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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201811130056.3 (22)申请日 2018.09.27 (71)申请人 浙江大学 地址 310058 浙江省杭州市西湖区余杭塘 路866号 (72)发明人 裘云庆 楼燕 (74)专利代理机构 杭州求是专利事务所有限公 司 33200 代理人 赵杭丽 (51)Int.Cl. A61K 31/609(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 羟苯水杨胺羟基化物在制备抗肿瘤药物中 的应用 (57)摘要 本发明提供一种羟苯水杨胺羟基化物在制 。
2、备抗肿瘤药物中的应用。 本发明所述肿瘤为人肝 癌、 人结肠癌、 人乳腺癌、 人前列腺癌、 人胃癌、 人 肺癌。 本发明提供的羟苯水杨胺羟基化物是一种 对RR酶具有抑制作用的药物分子， 并具有一定的 抗肿瘤活性。 基于我们解析的RRM2晶体结构和计 算机辅助虚拟筛选， 发现该化合物羟苯水杨胺羟 基化物可以抑制RR酶。 所述羟苯水杨胺羟基化物 的结构式为： 权利要求书1页 说明书7页 附图6页 CN 109106721 A 2019.01.01 CN 109106721 A 1.一种羟苯水杨胺羟基化物在制备抗肿瘤药物中的应用， 所述羟苯水杨胺羟基化物的 结构式为： 2.根据权利要求1所述的一种羟苯。
3、水杨胺羟基化物在制备抗肿瘤药物中的应用， 其特 征在于， 所述肿瘤涉及人肝癌、 人结肠癌、 人乳腺癌、 人前列腺癌、 人胃癌、 人肺癌。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 109106721 A 2 羟苯水杨胺羟基化物在制备抗肿瘤药物中的应用 技术领域 0001 本发明属于制药领域， 涉及一种羟苯水杨胺羟基化物在制备抗肿瘤药物中的应 用。 背景技术 0002 核糖核苷酸还原酶(Ribonucleotide reductase,RR)是人体细胞DNA合成和修复 的关键酶， 其功能是将核糖核苷酸(Ribonucleotide triphosphates， NDPs)还原为脱氧核 糖核苷酸(。
4、Deoxyribonucleotide triphosphates， dNDPs)， 后者进一步被激酶磷酸化为 dNTPs， 为DNA合成提供原料。 RR酶的结构包括两个相同的大亚基(ribonuclotide reductase largesubunit M1， RRM1)和两个相同的小亚基(ribonuclotide reductase small subunit M2or M2B， RRM2或RRM2B)。 RRM1包含催化位点和两个别构调节位点， RRM2和 RRM2B包含一个双铁酪氨酰自由基中心。 RR三种亚基分别组成两类RR酶， 即RRM1-RRM2和 RRM1-RRM2B。 RR。
5、M1-RRM2主要为增殖细胞的基因组DNA复制提供dNDPs。 RRM1-RRM2B主要参与 DNA修复和线粒体DNA合成， 受p53介导的DNA损伤应答通路调控。 RRM2高表达以及RR酶活性 升高促进细胞快速增殖与肿瘤发生发展有密切关系， 因而RR酶抑制剂已经成为临床抗肿瘤 治疗的重要药物之一。 但因现有RR酶抑制剂活性低或者有明显不良反应， 新型RR酶抑制剂 的研发具有重要意义。 0003 RR是抗肿瘤药物的重要靶标之一， 其作为药物靶点早有研究， 并且已有多种小分 子化合物上市或已进行临床试验 ， 目前临床常用的RR酶抑制剂主要有吉西他滨 (Gemcitabine， Gem)和羟基脲(。
6、Hydroxyurea， HU)等。 Gem是核苷类药物， 在细胞内经激酶磷 酸化为dNDP和dNTP类似物后， 分别抑制RRM1和DNA聚合酶而发挥抗肿瘤作用， 是非小细胞肺 癌和胰腺癌等治疗的主要药物。 HU通过灭活RRM2的酪氨酰自由基和铁中心而抑制RR酶活 性， 主要用于白血病等的治疗。 除此之外， 还有目前正在临床试验的Triapine(3AP)， 其临床 试验证明在白血病的治疗中有较好效果， 但因其毒性较大， 其应用也有一定限制。 但对RR酶 具有抑制作用的药物分子仍然比较少见。 发明内容 0004 本发明的目的是提供一种羟苯水杨胺羟基化物在制备抗肿瘤药物中的应用。 所述 羟苯水杨。
7、胺羟基化物的结构式为： 0005 0006 本发明所述肿瘤为人肝癌、 人结肠癌、 人乳腺癌、 人前列腺癌、 人胃癌、 人肺癌。 0007 本发明提供的羟苯水杨胺羟基化物是一种对RR酶具有抑制作用的药物分子， 并具 有一定的抗肿瘤活性。 基于我们解析的RRM2晶体结构和计算机辅助虚拟筛选， 发现该化合 物羟苯水杨胺羟基化物可以抑制RR酶。 说 明 书 1/7 页 3 CN 109106721 A 3 附图说明 0008 图1是羟苯水杨胺(laf)及羟苯水杨胺羟基化物(OH-1)针对人肝癌细胞(HepG2细 胞)的杀伤活性。 0009 图2是羟苯水杨胺(laf)及羟苯水杨胺羟基化物(OH-1)针对。
8、人肝癌细胞(BEL-7402 细胞)的杀伤活性。 0010 图3是羟苯水杨胺(laf)及羟苯水杨胺羟基化物(OH-1)针对人肝癌细胞(Huh-7细 胞)的杀伤活性。 0011 图4是羟苯水杨胺(laf)及羟苯水杨胺羟基化物(OH-1)针对人结肠癌细胞(LoVo细 胞)的杀伤活性。 0012 图5是羟苯水杨胺(laf)及羟苯水杨胺羟基化物(OH-1)针对人乳腺癌细胞(MCF-7 细胞)的杀伤活性。 0013 图6是羟苯水杨胺(laf)及羟苯水杨胺羟基化物(OH-1)针对人乳腺癌细胞(T-47D 细胞)的杀伤活性。 0014 图7是羟苯水杨胺(laf)及羟苯水杨胺羟基化物(OH-1)针对人乳腺癌细。
9、胞(MDA- MB-231细胞)的杀伤活性。 0015 图8是羟苯水杨胺(laf)及羟苯水杨胺羟基化物(OH-1)针对人前列腺癌细胞(PC-3 细胞)的杀伤活性。 0016 图9是羟苯水杨胺(laf)及羟苯水杨胺羟基化物(OH-1)针对人胃癌细胞(SGC-7901 细胞)的杀伤活性； 0017 图10是羟苯水杨胺(laf)及羟苯水杨胺羟基化物(OH-1)针对人胃癌细胞(HGC-27 细胞)的杀伤活性。 0018 图11是羟苯水杨胺(laf)及羟苯水杨胺羟基化物(OH-1)针对人肺癌细胞(A549细 胞)的杀伤活性。 具体实施方式 0019 本发明结合附图和实施例作进一步的说明。 0020 一、。
10、 羟苯水杨胺羟基化物在抑制RR酶方面的作用 0021 实施例1羟苯水杨胺及其衍生物分子对接计算 0022 1.通过SimBioSys公司的分子对接软件eHiTS(Version 12.0,SimBioSys Inc., Canada)， 预测4个化合物与靶标RRM2结合能力大小。 0023 所述4个化合物为： 说 明 书 2/7 页 4 CN 109106721 A 4 0024 0025 2.分子对接方法 0026 小分子的准备： 使用OpenBabel 2.3.0将2D小分子转换3D结构， 以进行分子对接研 究。 0027 靶标及活性口袋定义： RRM2的晶体结构是从PDB库中获得(PDB。
11、 code:3OLJ)， 其活 性口袋的定义参照Xia Liu等发表在Biochemical Pharmacology上的文章， 即将F244, D271,R330和E334所在区域定义为活性位点。 0028 分子对接方法： 使用来自Wiley的eHiTS软件进行分子对接研究。 eHiTS一款精确、 快速的柔性分子对接软件。 eHiTS会对靶标进行自动预处理； 并且对接的小分子只需是3D结 构即可， 不必是能量最低构象。 对接时的精确度参数-accuracy设为6， 即最高精确度进行分 子对接。 分别将羟苯水杨胺及其衍生物对接到此位点以评估以其与RRM2结合能力的强弱。 0029 3.化合物的。
12、结合能力打分 0030 4个小分子的对接打分如下表1， 并依据结合能力强弱进行了排序。 0031 表1 0032 NameeHiTS-Score OH-1.mol-3.807 laf.mol-2.885 OH-2.mol-2.424 HU.mol-2.289 0033 注： eHiTS软件通过eHiTS_Score来评价小分子化合物与靶标的结合能力大小。 eHiTS_Score对应是的log(Kd)(解离常数取对数)， 值越负代表小分子化合物的结合能力越 强， 如-6相当于 M、 -9相当于nM； 数值相差为1， 结合能力相差10倍。 说 明 书 3/7 页 5 CN 109106721 A 。
13、5 0034 二、 羟苯水杨胺羟基化物在抗肿瘤方面的作用 0035 实施例2.针对人肝癌细胞的杀伤活性 0036 1.实验材料： 0037 (1)细胞株： 人肝癌细胞(HepG2细胞)(美国ATCC， 本实验室传代保存)， 培养于DMEM 培养基(含10胎牛血清)。 0038 (2)主要试剂： DMEM培养基(美国Corning公司)， 胎牛血清(美国Corning公司)， CCK-8试剂(日本同仁化学研究所)， 柳胺酚(laf， 加拿大Toronto Research Chemical公 司)， 羟苯水杨胺羟基化物(OH-1， 杭州和素化学)。 0039 (3)主要仪器： 生物安全柜(美国T。
14、hermo Fisher公司)， 二氧化碳培养箱(美国 Thermo Forma公司)， 全自动酶标仪(美国Bio-Tek公司)。 0040 2.实验方法： 0041 (1)细胞培养 0042 细胞培养于DMEM培养基(含10胎牛血清， pH 7.2)， 培养基加2mmol/L谷氨酰胺， 置于细胞培养箱中在37、 5CO2环境下培养。 0043 (2)CCK8试剂盒测定各药物的细胞毒性 0044 取HepG2细胞用胰酶消化后制备成单细胞悬液， 计数后调整细胞浓度至5104个/ mL。 取96孔培养板每孔加入100 L上述细胞悬液， 置CO2孵箱37培养24h后， 细胞贴壁且生 长良好， 加不同。
15、浓度的用培养基配制的药物100 L， 对照组加入相应体积的空白培养基， 每 组设置3个平行孔。 连续培养72h， 培养结束前2h， 每孔加入CCK8试剂10 L， 于CO2孵箱中继续 培养。 2h后自动酶标仪检测450nm各孔OD值。 计算细胞存活率： 细胞抑制率()1-(实验 孔OD均值/对照孔OD均值)100。 拟合函数求出抑制细胞生长达50时药物浓度IC50。 实验重复三次。 0045 3.实验结果 0046 实验结果见图1。 0047 结论： 羟苯水杨胺羟基化物对HepG2细胞的杀伤活性大于柳胺酚， 两者的IC50分别 是89uM和278uM， 即羟苯水杨胺羟基化物对HepG2细胞的杀。
16、伤活性约是柳胺酚的3.1倍。 0048 实施例3.针对人肝癌细胞的杀伤活性 0049 1.实验材料： 0050 人肝癌细胞(BEL-7402细胞)(美国ATCC， 本实验室传代保存)， 培养于RPMI-1640培 养基(含10胎牛血清)。 其他同实施例1。 0051 2.实验方法： 参见实施例1。 0052 3.实验结果： 0053 实验结果见图2。 0054 结论： 羟苯水杨胺羟基化物对BEL-7402细胞的杀伤活性大于柳胺酚， 两者的IC50分 别是47uM和104uM， 即羟苯水杨胺羟基化物对BEL-7402细胞的杀伤活性约是柳胺酚的2.2 倍。 0055 实施例4.针对人肝癌细胞的杀伤。
17、活性 0056 1.实验材料： 0057 人肝癌细胞(Huh-7细胞)(美国ATCC， 本实验室传代保存)， 培养于DMEM培养基(含 说 明 书 4/7 页 6 CN 109106721 A 6 10胎牛血清)。 其他同实施例1。 0058 2.实验方法： 参见实施例1。 0059 3.实验结果： 0060 实验结果见图3。 0061 结论羟苯水杨胺羟基化物对Huh-7细胞的杀伤活性大于柳胺酚， 两者的IC50分别是 43uM和174uM， 即羟苯水杨胺羟基化物对Huh-7细胞的杀伤活性约是柳胺酚的4倍。 0062 实施例5.针对人结肠癌细胞的杀伤活性 0063 1.实验材料： 0064 人。
18、结肠癌细胞(LoVo细胞)(美国ATCC， 本实验室传代保存)， 培养于RPMI-1640培养 基(含10胎牛血清)。 其他同实施例1。 0065 2.实验方法： 参见实施例1。 0066 3.实验结果： 0067 实验结果见图4。 0068 结论羟苯水杨胺羟基化物对LoVo细胞的杀伤活性大于柳胺酚， 两者的IC50分别是 137uM和200uM， 即羟苯水杨胺羟基化物对LoVo细胞的杀伤活性约是柳胺酚的1.5倍。 0069 实施例6.针对人乳腺癌细胞的杀伤活性 0070 1.实验材料： 0071 人乳腺癌细胞(MCF-7细胞)(美国ATCC， 本实验室传代保存)， 培养于RPMI-1640培。
19、 养基(含10胎牛血清)。 其他同实施例1。 0072 2.实验方法： 参见实施例1。 0073 3.实验结果 0074 实验结果见图5。 0075 结论： 羟苯水杨胺羟基化物对MCF-7细胞的杀伤活性大于柳胺酚， 两者的IC50分别 是276uM和1262uM， 即羟苯水杨胺羟基化物对MCF-7细胞的杀伤活性约是柳胺酚的4.6倍。 0076 实施例7.针对人乳腺癌细胞的杀伤活性 0077 1.实验材料： 0078 人乳腺癌细胞(T-47D细胞)(美国ATCC， 本实验室传代保存)， 培养于RPMI-1640培 养基(含10胎牛血清)。 其他同实施例1。 0079 2.实验方法： 参见实施例1。
20、。 0080 3.实验结果 0081 实验结果见图6。 0082 结论： 羟苯水杨胺羟基化物对T-47D细胞的杀伤活性与柳胺酚相当， 两者的IC50分 别是163uM和166uM。 0083 实施例8.针对人乳腺癌细胞的杀伤活性 0084 1.实验材料： 0085 人乳腺癌细胞(MDA-MB-231细胞)(美国ATCC， 本实验室传代保存)， 培养于RPMI- 1640培养基(含10胎牛血清)。 其他同实施例1。 0086 2.实验方法： 参见实施例1。 0087 3.实验结果 说 明 书 5/7 页 7 CN 109106721 A 7 0088 实验结果见图7。 0089 结论： 羟苯水杨。
21、胺羟基化物对MDA-MB-231细胞的杀伤活性大于柳胺酚， 两者的IC50 分别是108uM和132uM， 即羟苯水杨胺羟基化物对MDA-MB-231细胞的杀伤活性约是柳胺酚的 1.2倍。 0090 实施例9.针对人前列腺癌细胞的杀伤活性 0091 1.实验材料： 0092 人前列腺癌细胞(PC-3细胞)(美国ATCC， 本实验室传代保存)， 培养于DMEM培养基 (含10胎牛血清)。 其他同实施例1。 0093 2.实验方法： 参见实施例1。 0094 3.实验结果 0095 实验结果见图8。 0096 结论： 羟苯水杨胺羟基化物对PC-3细胞的杀伤活性大于柳胺酚， 两者的IC50分别是 3。
22、22uM和408uM， 即羟苯水杨胺羟基化物对PC-3细胞的杀伤活性约是柳胺酚的1.3倍。 0097 实施例10.针对人胃癌细胞的杀伤活性 0098 1.实验材料： 0099 人胃癌细胞(SGC-7901细胞)(美国ATCC， 本实验室传代保存)， 培养于RPMI-1640培 养基(含10胎牛血清)。 其他同实施例1。 0100 2.实验方法： 参见实施例1。 0101 3.实验结果 0102 实验结果见图9。 0103 结论： 羟苯水杨胺羟基化物对SGC-7901细胞的杀伤活性大于柳胺酚， 两者的IC50分 别是354uM和412uM， 即羟苯水杨胺羟基化物对SGC-7901细胞的杀伤活性约。
23、是柳胺酚的1.2 倍。 0104 实施例11.针对人胃癌细胞的杀伤活性 0105 1.实验材料： 0106 人胃癌细胞(HGC-27细胞)(美国ATCC， 本实验室传代保存)， 培养于RPMI-1640培养 基(含10胎牛血清)。 其他同实施例1。 0107 2.实验方法： 参见实施例1。 0108 3.实验结果 0109 实验结果见图10。 0110 结论： 羟苯水杨胺羟基化物对HGC-27细胞的杀伤活性大于柳胺酚， 两者的IC50分别 是237uM和316uM， 即羟苯水杨胺羟基化物对HGC-27细胞的杀伤活性约是柳胺酚的1.3倍。 0111 实施例12.针对人肺癌细胞的杀伤活性 0112。
24、 1.实验材料： 0113 人肺癌细胞(A549细胞)(美国ATCC， 本实验室传代保存)， 培养于DMEM培养基(含 10胎牛血清)。 其他同实施例1。 0114 2.实验方法： 参见实施例1。 0115 3.实验结果 0116 实验结果见图11。 说 明 书 6/7 页 8 CN 109106721 A 8 0117 结论： 羟苯水杨胺羟基化物对A549细胞的杀伤活性与柳胺酚相当， 两者的IC50分别 是206uM和190uM。 说 明 书 7/7 页 9 CN 109106721 A 9 图1 图2 说 明 书 附 图 1/6 页 10 CN 109106721 A 10 图3 图4 说 明 书 附 图 2/6 页 11 CN 109106721 A 11 图5 图6 说 明 书 附 图 3/6 页 12 CN 109106721 A 12 图7 图8 说 明 书 附 图 4/6 页 13 CN 109106721 A 13 图9 图10 说 明 书 附 图 5/6 页 14 CN 109106721 A 14 图11 说 明 书 附 图 6/6 页 15 CN 109106721 A 15 。