细胞跨膜电位的激活和监测 相关申请的交叉引用 本申请要求 2008 年 6 月 5 日提交的美国临时申请号 61/059,155 的优先权， 其公开内 容通过引用整体并入本文。技术领域
本发明涉及可用于监测和操纵细胞跨膜电压的组合物和方法。具体地， 公开了纳 米颗粒和它们在监测和操纵跨膜电压中的应用。 背景技术
细胞具有磷脂膜， 该磷脂膜用作双分子屏障， 将细胞内含物与胞外环境隔开。 通过 调节物质穿过膜的通道 （作为细胞内信号传递的功能） ， 磷脂膜维持细胞区室和胞外环境之 间必要的组成差异。正常的不可透过的磷脂膜具有静息膜电位， 其源自带正电荷和带负电 荷的离子在细胞外和细胞内区室中的不等分布。 通过响应于激活刺激来改变膜对某种离子 的渗透性， 从而允许离子沿着它们的电化学梯度向下流动， 可以改变膜电位。参见， 例如， 2006 年 3 月 8 日提交的共同拥有的和共同未决的美国申请系列号 11/371,465。细胞通过 膜电位的变化而彼此通讯。 因此， 监测细胞膜电位和它的变化允许监测细胞存活、 细胞通讯 ( 例如， 特定神经元、 肌肉和其它可兴奋细胞 ) 和细胞功能以及分化。
离子通道是在可兴奋的和不可兴奋的细胞的磷脂膜中存在的跨膜蛋白。 离子通道 允许并调节离子跨正常离子非透性的脂双层的沿着它们的电化学梯度向下运动和传导。 离 子通道激活的不同状态会为更有效的药物发现提供独特的机会， 实现状态依赖性的分子的 开发， 例如， 所述分子仅结合非传导的 ( 未激活的 ) 通道或在重复使用后其行为和结构发生 变化的通道。 希望的目的之一是， 将药物靶向表现出异常电活动性的组织， 同时保持活动组 织中的正常通道不受影响。
离子通道作为药物靶标和在离子通道安全药理学中是特别重要的。 离子通道参与 许多重要的功能， 且由生化调节的变化、 表达水平或结构突变造成的离子通道功能障碍可 以不利地影响活生物体的健康。在人类中， 遗传的或诱导的离子通道功能的变化会导致健 康的严重并发症。异常的离子通道功能或离子通道表达已经与许多治疗领域相关联， 包括 心律失常、 高血压、 癫痫、 疼痛、 囊性纤维化和偶发性共济失调。 存在对这些疾病的更有效的 离子通道调节剂药物的持续需要。
在离子通道研究中使用了许多实验方案。例如， 一种研究离子通道的方法是膜 片钳方法 (Neher, E. 等人 ,Nature (1976) 260(5554):799-802; Hamill, O. P. 等人 , Pflugers Arch. (1981) 391(2):85-100)。 尽管该技术允许对离子通道生理学做出某些详 细的生物物理学表征， 但是通量非常低， 且膜片钳仪器的使用容易性对于大规模筛选 （mass screening） 而言通常不能令人满意。 膜片钳仪器也不允许以生理学上有关的方式重复刺激 细胞来产生动作电位。离子通道高通量筛选 (“HTS” ) 的需求包括与令人满意的使用容易 性相组合的耐用 （robust） 仪器和高的信号 - 背景比。在历史上， 离子通道 HTS 与低信息容量等同， 突出了对新颖、 快速且容易的方法的需求， 在所述方法中， 可以收集关于不同细胞 类型中的膜电位变化的更有用的信息。
可靠且耐用的离子通道 HTS 试验在基于离子通道的药物发现中是重要的。离子通 道是动态蛋白， 因此需要 “感知” 它们的不同功能状态的试验。竞争结合试验尽管成功地用 于其它靶标类别， 却经常无法鉴定调节特定离子通道状态的配体。 因此， 基于细胞的功能试 验对于离子通道靶标的 HTS 而言是优选的。
用于离子通道筛选的一些 HTS 技术包括 ： 结合试验、 离子流试验、 荧光成像和电生 理学。 HTS 膜片钳技术被广泛用于研究穿过离子通道的电流。 目前， 全细胞膜片钳用于在药 物发现过程的晚期对选择的先导分子进行三道筛选 （tertiary screening） 。但是， 全细胞 膜片钳不适合最初的高通量筛选。尽管非常有效， 但是该技术是劳动密集的， 因此， 限于每 天少量数据点测量。 该低通量已经迫使使用其它更低特异性的和更低灵敏度的技术进行离 子通道靶标的高通量筛选。理想地， 耐用的 HTS 离子通道筛选方法具有高瞬时分辨力、 高灵 敏度和高信息容量， 导致低的 “假阴性” 和 “假阳性” 率。尽管有材料和方法可用于研究离 子通道， 仍需要简便、 耐用和有用的新的材料和方法。 发明内容 在一个方面， 提供了用于测定或监测跨膜电位的变化的方法， 该方法包括 ： 提供至 少一个靶细胞 ； 使所述靶标接触至少一个激活平台以形成处理过的靶标， 其中所述激活平 台包含至少一层固定化的纳米晶体， 所述纳米晶体被至少一层粘附基质覆盖 ； 刺激处理过 的靶标 ； 测定来自激活平台的发射 ； 以及将发射与跨膜电位的变化相关联。本文提供的方 法可以使用这样的激活平台， 其包含 2 层或更多层固定化的纳米晶体。例如， 激活平台可以 包含约 2 至约 15 层固定化的纳米晶体。在某些实施方案中， 激活平台可以包含约 5 至约 10 层固定化的纳米晶体。
在另一个方面， 提供了用于监测跨膜电位的方法。 所述方法包括 ： 提供至少一个靶 细胞 ； 用嵌入质膜中的纳米晶体处理所述靶标， 建立一个感知平台以形成处理过的靶标， 其 中下面的激活平台包含至少一层固定化的纳米晶体， 所述纳米晶体被至少一层粘附基质覆 盖； 刺激处理过的靶标 ； 测定来自感知平台的发射 ； 以及将发射与跨膜电位的变化 ( 或其缺 乏 ) 相关联。
在另一个方面， 提供了用于测定或监测跨膜电位的变化的方法， 其包括 : 提供至 少一个靶细胞 ； 使所述靶标接触至少一个激活平台以形成处理过的靶标， 其中所述激活平 台包含至少一层固定化的纳米晶体 ； 刺激处理过的靶标 ； 测定来自激活平台的发射 ； 以及 将发射与跨膜电位的变化相关联。
该刺激步骤可以包括光学刺激、 电刺激、 磁刺激、 化学刺激、 生物刺激、 使靶标接触 疑似能够激活离子通道的药物、 使靶标接触疑似能够抑制离子通道的药物或其组合。在某 些实施方案中， 电刺激包括使用膜片钳或施加外部电场。 在一个实施方案中， 化学刺激包括 使靶标接触钾盐或钠盐。 在某些实施方案中， 生物刺激包括使靶标接触光敏感的离子通道。
该刺激步骤可以包括 ： 将靶标维持在第一膜电位电压， 去极化或超极化靶标至第 二膜电位电压， 然后使靶标恢复至第一膜电位电压。 在某些实施方案中， 第二膜电位电压比 第一膜电位电压更正 （more positive） 。在一个实施方案中， 第二膜电位电压是正的， 且第
一膜电位电压是负的。在某些实施方案中， 第一膜电位电压和第二膜电位电压之一是约 0 mV。在一个实施方案中， 第一膜电位电压是约 -70 mV， 且第二膜电位电压是约 +40 mV。
细胞可以是真核细胞、 原核细胞、 细菌细胞、 革兰氏阳性细菌细胞、 革兰氏阴性细 菌细胞、 真菌细胞、 昆虫细胞、 鸟类细胞、 爬行动物细胞、 卵母细胞、 两翼昆虫细胞、 斑马鱼细 胞、 线虫细胞、 鱼细胞、 两栖动物细胞或哺乳动物细胞。
激活平台的结构可以是膜、 纳米丝、 图案化的基质或网。典型地， 纳米晶体是量子 点。
在某些实施方案中， 该刺激步骤包括在适合激活平台吸收的波长或波长范围照 射。刺激步骤可以包括激光照射、 水银灯照射、 氙灯照射、 卤素灯照射或 LED 照射。
使用光学检测可以进行测定发射。 光学检测包括使用照相机、 数码照相机、 视频摄 像机、 CCD 照相机、 安装在荧光显微镜上的数码照相机、 光电倍增管、 荧光计、 光度计、 显微镜 或人眼。测定步骤可以包括在单个时间点、 在多个时间点测定或检测， 或者连续检测。
在另一个方面， 提供了用于激活细胞的方法。 本文另外提供了集成的光学试验， 其 组合了光学刺激 ( 通过激活平台 ) 和细胞活性的光学记录。某些方法使用离子敏感的染料 检测细胞活性。可以采用光学记录细胞活性的任何合适的方法。因而， 本文提供的方法可 以另外包括在测定跨膜电位的变化的同时或协同地光学记录细胞活性。 在一个方面， 提供了光控激活平台， 其包含一种或多种类型的纳米材料 ( 例如， 半 导体纳米晶体 )。 在某些实施方案中， 纳米材料能够起到光学电压传感器的作用。 在其它实 施方案中， 纳米材料能够激活细胞膜电位的变化。 在某些实施方案中， 纳米材料包含纳米晶 体 ( 例如， 半导体纳米晶体 )。
在另一个方面， 提供了用于监测和操纵细胞跨膜电位的组合物， 其包含 ： 基质和激 活平台， 其中所述激活平台被安置在基质表面上， 其中所述激活平台包含一层或多层固定 化的纳米晶体。在某些方面， 激活平台包含 2 种或更多种类型的纳米晶体， 其中所述 2 种或 更多种类型具有不同的光学性质。纳米晶体可以是半导体纳米晶体。每个纳米晶体可以包 含半导体核心。所述半导体核心可以另外包含在核心上的涂层。所述涂层可以包含亲水化 合物。各纳米晶体可以另外包含在核心和涂层之间的半导体壳， 诸如带正电荷的化合物或 带负电荷的化合物。 纳米晶体可以包含表面涂层， 其中所述涂层包含这样的材料， 其具有一 个或多个巯基、 磺酸酯基和羧酸酯基。 所述涂层可以包含 1- 硫甘油、 巯基乙酸、 2- 巯基乙基 磺酸酯、 聚 ( 丙烯酸 ) 或其衍生物、 硫辛酸、 二氢硫辛酸、 聚乙酰亚胺、 半胱胺、 聚烯丙胺、 组 氨酸、 聚组氨酸、 赖氨酸或聚赖氨酸。激活平台可以另外包含粘附基质， 且所述粘附基质可 以包含聚 -L- 赖氨酸、 纤连蛋白、 胶原、 弹性蛋白、 透明质酸、 层粘连蛋白、 基质胶、 凝集素、 细胞膜蛋白的抗体或 RGD 肽和它们的子代 （progeny） 。所述一层或多层纳米晶体可以另外 包含聚合物， 诸如琼脂糖、 聚甲基丙烯酸甲酯或聚丙烯酰胺。激活平台可以包含 2 层或更多 层固定化的纳米晶体 ( 例如， 约 2 至约 15 层或约 5 至约 10 层 )。所述组合物可以另外包 含一层或多层有机材料， 诸如聚合物 ( 例如， 合成的聚合物 )。所述聚合物可以是 PDDA。在 某些实施方案中， 所述纳米晶体是水可分散的。
在还另一个方面， 提供了制备激活平台的方法， 其包括 ： 提供基质 ； 将一层或多 层纳米晶体施加于所述基质的表面上 ； 以及将细胞粘附层施加于所述一层或多层纳米晶 体上。通过包括旋转铸模 （spin casting） 、 滴落铸模 （drop casting） 、 滚动涂布 （roll
coating） 、 根据需要滴落喷墨打印 （drop on demand inkjet printing） 、 PDMS( 聚二甲基硅 氧烷 ) 冲压打印 （stamp printing） 、 静电逐层装配在内的任意方法， 可以将所述一层或多 层纳米晶体施加于基质的表面上。
在另一个方面， 提供了用于监测和操纵细胞跨膜电位的试剂盒， 其包含基质和激 活平台， 其中所述激活平台被安置在所述基质的表面上， 其中所述激活平台包含一层或多 层纳米晶体。包含在试剂盒中的基质可以是玻璃盖玻片、 容器、 多孔板、 陶瓷微球或碳纳米 纤维。
本文提供的基于半导体纳米晶体的材料会提供优于传统有机电压敏感的染料的 许多优点， 因为这些纳米晶体具有大斯托克斯位移、 高量子产率、 耐光性和多路传输能力。 这些性质使得这些材料特别适用于高通量药物发现筛选应用。 基于纳米晶体的激活平台能 够在可兴奋细胞中产生光触发的动作电位， 且在用光脉冲照射后可以重复触发细胞激活。 所述激活平台能够递送与光学询问方法相容的生理学上有关的激活刺激。 本文所述的激活 平台会提供非侵入性的询问细胞的方案， 且可以在对细胞形态学、 分化和生理学应答没有 任何不良作用的情况下， 用于基于细胞的试验和组织切片。 因而， 这些平台与用于动力学试 验的短期细胞培养物相容。 本文所述的激活平台的另一用途是在研究突触生理学的混合培 养物中。通过光学地刺激突触前细胞， 可以监测所引起的它们的突触后配偶体的变化。在 离子通道的大多数药物研究中的一个重要遗漏是， 这些研究是在没有正常的突触引起的活 动的情况下进行的， 尽管在正常脑中的所有离子通道依赖于此。本文提供了允许实际的突 触行为的方法， 其中可以光学地控制和监测突触场 （field） ， 而不需要用电极穿透单独的神 经元对。这些方法可以放大到细胞场或网络， 其迄今为止使用传统方案尚未在实践中是可 行的。另外， 可以刺激和监测亚细胞域， 包括 dendritic abhor， 其独立于神经元体细胞激 活。 本文所述的感知和激活平台也可以用于原位、 全脑用途， 且具有治疗去除神经支配的组 织的治疗潜力。例如， 通过光脉冲可以活化原位递送的激活颗粒， 以恢复或控制 CNS 或 PNS 或心脏或肌肉组织中的神经元激活。本文所述的材料和方法也可以用于体内， 以在体内和 原位神经生理学模型 （包括小鼠、 大鼠、 兔子、 猫、 猴、 狗、 猪） 中研究和更好地理解突触活动 和神经元生理学， 并最终用于人类在临床中验证和证实的用途。 附图说明
下面的附图构成本说明书的一部分， 且被包括在内以进一步说明本发明的某些方 面。 参考这些附图中的一幅或多幅， 并结合本文提供的特定实施方案的详细描述， 可以更好 地理解本发明。
图 1 的简图描绘了与半导无限固体的能量带隙相比的半导纳米晶体能量带隙 (Eg) 和分子的电子能量水平。
图 2 的简图显示了由于半导体纳米晶体的尺寸依赖性的能量带隙， 半导体纳米晶 体的尺寸和它们的发射波长之间的关系。
图 3 的图显示了尺寸不同的量子点纳米晶体缀合物的光学性质 ： QDOT 525 (1)、 QDOT 565 (2)、 QDOT 585 (3)、 QDOT 605 (4)、 QDOT 625 (5)、 QDOT 655 (6)、 QDOT 705 (7)、 QDOT 800 (8)。 量子点材料在紫光激发后表现出宽带吸收 ( 实线 )， 并表现出在宽波长范围 的发射。量子点材料的尺寸决定了它的发射光谱 ( 虚线 )。图 4 显示了具有约 5 nm(A) 的横断面直径的单个 CdSe 量子点和尺寸均匀的量子 点的集合 (B) 的晶体结构。
图 5 是显示量子点纳米晶体的相对尺寸的图。
图 6 显示了提出的在没有 (A) 和有 (B) 电场存在下基于量子点纳米晶体的电压传 感器的作用机理。
图 7 显示了在细胞去极化之前 (A) 和之后 (B)， 含有基于量子点纳米晶体的电压传 感器的磷脂细胞膜。
图 8 显示了使用基于量子点纳米晶体的电压传感器对 CHO 细胞 (A)、 NG108 细胞 (B) 和神经元网络 (C) 进行特异性的膜标记的荧光图像。
图 9 是用基于量子点的电压传感器标记的 CHO 细胞的荧光图像， 显示了静息发射 强度。
图 10 的图显示了诱导的膜去极化 ( 施加 100 mM KCl) 在多个 CHO 细胞中引起的 一类基于量子点纳米晶体的电压传感器随时间的荧光强度 (RFU) 变化。
图 11 的条线图显示了两类 ( 标记的 X 和 Y) 基于纳米晶体的电压传感器的平均荧 光变化。
图 12 显示了在用千兆封口膜片电极电刺激之前用基于量子点的电压传感器标记 的在图 9 中显示的相同的 CHO 细胞。
图 13A 的图显示了以全细胞模式使用膜片钳方法电生理刺激细胞引起的图 12 所 示的 CHO 细胞的荧光强度变化。X- 轴的参照时间标尺条 ( 内置 ) 显示了 1 秒的持续时间。 图 13B 是表示沿着与图 13A 相同的时间标尺相对应的电压刺激方案的迹线。
图 14 显示了提出的基于量子点纳米晶体的电压传感器的作用机理， 其在光照射 后释放电子。
图 15 是基于量子点纳米晶体的激活盖玻片的示意图， 显示了纳米材料和活细胞 之间的界面。图 15A 是安置在盖玻片上的激活平台的展开图。
图 16 是在基于量子点纳米晶体的激活盖玻片上培养的海马神经元的明视野图 像， 所述盖玻片上连接了刺激千兆封口膜片电极 （patch pipette） 。
图 17 是实验膜片钳方案的示意图。
图 18 显示了用光重复触发后膜电位和动作电位随时间的变化。
图 19 显示了使用交替的电和光学激发时膜电位随时间的变化。
图 20 显示了在激活光脉冲 (380 nm) 之前 (A) 和之后 (B) 负载荧光钙指示剂的 NG108 细胞的荧光图像。
图 21 的图显示了在 380 nm 激活光脉冲 ( 用箭头指示 ) 之后 Fluo-4 钙指示剂随 时间的荧光强度。该图反映了光触发的动作电位引起的细胞内钙浓度的变化。
图 22 显示了在激活光脉冲 (380 nm) 之前 (A) 和之后 (B) 负载 Fluo-4 钙指示剂 的海马神经元的宽视野荧光图像。
图 23 显示了光触发的神经元网络激活引起的氟 -4 钙指示剂的荧光强度相对于时 间的图。该图解释了神经元网络的光触发激活引起的几个神经元中细胞内钙浓度的变化。具体实施方式
除非另有定义， 本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技 术人员通常理解的相同的含义。 在本文中引用的所有专利、 申请、 公开的申请和其它出版物 都通过引用整体并入。 如果在本部分中阐述的定义与在本文中通过引用并入的专利、 申请、 公开的申请和其它出版物中阐述的定义相反或另有不一致， 在本部分中阐述的定义优先于 通过引用并入本文的定义。
本文使用的 “一个” 或 “一种” 是指 “至少一个 （种） ” 或 “一个 （种） 或多个 （种） ” 。
本文使用的术语 “约” 当用于描述数值时， 应当包括最多到该数值 ±15% 的范围， 除非上下文另外清楚地指示。
尽管以 “包含”( 解释为是指 “包括， 但不限于” ) 不同组分或步骤的方式描述了组 合物和方法， 所述组合物和方法也可以 “基本上由” 或 “由” 所述不同组分或步骤 “组成” ， 这 样的术语应当解释为界定基本上封闭的成员组。
尽管生物学上有关的分子在活细胞内的定位的显示是重要的， 但是对于健康和疾 病中的细胞体内稳态的更好理解的需求， 决定了建立允许追踪细胞间和细胞内信号传递途 径的活动 （具有空间和时间保真度） 的新材料 ( 例如， 荧光探针 ) 和方法的必要性。每个细 胞具有静息膜电位， 其源自跨磷脂双层的电荷的分离。膜电位的变化被转换成对不同类型 的细胞蛋白的细胞应答， 包括电压 - 门控的离子通道、 电压 - 依赖性的磷酸酶和 GPCR。 它们 控制着大量细胞过程， 包括但不限于自主神经系统、 肠神经系统、 外周神经系统和中枢神经 系统的发育、 分化、 功能， 心搏， 血压， 感觉功能， 脑功能， 肌肉收缩， 突触传递， 细胞增殖和激 素分泌。 感知、 报告和产生膜电位的变化的能力， 对于理解跨膜信号传递和突触活动是至 关重要的。尽管电生理方法是监测细胞电活动性的黄金标准 （归因于它们的高信息容量） ， 但是光学方法具有几个优于电生理方法的优点。 具体地， 光学方法会提供非侵入的优势， 允 许一次从多个细胞进行记录， 且可以用于研究广范围的细胞类型， 包括在组织切片或完整 器官中的细胞。
本文提供了用于进行感知和刺激细胞跨膜电位变化的试验的材料、 方法和试剂 盒。在某些方面， 提供了非侵入地操纵细胞 ( 例如， 神经元 ) 的膜电位的光学方法。公开的 方法可以用于以时间上精确的且空间上分辨的方式控制细胞的功能性活动。具体地， 提供 了用于细胞的光学电压感知和光控制电激活的材料和方法。 所述的材料和方法可用于监测 细胞膜电位的动态变化以及通过改变细胞膜电位操纵细胞功能。 具体方法使用光控外部激 活平台。该激活平台为细胞激活提供生物相容的界面。当将激活平台放置在细胞附近并用 可见光照射时， 通过激活平台的激发产生累积的电磁场。 该电磁场调节细胞膜电位， 并通过 光的开和关来简单控制而不会干扰目标细胞。对于研究某些细胞类型 （例如， 干细胞） 而言， 该非侵入性的方案是特别合乎需要的。另外， 光控激活平台允许通过触发生理学上有关的 激活 （经由光学诱导的电场） 来重复刺激细胞数秒、 数分钟、 数小时、 甚至数天。
本文提供了非侵入地诱导细胞和组织中的离子通道激活 ( 例如， 诱导细胞产生动 作电位 ) 的方法。当评价靶向离子通道的新的潜在药物时， 或当评价可以改变离子通道功 能 （作为副作用） 的新药物时， 诱导细胞产生动作电位是必需的。另外， 光控激活平台允许通 过触发生理学上有关的激活 （经由电场） 重复刺激细胞。
激活平台包括一种或多种类型的材料， 它们可以在用光照射后诱导局部电场的变 化。激活平台的照射可以使构成平台的材料产生电流。产生的电流又可以触发邻近激活平 台或在其附近的细胞的膜中的电压变化。在某些实施方案中， 本文提供的激活平台利用某 些类型的纳米材料 ( 例如， 量子点 ) 的光电子性质。
本文所述的基于激活平台的试验的潜在用途包括 ： 电压 - 敏感的膜蛋白的功能研 究； 离解的细胞培养物或组织切片中的细胞之间的通讯的研究， 包括突触可塑性 ； 心脏病 学研究 ； 激活 - 刺激的细胞扩增和干细胞分化。 所述技术的其它潜在用途包括 ： 激活突触功 能， 和在全脑中治疗抑郁症、 退化和削弱或改变脑功能的其它病症， 以及包含目前在电刺激 控制下 ( 例如， 肌肉功能障碍， 诸如肌营养不良症， 或在心脏起搏器中 ) 的组织刺激的其它 用途。
在一个方面， 提供了测定或监测跨膜电位的变化的方法， 其包括 ： 提供至少一个靶 细胞 ； 使所述靶标接触至少一种纳米结构 ( 例如， 激活平台 )， 其中所述纳米结构包含至少 一层固定化的纳米晶体， 所述纳米晶体完全或部分地被粘附基质覆盖 ； 刺激处理过的靶标 ； 测定来自纳米结构的发射， 以及将发射与跨膜电位的变化相关联。某些方法利用定位在靶 细胞质膜中的光发射性纳米晶体来测定发射。 本文所述的纳米结构通常具有至少一个在纳 米尺寸量级的尺寸。 例如， 纳米结构可以由一层或多层纳米晶体形成， 其中所述纳米结构的 厚度是约 5-100 nm。 一个任选的额外的步骤可以包括， 在接触步骤之后， 但是在刺激步骤之前， 测定来 自纳米结构的发射。该额外步骤可以作为 “对照” 或 “空白” 测量。
由于它们独特的物理和光化学性质， 半导体纳米晶体 ( 例如， Qdot 纳米晶体， 购自 Life Technologies Corporation, Carlsbad, CA) 为具有空前能力和简单性的基于多路荧 光的检测提供平台。 Qdot 纳米晶体被用于亮度高的、 耐光的且多色的细胞和组织成像、 流式 细胞术、 蛋白印迹、 单分子检测、 体内成像以及其它。本文所述的方法利用量子点的独特物 理和光化学性质的优势， 并将它们的用途扩展到超出它们的公认的 “灯泡” 用途。
在一个具体的实施方案中， 将多层纳米晶体放置在固体支持物 （诸如盖玻片） 上， 并放置单层粘附基质 ( 例如， 蛋白或基于有机化学品的粘合剂 )， 其覆盖所述纳米晶体。然 后使细胞接触覆盖纳米晶体的粘附基质或放置在粘附基质上适当的时间以进行附着。 在某 些实施方案中， 细胞可以附着和 / 或生长在盖玻片上 1 天、 2 天、 3 天或 5 天或更久。在某些 实施方案中， 纳米结构包含至少一层纳米颗粒 （例如， 纳米晶体） ， 其被至少一层粘附基质覆 盖， 形成激活平台。
可以采用任何合适的粘附基质。粘附基质优选地是对活细胞无毒的。在一个实施 方案中， 粘附基质是聚 -L- 赖氨酸。其它附着或粘附基质包括允许细胞结合基质的那些基 质， 其引起或诱导或者不引起或不诱导形态学变化、 分化、 细胞增殖、 细胞凋亡、 停滞或其它 生理学变化。 这样的基质包括但不限于 ： 纤连蛋白、 胶原 I 和 IV 或其它胶原、 弹性蛋白、 透明 质酸、 层粘连蛋白、 基质胶、 凝集素、 细胞膜蛋白的抗体、 RGD 肽和它们的子代 （progeny） 等。 或者， 粘附基质可以包括氟化的材料， 诸如磺化的基于四氟乙烯的氟聚合物 - 共聚物 ( 可 以商品名 NAFION 购自 E. I. du Pont de Nemours and Company ； Wilmington, DE)。细胞 可以通过任意机理附着。在某些实施方案中， 仅单层粘附材料用于覆盖纳米晶体层。可以 采用额外层， 其不干扰从纳米晶体向附着的细胞的能量转移。
该接触步骤可以包括使细胞接触粘附基质层任何合适量的时间。 在某些实施方案 中， 可以在接触步骤过程中刺激细胞。 在某些实施方案中， 可以将刺激因子、 细胞凋亡因子、 小分子、 抗体等加入已放置的激活层和 / 或包被附着的细胞的介质， 以影响信号传递环境 和评估在特定环境刺激下膜电位的变化的影响。 刺激方法的其它实例包括电刺激、 磁刺激、 化学刺激、 生物刺激或其组合。电刺激的实例包括使用膜片钳和施加外部电场。化学刺激 的实例包括使靶标接触钾盐或钠盐， 或接触不同类型的膜内成孔分子。生物刺激的实例包 括用光敏感的离子通道激活靶标， 或使靶标接触化学实体， 后者起离子通道活动的调节剂 的作用。磁刺激的实例包括用适当频率和振幅的交替电磁场激活靶标。
通过多种方法可以电刺激靶标。通常基于目标离子通道的激活动力学选择一种 刺激方案 ( 刺激的电压振幅和持续时间 )。例如， 可以使靶标维持在第一膜电位电压， 在第 二膜电位电压使靶标处于去极化脉冲， 然后恢复至第一膜电位电压。第二膜电位电压通常 比第一膜电位电压正， 但是第一膜电位电压可能比第二膜电位电压正。例如， 第一膜电位 电压可以是负的， 而第二膜电位电压可以是正的。一个实例是， 第一膜电位电压是 -70 mV， 而第二膜电位电压是 +40 mV。或者， 第一或第二膜电位电压可以是 0 mV。实例包括第一膜 电位电压是 -200 mV， 第二膜电位电压是 0 mV。另一个实例是第一膜电位电压是 0 mV， 第 二膜电位电压是 200 mV。第一膜电位电压和第二膜电位电压的具体实例可以独立地选自 ： 约 -200 mV、 约 -180 mV、 约 -160 mV、 约 -140 mV、 约 -120 mV、 约 -100 mV、 约 -80 mV、 约 -60 mV、 约 -40 mV、 约 -20 mV、 约 0 mV、 约 20 mV、 约 40 mV、 约 60 mV、 约 80 mV、 约 100 mV、 约 120 mV、 约 140 mV、 约 160 mV、 约 180 mV、 约 200 mV 和这些值中的任意 2 个之间的范围。 或者， 在所述方法中可以使用更复杂的电压模式。所述方法可以另外包括使靶标 暴露于至少一个跨步电压 （step voltage） ， 然后在第二膜电位电压使它们处于去极化脉 冲。该跨步电压是第一膜电位电压和第二膜电位电压之间的中间电压。跨步电压可以用于 测量漏减 （leak subtraction） 。例如， 可以使用 -80 mV 的第一膜电位电压、 -50 mV 的跨步 电压和 20 mV 的第二膜电位电压。
去极化脉冲通常可以施加任意的时间长度。例如， 去极化脉冲可以施加高达约 5,000 秒。时间长度的实例包括约 10 微秒、 约 1 毫秒、 约 10 毫秒、 约 100 毫秒、 约 1 秒、 约2 秒、 约 3 秒、 约 4 秒、 约 5 秒、 约 10 秒、 约 20 秒、 约 30 秒、 约 40 秒、 约 50 秒、 约 60 秒、 约 70 秒、 约 80 秒、 约 90 秒、 约 100 秒、 约 500 秒、 约 1,000 秒、 约 2,000 秒、 约 3,000 秒、 约 4,000 秒、 约 5,000 秒和这些值中的任意 2 个之间的范围。
靶标可以是一个或多个合适的完整细胞， 其具有膜和膜电位。可以采用任何合适 的细胞， 包括但不限于 ： 细菌 ( 革兰氏阳性或革兰氏阴性 ) 细胞、 真核细胞、 原核细胞、 真 菌细胞、 昆虫细胞、 鸟类细胞、 爬行动物细胞、 卵母细胞、 两翼昆虫细胞、 斑马鱼细胞、 线虫细 胞、 鱼细胞、 两栖动物细胞或哺乳动物细胞。主要的哺乳动物细胞的实例包括人、 小鼠、 大 鼠、 狗、 猫、 熊、 麋鹿、 牛、 马、 猪或中国仓鼠卵巢 ( “CHO” ) 细胞。细胞类型的其它实例包括免 疫系统细胞 ( 例如， B- 细胞、 T- 细胞 )、 卵母细胞、 红细胞、 白细胞、 神经元细胞、 上皮细胞、 神经胶质细胞、 成纤维细胞、 癌细胞和永生化的细胞。
纳米结构可以采取不同的构造。例如， 纳米结构可以是纳米颗粒 ( 例如， 纳米晶 体 )、 纳米丝、 膜、 图案化的基质和网的形式。一种示例性的纳米结构是用半导体材料 ( 例 如， CdSe) 形成的纳米丝， 其可以诱导或报告电位的变化。例如， 可以贯穿或紧挨细胞膜、 细
胞场或突触神经毡或肌肉细胞或其它可兴奋细胞而插入纳米丝。 纳米丝可以以类似于标准 的电刺激电极 （诸如起搏器电极） 的方式起作用。纳米丝引起细胞的膜电位的变化， 该变化 在周围组织中触发场电位和动作电位。
在某些实施方案中， 纳米结构是由一层或多层支持材料 ( 例如， 纳米晶体 ) 形成 的激活平台。在其它实施方案中， 纳米结构包含激活颗粒 ( 例如， 球状体 )， 其可以放置到 可兴奋组织深处， 并与激发光接近。建立包含被至少一层粘附基质覆盖的纳米颗粒层 ( 例 如， 纳米晶体 ) 的纳米结构或激活平台的方法包括 ： 将纳米晶体层固定化在支持结构上 ( 例 如， 在微孔板的孔的底部上 )， 覆盖至少一层粘附基质， 并随后向实验小室 （experimental chamber） ( 诸如微孔板孔 ) 中加入含有细胞的溶液。在激活平台的构建中， 可以采用纳米 颗粒 ( 例如， 纳米晶体 ) 的任意组合。可以采用单一类型的纳米颗粒， 或可以采用在目标性 质方面存在差异的纳米颗粒的混合物。
纳米颗粒通常可以是任何合适的半导体纳米晶体或量子点。 量子点是纳米级无机 晶体， 其含有几百 - 几千个半导体材料的原子。 它们的行为受到量子物理学规则的控制。 量 子点不完全是一个分子， 尽管它们具有离散电子能量水平， 也不是一块半导体， 尽管它们表 现出自旋轨耦合并且具有较大的介电常数。小的半导纳米晶体的行为更象分子， 并因此具 有较高的带隙能， 而大的半导纳米晶体的行为更象无限固体， 并因此具有较低的带隙能。 图 1 描绘了半导体纳米晶体、 分子和半导无限固体的电子性质之间的差异。
随着结构的物理尺寸减小， 量子效应逐渐变得重要。三维空间中光产生的激子的 量子限制决定了量子点的光物理性质， 诸如纳米晶体的有效带隙， 并由此决定了荧光的波 长。量子点发荧光不同于传统荧光团。具有高于带隙的能量的任意光子的吸收造成激子 或库仑 - 相关的电子空穴对的形成。该宽带吸收波谱是指， 量子点吸收在每个波长至它们 发射的蓝色的光， 且通过在单个波长至最蓝发射的蓝色激发不同尺寸的量子点， 可以得到 许多颜色。电子和空穴保持分离数十至数百纳秒， 然后放射地重组， 引起光子的发射。图 2 显示了一系列瓶子 200， 其中每个瓶子装有不同尺寸的量子点群， 并证实量子点发射特定波 长 ( 例如， 525 nm 至 655 nm) 的光， 所述波长取决于量子点的尺寸。参考图 2， 用光 204 照 射更小尺寸的量子点 202， 引起更短波长 ( 例如， 525 nm) 的光 206 的发射， 而更大尺寸的量 子点 208 发射更长的波长 ( 例如， 655 nm)。在用具有例如约 400-475 nm 的波长的光激发 后， 量子点材料可以表现出宽带吸收， 且可以发射跨宽范围波长的光 ( 图 3)。参考图 3， 在 约 430-450 nm( 用箭头 302 指示 ) 的不同尺寸的量子点的激发引起发射约 500- 约 900 nm 波长的光， 其取决于量子点的尺寸。此外， 量子点的发射波谱非常狭窄且对称。
量子点由数百至数千个重复原子组成， 每个原子均作用于纳米晶体吸收光的能 6 7 力。 结果， 量子点具有特别高的消光 (10 – 10 M-1cm-1)， 远大于任何有机染料。 此外， 最佳 地合成的量子点具有接近 100% 理论最高限的量子产率。突出的吸收性质与大的量子产率 的这种组合产生了亮度和灵敏度高于有机荧光团超过一千倍的材料， 经常引起用于生物学 用途的工作浓度的急剧降低和检测罕见事件的急剧增强的能力。另外， 量子点的高耐光性 允许在会造成其它类型荧光团的光诱导性衰退的条件下进行长期成像实验。 由于量子点突 出的耐光性、 亮度、 宽激发、 窄发射、 长荧光寿命和多路能力， 它们正在改变生命科学成像。
量子点是高度工程化的材料， 其通常含有几个结构不同的元件。半导体纳米晶体 通常具有半导体核心、 壳和任选的一次或多次表面处理。示例性的纳米晶体包括但不限于在美国专利号 5,505,928、 5,990,479、 6,114,038、 6,207,229、 6,207,392、 6,251,303、 6,319,426、 6,444,143、 6,274,323、 6,306,610、 6,322,901、 6,326,144、 6,423,551、 6,699,723 、 6,426,513 、 6,500,622 、 6,548,168 、 6,576,291 、 6,649,138 、 6,815,064 、 6,819,692、 6,821,337、 6,921,496、 7,138,098、 7,068,898、 7,079,241 和 7,108,915 中所述 的那些。纳米晶体核心在很大程度上决定了它的关键的光吸收和发射特征。已经广泛研究 了纳米晶体核心， 且合成中的改进已经引起关键生理化学性质的优化， 得到在光激发后具 有均匀的尺寸分布和强度、 窄发射带的纳米晶体核心。但是， 就大多数应用而言， 单独的纳 米晶体核心缺少足够强烈或稳定的发射强度。纳米晶体核心对于它们的环境特别敏感 ； 例 如， 许多生物学应用所需的含水环境可以导致纳米晶体核心发光性的完全破坏。 因而， 光稳 定化纳米晶体核心 ( 例如， 保护它们的发光性质 ) 和使它们在含水介质中稳定和有用的方 法对于生物学应用而言具有重大意义。 通常， 这可如下实现 ： 通过在核心上施加壳以形成所 谓的核心 / 壳纳米晶体。
包被纳米晶体核心的能力已经成为许多研究的领域， 且用无机壳包被纳米晶体核 心以形成 “核心 / 壳纳米晶体” 已经产生提高的发射强度、 化学和光化学稳定性、 降低的自 猝灭特征、 在多种环境中的稳定性等。用无机壳包被纳米晶体核心对根本的发光能量的影 响尚未被很好的理解， 且通常基于一小组标准 （例如， 如， 涂层材料的选择和壳的密度和厚 度） 来控制。
通常认为无机壳会钝化核心纳米晶体的最外面的表面， 由此减少或消除与核心有 关的表面能量状态， 并使核心与外部环境绝缘。这可以减少或消除从核心到环境的激子的 非发光性损失， 保持核心可以具有的有效荧光性质。通过用无机壳包被核心也可以减少光 化学降解， 并可以提高发射效率和稳定性。
尽管纳米颗粒核心决定了它的颜色， 但是纳米颗粒壳决定了它的亮度、 耐光性和 环境不敏感性。通常根据与核心绝缘的电子性质来选择壳材料。通常使壳材料的选择与核 心材料匹配。 例如， 壳材料通常可以具有比核心更宽的带隙， 这使它能够保护核心所处的激 活态 （当它已经被光激活时） ， 形成分离的电子和空穴。理想地可以将壳选择为具有与核心 材料紧密匹配的原子间距和格栅结构， 以最好地保持核心的光物理属性， 这是因为核心和 壳之间的界面的不规则性可能引起非发光的能量耗散机理， 后者会降低发光效率。无机壳 在这些量子点核心上的适当放置产生复合的核心 - 壳结构， 其具有显著增强的化学和光物 理性质。最常见的量子点由 CdSe 组成， 并表现出可以从 ~400 nm 至 ~650 nm 变化的最大发 射波长 （随着纳米晶体的尺寸从 2-7 nm 的变化） 。图 4 显示了在不同细节水平的典型量子 点的晶体结构。
为了用于大多数基于荧光的生物学应用， 通常需要如下修饰赤裸的核心 - 壳纳米 晶体 ： 通过把配体连接到壳的表面上来使其可分散于水中并对生物功能性修饰具有反应 性。 得到的纳米颗粒可以具有约 10-20 nm 的尺寸， 类似于绿色荧光蛋白 (GFP) ( 图 5)。 完 整装配的量子点对外部环境不敏感， 且因此可以象用于大分子检测的试剂一样用于定量。
半导体纳米晶体核心和壳可以独立地由下述元素的材料制成 ： 元素周期表第 2 或 12 族的元素， 和选自元素周期表第 16 族的元素或元素的组合。这样的材料的实例包括 ： ZnS、 ZnSe、 ZnTe、 CdS、 CdSe、 CdTe、 HgS、 HgSe、 HgTe、 MgS、 MgSe、 MgTe、 CaS、 CaSe、 CaTe、 SrS、 SrSe、 SrTe、 BaS、 BaSe 和 BaTe。或者， 半导体纳米晶体核心和壳可以独立地由下述元素的材料制成 ： 元素周期表第 13 族的元素和元素周期表第 15 族的元素。这样的材料的实例包括 ： GaN、 GaP、 GaAs、 GaSb、 InN、 InP、 InAs 和 InSb。或者， 半导体纳米晶体核心和壳可以独立地 由元素周期表第 14 族的元素制成的材料制成。这样的材料的实例包括 Ge 和 Si。或者， 半 导体纳米晶体核心和壳可以独立地由诸如 PbS 或 PbSe 的先导材料制成。半导体纳米晶体 核心和壳也可以由上面列出的任意材料的合金或混合物制成。
该半导体纳米晶体通常可以具有任意尺寸 ( 平均直径 )， 但是尺寸通常是约 0.1 nm 至 1,000 nm。 更窄的尺寸范围包括约 0.1 nm 至约 1 nm、 约 1 nm 至约 50 nm 和约 1 nm 至 约 20 nm。具体的尺寸实例包括约 0.1 nm、 约 0.5 nm、 约 1 nm、 约 2 nm、 约 3 nm、 约 4 nm、 约 5 nm、 约 6 nm、 约 7 nm、 约 8 nm、 约 9 nm、 约 10 nm、 约 11 nm、 约 12 nm、 约 13 nm、 约 14 nm、 约 15 nm、 约 16 nm、 约 17 nm、 约 18 nm、 约 19 nm、 约 20 nm、 约 25 nm、 约 30 nm、 约 35 nm、 约 40 nm、 约 45 nm、 约 50 nm 和这些值中的任意 2 个之间的范围。在某些实施方案中， 已经发 现具有约 1 至约 20 nm 的平均直径的半导体纳米晶体是特别实用的。其它实施方案利用具 有约 3 至约 10 nm 的平均直径的纳米晶体。
纳米晶体的一种典型的单色制备物具有这样的晶体， 它们优选地具有基本上相同 的尺寸和形状。 通常认为纳米晶体的形状是球形或接近球形， 但是实际上可以是任意形状。 或者， 纳米晶体的形状可以是非球形。例如， 纳米晶体的形状可以向扁球形球状体和杆变 化， 以实现更红的颜色。 优选地， 至少约 60%、 至少约 70%、 至少约 80%、 至少约 90%、 至少约 95% 和理想地约 100% 的颗粒具有相同的尺寸。可以将尺寸偏差测量为直径的均方根 ( “rms” )， 小于约 10% 的均方根是优选的。 尺寸偏差可以是小于约 10% rms、 小于约 9% rms、 小于约 8% rms、 小于约 7% rms、 小于约 6% rms、 小于约 5% rms 或这些值中的任意 2 个之间的范围。这 样的颗粒集合有时称作 “单分散” 。
众所周知， 通过改变纳米晶体的尺寸和组成可以 “调节” 半导体纳米晶体的颜色 ( 发射的光 )。如上面讨论的， 纳米晶体优选地吸收广谱波长， 并发射狭窄波长的光 ( 参见 图 3)。激发和发射波长通常是不同的和不重叠的。在发射带的半高全宽 (FWHM)， 发射宽度 优选地小于约 50 nm， 更优选地小于约 20 nm。发射宽度 (FWHM) 的实例包括约 50 nm、 约 40 nm、 约 30 nm、 约 20 nm 和约 10 nm。 发射的光优选地具有对称的发射波长。 发射最大值通常 可以是从约 200 nm 至约 2,000 nm 的任意波长。发射最大值的实例包括约 200 nm、 约 400 nm、 约 600 nm、 约 800 nm、 约 1,000 nm、 约 1,200 nm、 约 1,400 nm、 约 1,600 nm、 约 1,800 nm、 约 2,000 nm 和这些值中的任意 2 个之间的范围。
纳米晶体也可以具有金属核心， 且在有些情况下， 具有周围的壳结构。 金属核心可 以由贵金属制成。这样的金属的实例包括银、 金和铜。
任选地， 所选择的提供与分散介质具有相容性的有机的或其它的外涂层可以施加 于壳的部分或大部分表面上 ； 该外涂层可用于使无机颗粒可溶于或容易地分散于选择的介 质中， 所述介质可以是水性的或有机的、 亲水的或疏水的。对于某些应用， 纳米晶体可以具 有添加不同功能性的表面涂层， 它们。 例如， 可以将纳米晶体衍生化来提高水溶解度或提供 用于连接生物分子的反应基团。例如， 可以给纳米晶体包被脂质、 磷脂、 脂肪酸、 多聚核酸、 聚乙二醇、 第一抗体、 第二抗体、 抗体片段、 基于蛋白或核酸的适体、 生物素、 链霉抗生物素、 蛋白、 肽、 小有机分子、 有机或无机染料、 贵重的或贵金属簇。
或者， 纳米晶体可以由多种无机材料制成， 包括硅、 铝、 锆、 铈、 钇以及锡和锌的氧化物。 例如， 硅纳米颗粒具有复合的半导体纳米晶体的多种有利特征， 诸如跨可见波谱的大 小可调的发光。另外， 硅纳米颗粒也具有低毒性、 高生物相容性、 有效且稳定的表面官能化 和潜在的低成本。
在离子通道试验中使用纳米晶体具有多种期望的特征。因为与现有的有机的、 电 压 - 感知的荧光团相比， 纳米颗粒具有快速响应时间和信号变化， 所以它们对于表征动作 电位和突触活动而言是理想的。纳米晶体也具有其它希望的性质， 诸如低毒性、 高光稳定 性、 用于多路用途的能力和使用缀合的或以其它方式结合的材料靶向它们的能力。 此外， 不 同于随着它们光漂白而可能产生有毒的反应物质 ( 例如， 单态氧 ) 的有机荧光团， 尚未显示 纳米晶体会产生任何这样的有毒物质。 由于它们的高光稳定性、 快速的响应时间、 大的信号 变化和低毒性， 纳米晶体是用于研究活细胞中的离子通道和神经元功能的理想材料。
一般而言， 使用任何合适的测量光的或积聚光的仪器可以监测纳米晶体的波谱特 征。 这样的仪器的实例是 CCD ( 电荷耦合装置 ) 照相机、 视频装置、 CIT 成像、 安装在荧光显 微镜上的数码照相机、 光电倍增管、 荧光计和光度计、 不同配置的显微镜以及甚至人眼。可 以连续地或在一个或多个离散的时间点来监测发射。 纳米晶体的耐光性和灵敏度允许在延 长的时间段内记录电位的变化。 测定来自纳米结构的发射的其它方法包括测量光强度、 光极化、 光吸收、 发射颜 色、 发射寿命或半衰期或 “闪烁” 模式的变化。
本文描述了可用于监测细胞膜处或之中的变化和 / 或操纵细胞膜处或之中的电 位的不同材料。某些材料可以用作电压传感器 ( 例如， 作为荧光指示染料的替代物 )。这样 的材料能够感知电位的变化， 其中所述变化被检测为材料的光学性质 ( 例如， 波长和 / 或强 度 ) 的变化。其它材料能够影响或调节细胞电位的变化。例如， 在用光照射后， 纳米晶体变 成自由载荷子流通过膜的途径， 使电流穿过， 并反过来影响跨膜电位。这样， 通过改变例如 入射光的强度和 / 或极化可以实现细胞上的电压控制。
本文提供了可以永久地或暂时地定位在细胞膜中 / 细胞膜处的材料。纳米晶体保 留在细胞膜中或细胞膜处的能力可以随核心、 壳和 / 或涂层组成和 / 或构造以及颗粒形状 的变化而变化。
可 以 合 成 不 同 复 杂 度 的 形 状 的 纳 米 颗 粒， 诸 如 球 形、 杆、 盘、 三 角 形、 纳米环 （nanoring） 、 纳米壳、 四脚体等。每个这样的几何形状具有特有的性质 ： 表面电荷的空间分 布、 入射光波的极化的朝向依赖性和电场的空间范围。
为了操纵自由载荷子浓度和流动性， 可以向纳米颗粒中掺杂杂质， 诸如铟、 磷、 硼 和铝等。纳米颗粒和有机聚合物的混合物对于该应用而言可能是有利的， 因为纳米颗粒可 以高效地传导电子， 而聚合物可以更好地传导空穴。用生色团将半导体纳米颗粒官能化也 可以通过将光子吸收与自由载荷子运输分开来优化该应用。
特定传感器可以保留在膜中 / 膜处的持续时间经常由用于处理颗粒表面的涂层 决定。 代表性的涂层包括能够结合质膜的肽， 诸如短杆菌肽、 蜂毒肽和阿拉霉素等抗微生物 肽和 α 螺旋两亲肽和成孔肽。 使用本领域技术人员已知的方法， 诸如将肽中的组氨酸残基 偶联到量子点的表面 （其表面已经用咪唑处理过） 上， 可以将肽固定化到量子点上。某些实 施方案利用能渗透进细胞的细胞渗透性肽 (CPP)。其它类型的涂层包括组氨酸、 赖氨酸、 硫 代甘油、 两性霉素和胆固醇。 量子点的代表性涂层材料包括带正电荷的聚合物， 诸如聚乙酰
亚胺 (PEI)。PEI 聚合物是亲水的， 且对金属离子具有亲和力， 使得这类聚合物特别适用于 与量子点形成稳定络合物。 PEI 聚合物可以用于在量子点上形成涂层， 其可以赋予量子点水 分散性和水稳定性， 而不损害量子效率。另外， PEI 聚合物包括大量胺官能团， 它们可以使 用例如双功能的胺反应性化合物来交联。
适合相互作用或插入的条件可以包括多种方法。 这些方法的实例包括经由内吞作 用的被动或主动摄取、 电穿孔、 脂质体介导的递送、 pluronic 嵌段共聚物介导的递送、 细胞 渗透性肽介导的摄取、 蛋白介导的摄取、显微注射、 转染、 病毒递送、 optoporation、 成孔基 质、 膜嵌合剂或其组合。
由于纳米颗粒具有与细胞膜近似相同的厚度， 插入膜中会将纳米颗粒的极点 （pole） 暴露于细胞外和细胞内空间。在用光照射后， 纳米颗粒变成自由载荷子流通过膜的 途径， 使电流穿过， 并反过来影响跨膜电位。这样， 通过改变例如入射光的强度和 / 或极化 可以实现细胞上的电压的控制。
因此， 光学控制靶标的跨膜电位的方法可以包括 ： 提供至少一个靶标， 其中所述靶 标是细胞或细胞碎片 ； 在适合纳米结构与细胞或亚细胞膜相互作用或插入的条件下， 使所 述靶标接触至少一种纳米结构， 以制备处理过的靶标 ； 向处理过的靶标递送能量 ； 以及检 测靶标的应答。
所述细胞可以是上述的任意细胞。所述纳米结构可以是任意的纳米结构， 包括上 述的任意纳米结构。
本文提供的另一个实施方案涉及激活平台用于控制和 / 或操纵细胞跨膜电位的 应用。暴露于光的纳米颗粒 ( 例如， 纳米晶体 ) 可以作为在它们附近的局部电磁场的发生 器。认为该效应的原因在于自由载荷子 ( 在照射纳米颗粒后的电子空穴对 ) 和连续电荷分 离的产生。 不希望受理论的约束， 目前提出的作用机理是细胞膜和半导体表面的静电偶联， 有效地形成电容器。当纳米晶体放置在细胞附近时， 由光激发的纳米晶体产生的累积电磁 场可以与细胞跨膜电梯度相互作用， 产生决定细胞膜电位的电磁场。将细胞膜的一部分局 部去极化可能足以在整个细胞中产生去极化。
因此， 本文提供了光学地控制和 / 或操纵靶细胞跨膜电位的方法， 其包括 ： 至少一 个靶细胞 ； 在适合所述靶细胞附着激活平台的条件下， 使靶细胞接触所述激活平台以形成 处理过的靶标 ； 通过所述激活平台向处理过的靶标递送能量 ； 以及检测靶标的应答。
递送能量可以包括递送光、 电能、 磁能等。通过基本上任意的照射方法， 包括激光 照射、 水银灯照射、 氙灯照射、 卤素灯照射、 LED 照射等， 可以进行该递送能量步骤。优选地 在适合激活平台中的纳米晶体吸收的波长或波长范围进行照射步骤。
使用多种方法， 其中使用任何合适的测量光的或累积光的仪器， 可以进行该检测 步骤。这样的仪器的实例是照相机、 数码照相机、 摄像机、 CMOS 照相机、 CCD 照相机、 安装在 荧光显微镜上的数码照相机、 光电倍增管、 荧光计、 光度计、 显微镜和甚至人眼。 可以以任何 合适的方式连续地或在一个或多个离散的时间点来监测细胞应答。
或者， 该检测步骤可以包括使用第二检测机理。这样的第二检测机理的一个实例 是使用荧光共振能量转移 (“FRET” )。利用 FRET， 纳米结构可以将它的能量转移至第二分 子， 后者然后发射可检测的信号。额外的第二检测机理依赖于细胞中的可以独立检测的变 化。例如， 该细胞可以经历裂解。或者， 细胞可以经历化学变化， 提高或降低可以被独立测量的一种或多种化学剂或生化剂 ( 例如， 钙离子 ) 的浓度。
可以将至少一种额外的材料添加到至少一个细胞或处理过的细胞中， 以测试细胞 对额外材料的应答。例如， 可以首先使细胞接触所述至少一种纳米晶体， 照射， 并检测细胞 应答作为 “对照” 样品。然后可以使处理过的细胞接触该额外的材料， 以制备材料处理过的 细胞， 照射， 并检测。该第二次细胞应答可以与第一次 ( 对照 ) 细胞应答相对比。第一次细 胞应答和第二次细胞应答之间的差异， 将指示所述材料的加入是否对细胞行为具有任何影 响。 可以加入不同的额外材料或额外剂量的相同的额外材料， 随后照射， 并检测第三次细胞 应答。这可以以连续方式进行任意次数。例如， 可以检测递增剂量的材料， 产生第三次细胞 应答、 第四次细胞应答、 第五次细胞应答、 第六次细胞应答等。可以将这些连续的细胞应答 绘图或以其它方式进行对比， 并可以测定系列处理的效果。
或者， 可以平行地进行 “对照” 和 “实验” 样品。例如， 可以使第一个细胞接触纳米 晶体， 照射， 并检测对照细胞应答。平行地 （连续地或同时地） ， 可以使第二个细胞接触纳米 晶体和试验材料， 照射， 并检测试验细胞应答。 可以将对照细胞应答和试验细胞应答进行对 比。
所述至少一种额外的材料通常可以是任意材料。可以与激活平台组合地使用已 知能调节离子通道行为的材料。参见， 例如， Ashley ( 编 ), Ion Channels: A Practical Approach (Oxford University Press 1996)。 这些材料的实例包括药物候选物、 细胞功能 调节剂、 用于增强药物递送的分子部分、 分子探针候选物等。
除了上述纳米晶体的用途以外， 修饰的纳米晶体可以用于实现强的、 稳定的和可 控的局部电场。这样的修饰包括高表面电荷 ( 例如， CdTe/CdSe 作为核心 / 壳组合 )、 向纳 米晶体中掺杂可以作为一类自由载荷子的供体或受体的材料、 产生具有 p- 或 n- 型表面阱 （surface trap） 的纳米晶体、 缀合有助于电荷分离的分子等。通过使用可以将光转化成电 力的纳米晶体可以实现细胞跨膜电位的有效产生。
在 某 些 实 施 方 案 中， 半导体纳米晶体包括下述元素的材料 ： 元素周期表第 12(IIB) 族的元素， 和选自元素周期表第 16 (VIA) 族的元素或元素的组合。 例如， 纳米晶体 核心可以由 CdSe、 CdTe、 CdS 或 HgTe 或者其混合物或合金形成。或者， 纳米晶体核心可以包 括下述元素的材料 ： 第 13 族的元素， 和选自第 15 族的元素或元素的组合。例如， 纳米晶体 核心可以由 InP 或者其混合物或合金形成。
经常构造半导体纳米晶体材料以提高它们的光学性质。 这样的材料通常包括半导 核心， 其被绝缘壳材料包围， 所述绝缘壳材料通常相对较厚 ( 例如， 约 2 nm 至约 4 nm)。但 是， 绝缘壳的存在可以使纳米晶体对它们的局部环境相对不敏感。 相反， 某些应用要求纳米 晶体材料对局部电场的变化特别敏感。通过改变壳材料的组成和 / 或构造可以提高灵敏 度。本文提供的纳米晶体材料可以感知或调节局部电场中的变化。这些材料特别适用于包 含监测电压 - 门控的离子通道的生物学试验。因此， 提供了包括壳层的半导体纳米晶体， 所 述壳层仅覆盖半导体核心的一部分。某些纳米晶体包括这样的壳材料， 其足够薄以允许电 子流通过激活平台， 同时仍然增强颗粒的光学性质。例如， 所述壳相对薄 ( 相对于可购得的 量子点 )， 并仅包括钝化壳材料的几个单层。例如， 一类环境敏感的纳米晶体包括被薄 ZnS 或 CdS 壳包围的由 CdSe 和 / 或 CdTe 形成的核心。
提供了其它类型的纳米晶体， 它们设计成在有电场存在下不发荧光。这样的材料被设计为用于有效地将光转化成电流， 且可以用于包含电流变化的非光学检测的应用。为 这样的应用提供了不包括绝缘壳的半导体纳米晶体。缺少壳的纳米晶体可以有效地吸收 光， 以生成和传导电流。当在本文所述的激活平台形式中时， 电流可以自由地穿过平台， 并 有效地去极化接触平台的细胞。具有或没有额外的表面涂层且仅由半导体核心 ( 且没有 壳 ) 组成的颗粒可以被光激发， 并以非光学方式检测， 诸如用膜片电极， 且没有去极化效率 的损失。
可以用表面涂层修饰纳米晶体， 以添加不同的官能团或改变在下面的纳米晶体的 性质。除了已经描述的表面涂层以外， 其它类型的配体和涂层材料可以为光电应用提供额 外的益处。例如， 可以处理纳米晶体以使它们的水溶解性或水分散性更高。通常在有诸如 TOPO 和 TOP 的疏水溶剂 （它们赋予纳米晶体水不溶性） 存在下， 合成纳米晶体。通过用亲水 的和 / 或带电荷的配体的衍生化可以增加纳米晶体的水溶性。例如， 可以对纳米晶体进行 配体交换反应， 使表面结合的疏水基团与更亲水的配体交换。 在某些实施方案中， 可以用为 纳米晶体提供净正电荷或净负电荷的配体或聚合物包被纳米晶体。 可以用于产生具有净负 电荷的纳米晶体的材料的代表性实例包括 ： 含有例如一个或多个巯基、 磺酸酯基和羧酸酯 基的那些材料， 诸如 1- 硫代甘油、 巯基乙酸、 2- 巯基乙基磺酸酯、 聚 ( 丙烯酸 ) 或其衍生物 或硫辛酸。 可以用于产生具有净正电荷的纳米晶体的材料的代表性实例包括， 例如， 聚乙酰 亚胺 (PEI)、 半胱胺、 聚烯丙胺、 组氨酸、 聚组氨酸、 赖氨酸和聚赖氨酸。
可选地或额外地， 可以用含有反应官能团 ( 例如， 可聚合的基团 ) 的化合物 ( 例 如， 聚合物 ) 包被或衍生化纳米晶体。在适当激活 ( 例如， 光或热 ) 后， 反应官能团可以聚 合以形成包被的纳米晶体。 具有反应性的或可聚合的基团的聚合物的代表性实例包括乙烯 基聚合物和丙烯酸聚合物， 所述聚合物可以用于在纳米晶体表面上形成聚合物层。
可以用于包被或覆盖本文所述的纳米材料 ( 例如， 作为在纳米晶体上的涂层， 或 作为激活平台中的层 ) 的材料的其它实例包括天然存在的或合成地制备的聚合材料。天 然存在的聚合材料的代表性实例包括琼脂糖和多种细胞粘附材料， 例如聚 -L- 赖氨酸、 聚 -D- 赖氨酸、 聚 L- 和 D- 鸟氨酸、 纤连蛋白、 RGD 肽、 基质胶、 胶原 I 和 IV、 凝集素、 弹性蛋 白、 透明质酸、 层粘连蛋白、 细胞表面蛋白的抗体 、 胞外蛋白等。合成地制备的聚合物的一 种代表性实例是聚 ( 二烯丙基二甲基氯化铵 ) (PDDA)。 某些激活平台在所述装置的一层或 多层中利用 PDDA。
用于所述方法的一种激活平台包括本文所述的一种或多种类型的纳米材料 ( 例 如， 纳米晶体 )。激活平台可以具有多种构造， 取决于使用的具体纳米材料和用途。例如， 激活平台可以是基本上平面的， 且可以采取例如薄膜、 阵列、 图案化的涂层等形式， 或可以 具有更复杂的三维构造。通过改变多种设计参数， 例如， 如纳米晶体层数、 纳米颗粒的组成 ( 例如 CdSe、 CdTe、 CdS、 ZnSe、 ZnS 等 ) 和不同层中纳米颗粒的类型和 / 或尺寸， 可以构建 三维结构。
激活平台通常固定化在基质或表面上。 对于用于光学试验， 希望基质是透光的， 使 它不会显著阻碍或散射在试验中使用的光 ( 例如， 波长在紫外线附近至红外线附近的光 )。 某些实施方案要求基质由透光 ( 例如， 透明 ) 材料 （诸如玻璃或塑料） 制成。
基质可以具有不同的构造。例如， 基质可以是平面的表面或弯曲的表面。基质的 代表性实例包括显微镜载玻片、 盖玻片、 试管、 容器、 多孔板 ( 例如微量滴定板 )、 微珠 ( 玻璃或聚合物 )、 陶瓷微球、 碳纳米纤维等。
在某些实施方案中， 激活平台另外包括一层或多层的粘附基质 ( 例如， 粘附层 )。 如上所述， 粘附基质允许细胞结合基质， 引起或诱导或者不引起或不诱导形态学变化、 分 化、 细胞增殖、 凋亡、 停滞或其它生理学变化。粘附基质优选地是对活细胞无毒的和不妨 碍激活应答的非绝缘材料。用于制备粘附基质的材料的实例包括 ： 例如聚 -L- 赖氨酸、 聚 -D- 赖氨酸、 纤连蛋白、 胶原、 弹性蛋白、 透明质酸、 层粘连蛋白、 胞外基质蛋白、 氟化的表 面活性剂、 聚 l- 和 d- 鸟氨酸、 纤连蛋白、 RGD 肽、 基质胶、 胶原 I 和 IV、 凝集素、 弹性蛋白、 透明质酸、 层粘连蛋白、 细胞表面蛋白的抗体、 胞外蛋白等。
通常选择纳米颗粒的类型和排列以使从激活平台向细胞中传递的电荷最大化， 并 使激活平台内的电荷传导最小化。在某些实施方案中， 这可以通过设计薄膜形式的激活平 台来实现。这样的薄膜可以构造成高度绝缘。尽管电荷不会在高度绝缘的材料内远距离移 动， 但是会移动一定距离。 在某些实施方案中， 薄膜的电导率使得电荷移动的距离与薄膜厚 度处于相同的尺寸量级。该距离通常远远小于细胞直径 ( 细胞直径是微米尺寸量级 )， 所 以电荷不会绕着细胞移动。薄膜可以包括一种或多种类型的纳米材料 ( 例如， 纳米晶体颗 粒 )， 且可以由一层或多层材料形成。 另外， 纳米颗粒经常包括表面涂层或处理， 其预防或最 小化颗粒向含水介质中的渗透。纳米颗粒可以均匀地分散在薄膜层中， 或可以定位在薄膜 的特定域中， 且可以嵌入薄膜中和 / 或安置在薄膜表面上。例如， 纳米颗粒可以排列在薄膜 内的离散域中或在薄膜的表面上， 形成一维或二维阵列。或者， 纳米颗粒以 “肩并肩” 方式 邻近地排列在基质表面上。在还另一个系统中， 激活平台是图案化阵列的形式。这样的阵 列可以由例如纳米晶体材料的离散斑片 ( 例如， 斑点 ) 形成。选择斑片之间的间距以消除 薄膜之间的电子传导。在有些系统中， 斑片约为细胞的尺寸。细胞尺寸的斑片可以由高传 导性材料形成， 同时能把所有电荷导向细胞。
某些薄膜被纳米晶体颗粒饱和。 含有高浓度纳米晶体的薄膜允许纳米晶体紧密堆 积， 且可以有效地负载电流和去极化细胞。 薄膜不应当对细胞有毒， 且可以是不妨碍细胞去 极化的任意厚度。例如， 薄膜可以是在约 10 nm 至约 100 nm 的厚度范围。某些薄膜是非常 均匀的， 且可以通过在整个薄膜表面提供均匀浓度的纳米晶体颗粒来制备， 和 / 或具有均 匀的厚度。
薄膜可以由多个纳米晶体层形成 ( 例如， 通过逐层装配 (LBL) 来制备 )。图 15 显 示了一个示例性的激活平台。参考图 15， 试验系统 1500 包括基质 1502 ( 例如， 玻璃盖玻 片 )， 所述基质具有固定化在它的表面 1504 上的激活平台 1506， 所述激活平台上放置含有 核 1510 的细胞 1508， 所述细胞具有静息电位 ( 例如， -70 mV)。在图 15A 所示的一个具体的 实施方案中， 激活平台 1506 包括量子点 1514 的多层 1512。激活平台可以包括带正电荷的 和 / 或带负电荷的量子点。在某些激活平台中， 使用带正电荷的和带负电荷的量子点的交 替层。使用的量子点层的数目由多种因素决定， 诸如使用的纳米晶体的类型、 基质的构造、 待试验的细胞的类型、 可用于制备薄膜的时间、 使用的细胞粘附层的类型、 纳米晶体的表面 涂层、 薄膜是否被图案化和使用的聚合物的类型， 但是通常是约 1 至约 30 层。 某些激活平台 使用具有小于 20 层或更少、 或约 2 至约 15 层的薄膜。其它激活平台具有 10 层或更少， 或 约 5 至约 10 层。 具体的激活平台仅使用约 5-7 层。 每个纳米晶体层可以包括相同类型的材 料。或者， 不同层可以包括不同类型的纳米晶体或不同电荷的纳米晶体。任选地， 一层或多层的材料 1516 ( 例如聚合物 ) 插入在邻近的量子点层之间。可以以此方式使用的一类聚 合物是 PDDA。在某些类型的激活平台中， 材料 1516 ( 例如聚合物 ) 被安置在基质 1502 的 表面 1518 上， 以将激活平台 1506 固定化在基质上。任选地， 粘附基质 ( 例如粘附层 ) 1520 覆盖量子点层的堆叠 1512， 以增强细胞 1508 向粘附基质 1506 的粘附。通常选择粘附层组 成， 以实现细胞和粘附基质之间的紧密接触。
另一类激活平台包括多个量子点层， 它们固定化在由诸如氧化铟锡 (ITO) 的透明 导体形成或包被的基质上。 可以用量子点层直接处理这样的基质。 或者， 这样的基质可以安 置在透光基质 （诸如玻璃显微镜载玻片） 的全部或一部分上 ( 例如， 以图案化阵列的形式 )。 激活平台包括多个层， 其中每个层包括量子点群。 所述群通常包含具有均匀尺寸的量子点。 排列量子点的层和类型以促进穿过激活平台的电子的流动， 诸如激活在激活平台表面上或 附近的细胞。通过以在结构中的具体量子点类型具有特异性的波长照射， 可以激发激活平 台。下面的示例性的激活平台解释了可以用于本文所述方法中的一个具体构造。这样的 平台包括已经固定化在一个表面上的平面 ITO 基质， 吸收红光波长的第一层纳米晶体和吸 收蓝光波长 （但不吸收红光波长） 的第二层纳米晶体。可以将纳米晶体的连续层 ( 例如， 第 三和第四层 ) 添加到所述结构上， 它们分别吸收例如绿和黄光。因为通过颗粒尺寸可以调 节量子点的传导带的能量， 所以通过优化每个连续层中的颗粒尺寸可以优化电子转移。例 如， 所述平台可以包括第一层 CdTe 纳米晶体， 其具有约 700 nm 的发射波长。所述结构包括 第二层 CdSe 纳米晶体， 其具有约 490 nm 的发射波长 ； 第三层 CdSe 纳米晶体， 其具有约 545 nm 的发射波长 ； 以及第四层 CdSe 纳米晶体， 其具有约 630 nm 的发射波长。可以将任选的 细胞粘附层安置在暴露于细胞 ( 例如， 细胞培养基 ) 的第四层的表面上。如果需要， 可以将 诸如聚 ( 亚乙基二氧噻吩 ) (PEDOT) 的有机半导体安置在 ITO 基质和 CdTe 纳米颗粒薄膜 之间， 以进一步提高薄膜效率。在该示例性的装置中， 当用红光照射时， 仅可以激发 CdTe 颗 粒。在激发 CdTe 层后， 电子可以逐层移动到激活平台的表面， 它们在这里最终调节细胞的 膜电位。
本文提供的另一个实施方案涉及一个或多个容器， 其具有安置在一个或多个表面 上的纳米结构层或激活平台层。例如， 所述容器可以是试管、 离心管或微孔板 ( 例如， 96 或 384 孔板 )。可以用上述纳米结构包被试管或平板孔的整个内表面。或者， 可以用纳米结构 包被试管或孔的下部或底部内表面。可以储存这些试验材料， 随后与细胞一起使用。
使用多种方法可以构造本文所述的纳米结构。 形成激活平台的一种代表性的方法 使用逐层 (LBL) 装配。LBL 方法包括， 将带电荷的基质 （例如带负电荷的玻璃） 浸入带正电 荷的聚电解质的溶液中。用水冲洗后， 聚电解质在基质表面上形成带正电荷的单层。浸入 带负电荷的纳米晶体溶液中形成新层， 由此转换表面电荷。这使得新的聚电解质层的吸附 成为可能。可以重复该循环需要的次数。最后， 可以安置一层或多层粘附层以覆盖薄膜结 构。
制备激活平台的另一种代表性的方法包括 ： 将含有多个纳米颗粒的组合物安置在 固体基质 ( 例如玻璃盖玻片 ) 上以形成薄膜。所述组合物可以包含聚合物 ( 例如琼脂糖、 聚甲基丙烯酸甲酯、 聚丙烯酰胺等 ) 和任选的溶剂、 引发剂或其它组分。使用本领域技术人 员已知的任意合适的安置方法， 包括例如旋转铸模、 喷雾涂布、 滴落铸模、 滚动涂布、 拖拉涂 布、 根据需要滴落喷墨打印、 PDMS( 聚二甲基硅氧烷 ) 冲压打印、 静电逐层装配， 可以将所述组合物安置在基质上。 一旦被安置在基质上， 组合物可以采取薄膜的形式， 所述薄膜中已经 嵌入多个纳米颗粒。 如果需要， 可以使用任何合适的安置方法， 将额外的纳米颗粒层安置在 基质上以产生多层的结构。可以额外地加热、 风干或交联薄膜， 以固化薄膜和 / 或去除残余 的溶剂。 在某些实施方案中， 可以将一层或多层的细胞粘附层添加到薄膜结构的上面， 以增 强细胞粘附和存活力。
其它代表性的方法包括 ： 将在有机溶液中的水不溶性的纳米颗粒 ( 例如， 量子点 ) 滴落铸模或旋转涂布到基质上。或者， 可以将水不溶性的纳米颗粒分散在挥发性的有机溶 剂中， 并喷洒到基质上。 在本文所述的任意方法中， 可以将两亲聚合物安置在纳米颗粒薄膜 上。如果使用溶剂， 在蒸发溶剂后， 可以发生两亲聚合物的安置。可以将细胞粘附层添加到 两亲聚合物的上面以增强细胞粘附和存活力。
本文还提供了试剂盒， 其用于进行光学感知、 控制和 / 或操纵靶细胞的跨膜电位 的试验。 试剂盒可以包含本文所述的激活平台， 且可以包含一个或多个额外的组分， 诸如缓 冲液、 染料、 原代神经元、 生长因子、 细胞培养基、 其它细胞和亚细胞标记物。某些试剂盒可 以包含一种或多种离子敏感的或电压 - 敏感的染料。例如， 试剂盒可以包含一种或多种荧 光钙、 钠、 钾、 ROS、 RNS、 过氧化作用或 pH 传感器。在某些实施方案中， 将激活平台固定化在 固体支持物上， 诸如容器 ( 例如试管、 离心管或多孔微滴定板 ) 或平面基质 ( 例如玻璃显微 镜载玻片 ) 的表面。其它基质类型包括传导性的陶瓷材料， 其具有在内部的激活颗粒和覆 盖它们的粘附分子， 或用于暂时和长期植入组织中的其它电极形式 （诸如心脏起搏器） 、 用 于多位点刺入组织中的细刺突样多阵列和目前处于脑刺激研究中的其它基质。 下面的实施例被包括在内来证实本发明的优选实施方案。 本领域技术人员应当理 解： 在下面的实施例中公开的技术代表发明人发现的在本发明的实践中良好地起作用的技 术， 因而可以认为构成本发明实践的优选方式。但是， 本领域技术人员应当理解 ： 根据本公 开内容， 可以在公开的具体实施方案中做出许多变化， 且仍然获得相同或类似的结果而不 脱离本发明的范围。
实施例 实施例 1 用量子点标记膜 量子点是用作电压敏感的探针的理想候选物， 因为它们的物理尺寸与细胞膜的厚度相 当， 且它们的电子性质使它们潜在地可被外部电磁场调节。参考图 6A， 光子 602（所述光子 具有第一波长， 且具有比量子点的 HOMO 价带 606 和 LUMO 传导带 608 之间的带隙 604 更高 的能量） 的吸收形成电子空穴对， 其可以辐射重组以发射具有第二波长的光子 610。强烈的 局部电场 ( 例如， 由于跨细胞脂双层的膜电位的变化 ) 可以与激发的量子点产生的自由载 荷子相互作用。图 6B 示意地说明了电场 612 可以如何调节发射的光 614 的光学性质。例 达到 107 V/m。该大的场可以 如， 跨疏水脂双层的 100 mV 的膜电位转化成强烈的局部电场， 与在照射过程中在量子点中产生的自由载荷子 ( 电子和空穴 ) 相互作用， 引起对它们的光 电性质的调节 ( 例如， 发射的光的强度和波长的变化 )。再次参考图 6B， 光 614 的光电性质 不同于在电场 612 存在下的光 610 的那些光电性质。
如上面讨论的， 可购得的 QDOT 纳米晶体已被工程化以使环境不敏感性最大化， 且
通常不会满足电压感知应用。对于用作有效电压 - 传感器和 / 或激活器， 必须以将电场的 变化转换成量子点发射的变化的方式， 工程化纳米颗粒的结构。 实现该灵敏度的选择包括 ： 吸收效率的变化、 激子行为或发射的光子的调节。另外， 为了最大效率地感知膜电位变化， 量子点必须位于细胞膜中或非常接近细胞膜， 通常在最高跨膜电场梯度内。 参考图 7A， 将纳 米颗粒 702 定位在静息细胞的磷脂细胞膜 704 内， 所述静息细胞具有在细胞外的净正电荷 706( 如侧面 708 所示 ) 和在细胞内的净负电荷 710( 如侧面 712 所示 )。图 7B 描述了在细 胞去极化后磷脂细胞膜 704 上的电荷的反转。为了确保纳米颗粒的膜内定位， 本文提供了 包括专业化的涂层 （诸如聚乙酰亚胺 （PEI） ） 的材料。包被的纳米晶体位于多种细胞类型的 膜内。图 8 显示了 CHO 细胞 (A)、 NG108 细胞 (B) 和神经元网络 (C)， 其具有用一类量子点 标记的膜。
实施例 2 量子点的筛选试验 提供了基于 QDOT 纳米晶体的光学电压传感器， 以监测细胞膜电位的快速变化。当位于 细胞膜内时， 纳米颗粒对跨膜电压梯度的变化敏感， 并检测跨膜电压梯度的变化， 并将它 报告为它们的发射性质的变化。制备和筛选了一系列的量子点， 以监测它们响应于细胞的 化学和电刺激的光学性质。
A. 化学刺激的影响 根据下述方案， 监测化学刺激对量子点处理过的细胞的影响。在 96- 孔板中将细胞与 基于纳米晶体的电压传感器一起孵育 1 小时， 然后洗掉任何多余的纳米颗粒。使用适合高 容量成像实验的化学刺激物 (100 mM KCl) 来去极化标记的细胞群。图 10 显示了一系列用 相同的核心 - 壳量子点 ( 用 PEI 官能化 ) 标记的细胞随时间的发射强度 ( 表示为相对荧光 强度 , RFU)。响应于去极化刺激， 2 种不同类型的 PEI 包被的核心 - 壳量子点 ( 在图 11 中 鉴别为 X 和 Y) 的荧光强度表现出 ~50 % 荧光变化 /100 mV。
B．膜片钳试验 经由通过膜片电极以全细胞模式递送给细胞的电压阶跃去极化， 使用标准的电生理方 法直接控制细胞膜电位。图 12 显示了用电极 1202 电刺激的 CHO 细胞 1200。图 9 显示了用 基于量子点的电压传感器标记的 CHO 细胞的荧光图像。图 13 显示了电生理刺激引起的用 基于量子点的电压传感器标记的细胞的荧光强度变化。图 13A 显示了沿着相同时间标尺的 电压刺激方案。
在这些实验过程中发现基于纳米晶体的电压传感器的荧光应答与膜电位的电生 理记录相关联。结果证实 ： 基于纳米晶体的电压传感器表现出在生理膜电位范围内的电压 灵敏度， 并为细胞成像带来额外的优点， 所述优点由半导体纳米颗粒的独特的光学性质 （诸 如耐光性、 大斯托克斯位移和多路能力） 提供。
实施例 3 基于量子点的激活平台 描述了用于远距离可逆操纵膜电位的光控激活平台。 所述的材料和方法提供了被动监 测细胞功能性活动的替代方案， 并提供了非侵入地操纵细胞的膜电位的能力， 这对于理解 它们的发育、 通讯和命运而言是至关重要的。传统的非生理学方法最常见地依赖于药理学 干预 （通过加入 “高 K+” 溶液或药理学通道开放剂或用微电极直接刺激细胞） 。但是， 这些非生理学方法具有严重的缺点， 包括缺少膜电位的控制、 引起的变化的不可逆性和低瞬时分 辨力。
本文提供的替代方案使用光来以时间上精确的且空间上分辨的方式触发膜电位 的远距离可逆操纵。光逐渐被采纳于体外和体内用途中。例如， 使用光来操纵遗传编码的 光敏感的蛋白， 诸如天然存在的 ( 光敏感通道 , ChR2) 或化学修饰的离子通道， 尽管需要在 目标细胞中高水平地表达外源蛋白。 以刺激本文所述纳米晶体所需的水平光刺激这些和其 它类型的细胞 ( 例如， 在有纳米晶体存在下 ) 显示对细胞电位没有影响 ( 数据未显示 )。
量子点代表活细胞的光控电激活的一种替代方案。 如上面讨论的， 在暴露于光后， 量子点可以产生自由的电子和空穴。这些自由载荷子的命运是 1) 辐射重组， 并发射光 ； 或 2) 逃逸， 并产生电流。参考图 14， 光子 1402（所述光子具有比量子点的 HOMO 价带 1406 和 LUMO 传导带 1408 之间的带隙 1404 更高的能量） 的吸收形成电子空穴对。如果释放一个或 多个自由载荷子 ( 即电子 (e-) 1410)， 则不会发生能发射光的辐射重组 ( 描述为禁阻跃迁 1412)。
正如已经工程化量子点纳米晶体来使辐射重组 ( 荧光 ) 最大化， 本文描述了纳米 晶体颗粒， 其已经工程化以使电流最大化。 当这样的量子点形成三维阵列时， 它们之间的强 电子偶联产生具有更长寿命的激子， 并促进光产生的自由载荷子的收集和运输。光产生的 载体分离、 运输和跨与生物界面的联系的界面转移的速率都必须快速以使输出最大化。对 于光转换效率的提高而言重要的是电荷分离效率以及促进穿过纳米结构化的平台的电荷 运输。
为了解决用于生物学应用的光控激活平台的需要， 可以利用量子点的光电子性质 来开发纳米结构化的生物相容的界面， 其由被粘附层包被的半导体纳米晶体的堆或层组 成。为了制备用于细胞激活的多层化的量子点薄膜， 使用逐层 (LBL) 安置方法 ( 诸如在实 施例 9 和 10 中所述的 ) 来将量子点装配到玻璃盖玻片上。进行研究来测定粘附基质 ( 例 如， 由聚 -L- 赖氨酸形成的层 ) 是否改善了细胞与激活平台的附着。使用没有粘附层 ( 或 粘附基质 ) 的纳米晶体层的初期实验证实 10% 或更少的细胞附着到纳米晶体层上。该低水 平的细胞可用性使测定不能工作。包含粘附层会使细胞附着到基质上， 其具有的额外优势 是减小细胞和激活材料之间的距离。成像研究显示本文所述的粘附分子与基质均匀地、 紧 密联系地接触。此外， 在纳米晶体和细胞之间加入粘附层不会干扰纳米晶体和细胞之间的 能量转移 ( 例如， 通过形成绝缘层 )。细胞与激活平台的高度粘附 ( 例如， 90% 或更多的细 胞粘附 ) 是重要的， 因为光能向细胞膜电位变化的转换效率与基质和细胞之间的距离成反 比。此外， 粘附分子对于大多数细胞、 尤其是神经元的充分分化、 扩散、 附着是关键的。当这 些纳米晶体放置在细胞附近并用可见光照射时， 由光激发的纳米晶体 ( 或光诱导的电流 ) 产生的累积电磁场会调节细胞膜电位。因而， 该基于纳米晶体的光控激活平台允许生理学 地 ( 电场 ) 和重复地刺激细胞。此外， 该激活平台与任意荧光读出相容， 因为由于宽吸收波 谱， 半导体纳米晶体可以被比它们的发射波长更短的任意光激发。
实施例 4 细胞的光控激活 在多种光控实验中使用诸如在实施例 3 中所述的激活平台， 所述实验设计为监测激活 平台对不同类型的细胞的膜电位的影响。使用电流钳构造来记录光引起的可兴奋细胞和不可兴奋细胞的膜电位的变化。 图 17 显示了一个示例性的电流钳构造 1700， 其包含透明的盖玻片 1702， 所述盖玻片具有固 定化在它的表面 1704 上的被壁 1708 包围的激活平台 1706。激活平台由量子点 1726 和聚 合物 1728 ( 例如聚 ( 二烯丙基二甲基氯化铵 ) (PDDA)) 的交替层形成。细胞 1710 停留在 激活平台 1706 的上表面 1712 上。含水介质 ( 例如水、 缓冲液或细胞培养基 )1714 覆盖激 活平台 1706 和细胞 1710。电极 1716 插入细胞 1710。参照电极 1718 浸入含水介质 1714 中。通过使来自水银灯 ( 未显示 ) 的 “激活” 光 1720 穿过物镜 1722， 使得光进入透明的盖 玻片 1702 的底面 1724 来实现细胞的去极化。典型地， 使用短脉冲光 ( 例如， 在 350 和 450 nm 之间， 使用来自弧光灯的宽带激发或来自激光源的窄带 ) 照射激活平台。光穿过透明的 盖玻片， 并照射激活平台 1706。包含在激活平台 1706 中的量子点 1726 的激发， 触发细胞 1710 的膜电位和动作电位 (mV) 的变化。
使用多层激活平台测定量子点对可兴奋细胞和不可兴奋细胞类型 (CHO 细胞、 RBL 细胞、 NG108 细胞、 海马神经元 ) 的影响。在聚 -L- 赖氨酸包被的纳米晶体分层的玻璃盖玻 片上培养细胞 3-14 天。图 16 显示了在基于量子点的激活盖玻片上培养的海马神经元的原 代培养物的明视野伪相差 （pseudo phase） 图像。在这些实验过程中， 没有观察到纳米晶体 对细胞形态学、 分化或生理应答的不利影响。图 18 显示了在用光脉冲 1800 重复触发在基 于量子点的激活盖玻片上培养的海马神经元原代培养物后， 膜电位的变化。细胞中的去极 化应答与光强度成比例， 且它们的吸收应答 ( 例如波长依赖性 ) 与在激活平台中使用的纳 米材料的预期吸收性质直接平行。 在激活平台盖玻片上培养的神经元的光暴露引起膜去极 化， 其触发动作电位 1802。图 19 显示了使用第一电流脉冲 1910 注射 ( 通过图 17 所示的膜 片钳电极 )、 光脉冲 1902 和第二电流脉冲 1912， 交替产生的动作电位在基于量子点的光控 激活平台上培养的 NG108 细胞中引起的膜电位的变化。 光暴露 1902 引起膜去极化， 其触发 动作电位 1904。得到的动作电位 1904（由光脉冲 1902 产生） 与使用电流脉冲注射 1910 和 1912 引起的动作电位 1906 和 1908 相当。无论刺激来源如何， 动作电位的时间和量级几乎 相同， 尽管光诱导的刺激的恢复 ( 复极化 ) 表现出一些轻微的差异。
在光照射后， 激活平台表现出重复去极化不可兴奋细胞 (CHO 细胞、 RBL 细胞 ) 的 膜的能力 ( 数据未显示 )， 并在可兴奋细胞 （诸如 NG108 细胞和海马神经元原代培养物） 中 产生动作电位， 唯一的限制是千兆封口稳定性。 千兆封口电极在长时间段后失效， 具有按小 时测量的有限的实用性， 这进一步证实了本文所述的非侵入的、 基于光学的方法的实用性。
实施例 5 监测细胞活性的集成的光学试验 描述了集成的光学试验， 其组合了光学刺激 ( 通过激活平台盖玻片 ) 和细胞活性的光 学记录。 测量细胞内钙浓度的变化 ( 通过钙指示染料 ) 来监测细胞的光触发的激活的影响。
在该实验中使用玻璃盖玻片， 其具有固定化在它的表面上激活平台， 诸如在实 施例 1-4 中所述的。由于这些纳米晶体包被的激活平台是透明的， 它们与不同的光学询 问方法相容。使用标准方法， 使 NG108 细胞负载 Fluo-4 ( 一种荧光钙指示剂， 购自 Life Technologies Corporation ； Carlsbad, CA)。图 20 显示了在激活光脉冲之前 (A) 和之后 (B) 负载的 NG108 细胞的明视野图像。在照射激活平台后， Fluo-4 指示剂发出荧光， 指示细 胞内钙水平的增加。图 21 显示了在激活光脉冲 (380 nm) ( 在箭头指示的时间 ) 之前和之后 Fluo-4 指示染料的荧光强度的变化， 并表示穿过 NG108 细胞中光触发的动作电位所涉及 的电压门控钙通道的钙流入。结果表明， 通过纳米材料涂层将光向电场的转换以及随后电 压依赖性钙流的开放， 细胞的光触发的电去极化会引起细胞内钙浓度增加。在图 20B 中所 示的增加的荧光是由于进入细胞中的钙和结合其的荧光探针。该实施例证实， 光启动的去 极化会产生与使用膜片钳实验 （其中电子记录去极化） 所得到的结果相同的结果。
实施例 6 神经元网络的不均匀激活 如实施例 5 所述， 给海马神经元的原代培养物负载 Fluo-4 钙指示剂。图 22 显示了在 激活光脉冲之前 (A) 和之后 (B) Fluo-4 负载的海马神经元的图像。激活光脉冲造成细胞 内钙水平的增加， 其诱导 Fluo-4 指示剂的荧光性质的变化。如图 22B 所示， 激活的细胞引 起指示剂发荧光。图 23 的图显示了光触发的神经元网络激活引起的 Fluo-4 荧光强度随 时间的变化， 并反映了神经元的细胞内钙浓度的变化。 在箭头指示的时间， 发生激活光脉冲 (380 nm)。数据证实， 光激发引起神经元网络的不均匀激活。在这里， 一些神经元直接被光 激活 ( 注意到快速升高的钙流 )， 而其它神经元通过神经元间连接 ( 注意到延迟的和有时多 峰的钙流模式 ) 被间接地激活。图 21 和图 23 中的数据证实， 使用激活平台光触发细胞的 激活， 引起细胞内钙浓度增加。 数据进一步证实， 基于纳米晶体的激活平台可以用于递送与 所述记录的光学方法相容的生理学上有关的激活刺激。
实施例 7 包被的纳米晶体的制备 将根据美国专利号 6,322,901 的实施例 1 制备的氧化三辛基膦 (TOPO) 包被的 CdSe 纳 米晶体与大大过量的硫代甘油混合。在 70℃将混合物搅拌过夜。次日早晨， 加入异丙醇来 沉淀纳米晶体。将纳米晶体重新分散于 0.1M NaHCO3 中， 随后加入异丙醇， 以再次沉淀纳米 晶体来去除溶液中任何残余的硫代甘油。加入 0.1M NaHCO3， 以分散纳米晶体。纳米晶体 可以进一步使用超滤过滤器纯化。使用相同的方法用巯基乙酸或硫辛酸处理 TOPO 包被的 CdSe 纳米晶体。
实施例 8 聚乙酰亚胺包被的纳米晶体的制备 将根据美国专利号 6,322,901 的实施例 1 制备的氧化三辛基膦包被的 CdSe 纳米晶体 与吡啶混合， 并在搅拌下在 110℃加热 5 小时。 将聚乙酰亚胺溶于重量浓度为 5-15% 的乙醇 中。然后， 将聚合物溶液加入纳米晶体溶液， 并在 70℃搅拌过夜。次日早晨， 使用旋转式蒸 发器去除多余的溶剂。向剩余的纳米晶体中加入去离子蒸馏水以分散纳米晶体。最后， 使 用超滤过滤器纯化纳米晶体以去除多余的聚合物。
实施例 9 纳米晶体膜的制备 (LBL 方法 ) 在超声浴中， 在 0.5M NaOH 溶液中清洁玻璃盖玻片。在去离子蒸馏水中彻底冲洗清洁 过的盖玻片， 并立即浸入聚 ( 二烯丙基二甲基铵 ) (PDDA) 溶液中。10 分钟后， 从 PDDA 溶 液中取出盖玻片， 并在去离子蒸馏水中彻底冲洗以去除任何未结合的 PDDA。冲洗后， 将盖 玻片浸入硫代甘油包被的水溶性的 CdSe 纳米晶体溶液中以沉积一层量子点薄膜。10 分钟 后， 从 CdSe 溶液取出盖玻片， 并在水中彻底冲洗以去除任何未结合的 CdSe 纳米晶体。通过交替地重复浸入 PDDA 和 CdSe 溶液， 可以沉积其它层的量子点薄膜， 直到达到希望的薄膜厚 度。
实施例 10 分层的纳米晶体薄膜的制备 (LBL 方法 ) 如实施例 9 所述， 用 PDDA 清洁和处理玻璃盖玻片。冲洗后， 将盖玻片浸入巯基乙酸包 被的水溶性的 CdSe 纳米晶体溶液以沉积第一层量子点薄膜。 10 分钟后， 从 CdSe- 巯基乙酸 溶液中取出盖玻片， 并在水中彻底冲洗以去除任何未结合的纳米晶体。 冲洗后， 将盖玻片放 入聚乙酰亚胺包被的水溶性的 CdSe 纳米晶体溶液以沉积一层带正电荷的量子点薄膜。通 过交替沉积带相反电荷的水溶性的纳米晶体可以沉积其它的量子点层。
实施例 11 激活平台的聚赖氨酸处理 通过如实施例 9 和 10 所述的逐层 (LBL) 方法制备量子点薄膜后， 将盖玻片浸入聚赖氨 酸溶液 30 分钟。然后从聚赖氨酸溶液中取出盖玻片， 在水中彻底冲洗以去除任何未结合的 材料， 并在氮气下干燥。或者， 根据量子点薄膜的表面电荷， 首先将盖玻片浸入聚苯乙烯磺 酸酯溶液 10 分钟， 然后在水中洗涤盖玻片， 再浸入聚赖氨酸溶液。 实施例 12 ITO 激活平台的制备 描述了在氧化铟锡 (ITO) 基质表面上安置量子点的方法。将 ITO 基质浸入水和聚阳离 子聚合物 ( 例如， PDDA) 的溶液中。由于 ITO 具有带负电荷的表面， 因此阳离子聚合物可以 粘附到 ITO 上， 并使其表面带正电荷。 用去离子水洗涤 ITO 基质， 然后浸入带负电荷的 CdTe 纳米颗粒 ( 例如， 二氢硫辛酸 (DHLA) 包被的 CdTe) 的水溶液。带负电荷的颗粒会粘附到基 质上的阳离子聚合物表面， 并使表面带负电荷。可以重复该过程以产生具有多个纳米颗粒 层的装置。基于 ITO 的激活平台可以任选地连接成回路以建立持续的电荷流。
实施例 13 量子点薄膜的旋转涂布 在热板上， 以 1% w/v 浓度， 将电泳级琼脂糖溶于 0.1M NaHCO3 中。在琼脂糖溶液变得 完全光学澄清后， 在搅拌下， 将小量巯基乙酸包被的水溶性的 CdSe 纳米晶体加入琼脂糖溶 液中。趁热将琼脂糖溶液倒至或旋转涂布至化学处理过的玻璃盖玻片上。在环境温度风干 后， 在盖玻片上形成嵌有量子点的琼脂糖薄膜。
实施例 14 InP 纳米晶体的制备 如下制备 InP 核心。在惰性气氛下的反应烧瓶中， 混合 0.88 g 醋酸铟 (In(OAc)3)、 0.254 g 油酸和 14.8 g 1- 十八烷烯 (ODE)（经过纯化以去除氧） 和水。将烧瓶的内含物 加热至 260℃， 同时将氮气流通入烧瓶以随时去除形成的醋酸。在该温度 5 分钟后， 停止氮 气流。通过将 0.45 g TMS3P 加入 7.101 g ODE 中来制备 0.02 M 的三 ( 三甲基甲硅烷基 ) 膦 (TMS3P) 在 ODE 中的溶液。将烧瓶的内含物加热至 300℃。在 300℃， 将 TMS3P 溶液快速 注入混合物。通过标准方法 ( 达到希望的荧光发射波长 ) 监测纳米晶体形成， 直到得到希 望的颗粒尺寸的 InP 核心， 然后将反应冷却至室温。
实施例 15
CdSe 纳米晶体的制备 将 TDPA (0.549 g)、 TOPO (6.000 g) 和磁力搅拌棒加入干净的、 干燥的 50 mL 3 颈圆 底烧瓶中。 烧瓶的第一个口配有气体进入接头， 以允许抽气和氮气回充， 第二个口配有温度 探头， 其连接温度控制装置， 第三个口配有橡胶隔片。 抽空烧瓶， 并重新充满氮气， 并维持在 氮气氛下。加入 TOP (3.6 mL) 和 1.972 g Cd-TOP 溶液 ( 含有溶于 TOP 中的醋酸镉， 浓度 为 0.5 mol 镉 /kg 溶液 )。将针插入在第三个孔上的隔片。加热混合物到 260℃， 并在该温 度保持 20 分钟。取下针， 并将反应烧瓶加热至 355℃。在该加热步骤期间， 加入二苯基膦 (0.030 mL)， 并在 340℃加入 1.4 ml TOP-Se (1M 在 TOP 中的硒粒 )。每 30 秒取试样以测 定当前的发射最大值。通过加入 4.0 ml 室温 TOP 来停止反应。
实施例 16 具有薄 CdS 壳的 CdSe 核心的制备 将 TOPO (3.383 g) 和磁力搅拌棒加入 50 mL 3 颈圆底烧瓶。如实施例 1 所述配备口 1、 2 和 3。 抽空烧瓶， 并重新充满氮气。 在真空和恒定搅拌下， 将 TOPO 加热至 180℃ 1 小时。 给烧瓶重新充满氮气， 并冷却至 100℃， 然后加入 TOP (3.4 mL)。将乙醇 (21.3 mL) 和在实 施例 15 中制备的核心样品 (10.7 mL， 温热至 50℃ ) 加入 60 mL 离心管。将混合物离心， 抛 弃上清液， 并将沉淀物重新分散在己烷中。然后将分散物加入 100℃的反应烧瓶。抽真空， 以去除己烷， 剩下分散在 TOPO 和 TOP 中的纳米晶体。 将癸胺 (2.8 mL) 加入反应烧瓶。 在第 二个烧瓶中， 在氮气氛下， 将 3.905 g 在实施例 15 中所述的 Cd-TOP 溶液、 TDPA (2.730 g) 和 TOP (2.7 mL) 的混合物暂时加热至 250℃， 然后冷却至 100℃。45 分钟后， 将 2.5 ml 醋 酸镉 /TDPA/TOP 溶液加入至核心中。将反应烧瓶加热至 230℃， 并在 3 小时的时间段内， 逐 滴加入 3.9 ml 含有 TOP (2.926 g) 和六甲基二硅硫烷 (0.203 g) 的溶液。如果需要更薄 的壳， 在例如 1 或 2 小时时停止滴加。定期从反应中取出试样以跟踪发射性质。
根据本公开内容， 无需过多实验就可以制备和执行本文公开的和要求保护的所有 组合物和 / 或方法和 / 或过程和 / 或仪器。尽管已经以优选实施方案的方式描述了本发明 的组合物和方法， 本领域技术人员应明白 ： 可以将变化施加于所述组合物和 / 或方法和 / 或 仪器和 / 或过程以及本文所述方法的步骤或步骤次序， 而不脱离本发明的概念和范围。更 具体地， 应当明白 ： 化学上和生理学上有关的某些试剂可以替换本文所述的试剂并达到相 同或类似的结果。 对于本领域技术人员显而易见的所有这些类似的替换和修饰应视作在本 发明的范围和概念内。