激酶抑制活性实验， 实验方法为 Caliper Mobility Shift Assay， 该方法采用的是以微流体芯片技术的迁移率检测技术 为核心的检测系统。实验步骤为 ： 配置 1.25x 激酶反应缓冲液 (62.5mMHEPES， pH 7.5 ； 0.001875Brij-35 ； 12.5mM MgCl2； 2.5mM DTT)和激酶反应终止液(100mM HEPES， pH 7.5 ； 0.015 Brij-35 ； 0.2 Coating Reagent#3) ； 在 5l 的 5x 浓度的化合物溶液 ( 。
42、用 DMSO 溶解， 用水稀释 10 倍 ) 中加入 10l 的 2.5x 的 FGFR1 激酶溶液 ( 在 1.25x 激酶反应缓冲 液中加激酶 )， 室温孵育 10 分钟后再加入 10l 的 2.5x 底物肽溶液 ( 在 1.25x 激酶反应 缓冲液中加 FAM 标记肽和 ATP)， 在 28下反应特定时间后加入 25l 激酶反应终止液。 在 Caliper 上测试收集数据， 对激酶活性的抑制率 (max-conversion)/(max-min)*100， “max” 为未加化合物的 DMSO 对照，“min” 为低对照。选择 20M 时活性较高的化合物测定 其 IC50， 测定 IC5。
43、0时每种样品设 5 个稀释度各 3 个复孔， 三次重复。选择对 FGFR1 抑制活性 好的化合物， 测定了其对 1M 的 FGFR3 酪氨酸激酶的抑制活性。所有活性结果见表 1。 0060 表 1 化合物对 FGFR1 等酪氨酸激酶的抑制活性 0061 说 明 书 CN 102293770 A7/7 页 10 0062 “20mol/L 时 IR( )” 代表化合物浓度为 20mol/L 时对 FGFR1 酪氨酸激酶的 抑制率 ；“/” 代表该化合物的 IC50未测定 ； 0063 实施例 3 0064 化合物对 FGFR1 高表达肿瘤细胞的增殖抑制实验 0065 通过 MTT 法测定化合物对。
44、 FGFR1 高表达神经胶质瘤细胞 (U251) 和肺癌细胞 (A549) 的细胞增殖抑制活性。细胞所用培养基为 10 (V/V) 胎牛血清的高糖 DMEM 培养 液。培养条件为 37， 5 CO2， 取对数期生长的癌细胞经胰蛋白酶液消化后， 用相应培养液 配成细胞悬液， 加入 96 孔板， 每孔 200L， 5000 个细胞 / 孔， 置培养箱内培养 24h。再用含 0.4胎牛血清的相应培养基饥饿 24h 后。吸出培养基， 再加入已经加入了药物 ( 浓度为 20g/mL) 的含 0.4胎牛血清的相应培养基， 孵育 1h 后， 加入 bFGF 使其终浓度为 20ng/ mL， 继续培养48h。。
45、 每孔加入20L(5mg/mL)MTT， 再置培养箱中培养4h， 吸掉上清液， 每孔加 入 100L 的 DMSO 置摇床上低速震荡， 10min 后在酶标仪上用 490nm 波长测 OD 值。测定时 以PBS为空白对照， bFGF为阴性对照， (bFGF+药物)为实验组， 每种药物设三个浓度(1M， 5M， 10M)， 重复三次实验， 每次做三个复孔。另外， 优选活性化合物， 进行了 bFGF 诱导的 肿瘤细胞生长抑制活性的时间生长曲线 ： 实验步骤同上 ； 加药后分别培养 0 天、 3 天和 6 天 后再进行测试。 0066 由图 1 和图 2 可知， 所有化合物对 U251 和 A549。
46、 均有不同程度的抑制生长活性， 并 且表现出较好的量效关系。由图 3 和图 4 可知， 化合物 L61H27 表现出较好的抑制细胞生长 活性， 基本没有表现出明显的细胞毒性， 该化合物具有较好的研究前景。 0067 实施例 4 0068 活性化合物对 Saos-2 肿瘤细胞 bFGF/FGFR1 信号通路的抑制 0069 研究了 L61H27 对 Saos-2 中 bFGF/FGFR1 信号通路的影响。将化合物与细胞孵育 16h后， 再加入bFGF作用10min， 提取细胞总蛋白， Western blotting检测细胞内bFGF/FGFR 信号通路中促增殖信号分子 FGFR1 和 Erk1。
47、/2 磷酸化水平的变化。测定时以 PBS 为空白对 照， bFGF 为阴性对照， (bFGF+ 药物 ) 为实验组。由图 5 可以看出， bFGF 能够增加 FGFR1 和 Erk 的磷酸化水平， 而 L61H27 能有效抑制它们的磷酸化水平。 0070 实施例 5 0071 采用鸡胚尿囊 (CAM) 实验， 测试了活性化合物 L61H27 对鸡胚绒毛尿囊膜 (CAM) 的 血管增生抑制活性。基本实验路线为 ： 选择受精卵鸡蛋， 消毒后置于温箱中孵育， 在壳膜与 尿囊膜之间形成人工气室， 滴加样品于绒毛尿囊膜上， 孵育后取出， 固定， 拍照， 观察新生血 管数量、 粗细、 长度和密度。 测定时设PBS空白对照， bFGF为阴性对照， (bFGF+活性类似物) 为实验组。由图 6 可知， bFGF 能够明显刺激血管增生， 而 L61H27 对 bFGF 诱导的鸡胚 CAM 血 管生成具有一定的抑制作用， 在 1mmol/L 时就能降低血管生成的数量， 在 10mmol/L 时抑制 作用尤为明显。 说 明 书 CN 102293770 A1/3 页 11 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102293770 A2/3 页 12 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102293770 A3/3 页 13 图 5 图 6 说 明 书 附 图 。