本发明特别涉及对抗支原体感染的疫苗，涉及用在这些疫苗中的 支原体L-α-甘油磷酸氧化酶，涉及支原体L-α-甘油磷酸氧化酶生 产这些疫苗的用途，涉及这些疫苗的制备方法并且涉及诊断性测试， 所述诊断性测试用来识别接种所述疫苗的动物以及接种了全细胞疫苗 的动物或遭受野外感染的动物。
在进化过程中，病原性细菌已经发展出与其宿主的复杂相互作用。 这经常包括获得致病岛、质粒、转座子或原噬菌体上的毒力因子，让 它们在宿主内定殖、存活并复制。相反地，支原体物种，最小的自我 复制生物，通过将基因组减小到最小的大小而由革兰氏阳性细菌退行 演化，结果使得它们的遗传资源得以有效利用。
支原体物种代表在地球上检测到的最小自我复制生物。它们的基 因组从生殖道支原体(Mycoplasma genitalium)中的580千碱基对(kb) (Fraser，C.M.et al.1995，Science 270：397-403)到穿透支 原体(Mycoplasma penetrans)中的1358kb(Sasaki，Y.et al， 2002，Nucleic Acids Res.30：5293-5300)。这导致遗传资源的极 端节约和专性寄生生活方式。病原性支原体物种主要引发人和动物的 非典型性肺炎，泌尿生殖器感染和关节炎(Baseman，J.B.和J.G. Tully，1997，Emerg.Infect.Dis.3：21-32，Blanchard，A.和 G.F.Browning(eds.).2005.Mycoplasmas：Molecular biology， pathogenicity and strategies for control.Horizon Bioscience， Wymondham，U.K.Frey，J.2002.Mycopla smas of Animals，p.73 -90.In S.Razin和R.Herrmann(eds.)，Molecular biology and pathogenicity of Mycoplasmas.Kluwer Academic/Plenum Publishers，New York)。这里强调的是由于已知有支原体物种感染 人类(例如生殖道支原体，肺炎支原体(M.pneumoniae))，牛物种(例 如支原体物种牛7型(m.sp bovine group 7))，猪(例如猪肺炎支 原体(Mycoplasma hyopneumoniae))或家禽(例如鸡败血支原体(M. gallisepticum))，当在本文中提到动物时，这应当被认为特别包括 人类、牛物种、猪和家禽等。
如通过八个完全测序物种的基因组序列分析所揭示，与毒力主要 由毒素、侵袭素和溶细胞素所决定的其它病原性细菌相反，病原性支 原体物种似乎没有这些典型的主要毒力因子(Chambaud，I.et al， 2001，Nucleic Acids Res.29：2145-2153，Fraser ET AL.1995， Science 270：397-403，Himmelreich，R.et al.1996，Nucleic Acids Res.24：4420-4449，Jaffe，J.D.et al，2004，Genome Res.14： 1447-1461，Minion，F.C.et al.2004，J.Bacteriol.186： 7123-7133，Papazisi，L.et al，2003，Microbiology 149：2307-2316， Sasaki，Y.et al.2002，Nucleic Acids Res.30：5293-5300， Westberg，J.et al.2004，Genome Res.14：221-227)。
尽管支原体感染的诊断自从引入PCR方法以来得到显著改进并且 在几种支原体物种中详细研究了抗原性变化，但目前对于使得病原性 支原体引发宿主细胞损伤、炎症和疾病的分子机制和效应物知之甚少。 所以，非常需要发展特别旨在预防这些有害效应的疫苗。
本发明的目标是提供对抗支原体感染的疫苗，其避免或减少宿主 细胞损伤、炎症和疾病。
令人吃惊的是，发现一种新的主要毒力因子是支原体细胞损害的 重要原因。这种毒力因子似乎由毒性副产物如H2O2和其它伴随的活性 氧物质(ROS)组成。
可以显示H2O2/ROS的形成可以与支原体L-α-甘油磷酸氧化酶 (GlpO)的活性直接相关，所述酶涉及甘油的代谢。
更加出乎意料地，可以证明H2O2/ROS的形成是支原体感染引发的 组织损伤的主要(如果不是唯一)原因。这意味着现在第一次定义了 支原体的主要毒力因子。
支原体中的甘油代谢途径不能被轻易地影响或改变，所以，照这 样，H2O2/ROS的形成不能轻易地通过改造支原体中的甘油代谢途径来 改变。所以，与非支原体物种中的情形相反，开发活的减毒支原体的 途径似乎不太可行。
不过，现在令人吃惊地发现，与支原体L-α-甘油磷酸氧化酶反 应的抗体能够将H2O2/ROS的产生遏制到对于受感染动物的组织产生极 少或完全没有损害的程度。这打开了用特别是亚单位疫苗进行疫苗接 种的途径，下面进行解释。
鉴于在所有非支原体细菌中在细胞内发现具有甘油磷酸氧化酶活 性的酶这一事实，这还要更加令人吃惊，因为在这些细胞中的过氧化 氢酶在H2O2形成后立即将其降解。因而在这些情况下，针对甘油磷酸 氧化酶的抗体没有任何作用，因为它们不能进入细菌。现在发现与所 有非支原体细菌相反，并且显然作为缺少过氧化氢酶的结果，支原体 在进化过程中已经将其支原体L-α-甘油磷酸氧化酶由细胞内空间转 移到膜上，以此方式它导致细胞外H2O2的产生。所以这对细菌无害， 但现在变得对受感染宿主的组织有害。这可能解释对于支原体来说， 针对支原体L-α-甘油磷酸氧化酶的抗体(与其它细菌相反)出乎意料 地确实干扰释放细胞外H2O2的酶活性。
支原体酶支原体L-α-甘油磷酸氧化酶存在于所有已知的支原体 物种中。所有关于L-α-甘油磷酸氧化酶的进一步表述都指支原体L- α-甘油磷酸氧化酶。在下表1中，EMBL/GenBank登录号表示在下列 支原体物种菌株中编码支原体L-α-甘油磷酸氧化酶的基因：支原 体物种牛7型，蕈状支原体山羊亚种(M.mycoides subsp.Capri)， 穿透支原体(M.penetrans)，鸡败血支原体，运动支原体(m.mobile)， 肺支原体(M.pulmonis)，猪肺炎支原体(M.hyopneumoniae)， 肺炎支原体(M.pneumoniae)，生殖道支原体(M.genitalium)。 此外，在实施例中，EMBL/GenBank登录号表示在支原体物种蕈状支原 体SC(小菌落)菌株Afadé和L2菌株中编码支原体L-α-甘油 磷酸氧化酶的基因。
由于酶支原体L-α-甘油磷酸氧化酶存在于所有已知的支原体物 种中这一事实，其用于培育针对这种蛋白质的抗体来对抗支原体感染， 更特别用来避免或减少宿主细胞损伤、炎症和疾病的用途是普遍适用 的，而不管支原体物种为何。
培育针对支原体的抗体的原理将在下面实施例中进行解释。
利用蕈状支原体蕈状亚种SC作为模型来研究支原体毒力的分子 基础，所述蕈状支原体蕈状亚种SC是传染性牛胸膜肺炎(CBPP)-一种 造成家畜重大损失的严重的感染性疾病的病原体。蕈状支原体蕈状亚 种SC是细胞外病原，具有1211kb的基因组大小(Westberg，J.et al.2004，Genome Res.14：221-227)，其与宿主细胞紧密关联生 活。使用这一物种作为模型的基本原理是这一物种的高毒力以及它作 为CBPP病原体已清楚确证的事实。另外，这种严重的牛疾病对于目前 遭受CBPP爆发的国家的家畜生产具有特别的社会经济学重要性。此 外，没有这种流行病的国家不断受到再度出现感染的威胁。
由于目前已经确证针对支原体L-α-甘油磷酸氧化酶的抗体可以 用来对抗支原体感染，更加具体地是避免或减少宿主细胞损伤、炎症 和疾病，所以下一步是使用支原体L-α-甘油磷酸氧化酶来在体内和 体外生成抗体。体内使用支原体L-α-甘油磷酸氧化酶的实例是在疫 苗中使用。当施用时，这种疫苗诱导针对支原体的抗体。这将在下面 详细讨论。体内或体外使用支原体L-α-甘油磷酸氧化酶的实例是培 育抗体用在疫苗中。这种疫苗也将在下面讨论。
备选疫苗是基于携带编码支原体L-α-甘油磷酸氧化酶(的免疫 原性部分)的基因或其部分的活重组载体的疫苗，和包含编码支原体 L-α-甘油磷酸氧化酶(的免疫原性部分)的基因或其部分的DNA疫苗。
由于编码各种支原体物种中的酶支原体L-α-甘油磷酸氧化酶的 序列是已知的，现在有可能获得足够量的酶支原体L-α-甘油磷酸氧 化酶。这可以例如通过利用表达系统来表达编码这些蛋白质的基因来 实现。
表达编码支原体L-α-甘油磷酸氧化酶(的免疫原性部分)的基 因或其部分的基本要求是功能性连接到基因上的适当启动子，从而使 得基因在该启动子的控制之下。这可以通过例如标准分子生物学技术 来实现(Sambrook，J.和Russell，D.W.Mocecular cloning：a laboratory manual，2001.ISBN 0-87969-577-3)。对于本领域技术 人员显而易见的是启动子的选择延伸到任何能够引导细胞中的基因转 录的真核、原核或病毒启动子，所述细胞用作蛋白质表达的宿主细胞。 功能性连接的启动子是能够控制其所连接的核酸的转录的启动子。
这种启动子可以是支原体启动子，例如涉及编码支原体L-α-甘 油磷酸氧化酶的基因的体内表达的启动子，条件是所述启动子在用于 表达的细胞中是功能性的。它还可以是异源的启动子。当宿主细胞是 细菌时，可以使用的有用表达控制序列包括Trp启动子和操纵子 (Goeddel，et al.Nucl.Acids Res.8，4057，1980)；lac启动 子和操纵子(Chang，et al.Nature，275，615，1978)；外膜蛋白 质启动子(Nakamura，K.和Inouge，M.EMBO J.1，771-775，1982)； 噬菌体λ启动子和操纵子(Remaut，E.et al.Nucl.Ac ids Res. 11，4677-4688，1983)；α-淀粉酶(枯草芽孢杆菌(B.subtilis)) 启动子和操纵子，终止序列和其它与所选宿主细胞相容的表达增强和 控制序列。
当宿主细胞是酵母时，有用的表达控制序列包括，例如，α-交配 因子。对于昆虫细胞来说可以使用杆状病毒的多角体蛋白或p10启动 子(Smith，G.E.et al.Mol.Cell.Biol.3，2156-65，1983)。 当宿主细胞是哺乳动物来源时例示性的有用表达控制序列包括SV-40 启动子(Berman，P.W.et al.Science，222，524-527，1983)或 金属硫蛋白启动子(Brinster，R.L.Nature，296，39-42，1982) 或热激启动子(Voellmy et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82， 4949-53，1985)。
细菌，酵母，真菌，昆虫和哺乳动物细胞表达系统是非常常用的 系统。这些系统是本领域公知的并且通常可获得，例如通过Invitrogen (www.invitrogen.com)，Novagen(www.merckbiosciences.de)或 Clontech Laboratories，Inc.4030 Fabian Way，Palo Alto， California 94303-4607，USA商购。在这些表达系统其次，基于寄生 虫的表达系统是非常有吸引力的表达系统。这些系统描述于例如法国 专利申请公开号2714074中，和US NTIS公开号US 08/043109中 (Hoffman，S.和Rogers，W.公开日1993-12-01).
然而当蛋白质用于例如接种疫苗目的或培育抗体时，不必要使用 完整蛋白质。还有可能使用该蛋白质的片段，其(本身或偶联到载体 如例如KLH上)能够诱导针对该蛋白质的免疫应答，即所谓的免疫原 性片段。据理解″免疫原性片段″是全长蛋白质的片段，其仍然保留它 在宿主中诱导免疫应答的能力，即包含B-或T-细胞表位。此时，可以 使用多种技术轻易地识别编码抗原性片段(决定簇)的DNA片段。由 Geysen等(专利申请WO 84/03564，专利申请WO 86/06487，US专 利NR.4,833,092，Proc.Natl Acad.Sci.81：3998-4002(1984)， J.Imm.Meth.102，259-274(1987))所述的方法-所谓PEPSCAN方 法是易于实施，快速和充分确证的用于检测表位的方法；所述表位即 蛋白质的在免疫上重要的区域。该方法在全世界使用并且是本领域技 术人员公知的。这种(经验式)方法尤其适于检测B-细胞表位。另外， 给定编码任何蛋白质的基因序列，计算机算法能够基于其与目前已知 的表位的序列和/或结构一致性指定特异性蛋白质片段为免疫上重要 的表位。这些区域的确定是基于根据Hopp和Woods的亲水性标准 (Proc.Natl.Acad.Sci.78：38248-3828(1981))与根据Chou和 Fasman的二级结构方面(Advances in Enzymology 47：45-148(1987) 和美国专利4,554,101)的组合。通过计算机辅之Berzofsky的双亲性 标准(Science 235，1059-1062(1987)和US专利申请NTIS US 07/005,885)由序列可以类似地预测T-细胞表位。精简的综述见于： Shan Lu关于一般原理：Tibtech 9：238-242(1991)，Good et al 关于疟疾表位；Science 235：1059-1062(1987)，Lu的综述；Vaccine 10：3-7(1992)，Berzowsky关于HIV-表位；The FASEB Journal 5：2412-2418(1991)。
所以，本发明的第一个实施方案涉及用于对抗支原体感染的疫苗， 其包含支原体L-α-甘油磷酸氧化酶或其免疫原性片段，和可药用的 载体。
如下所述通过混合支原体L-α-甘油磷酸氧化酶或其免疫原性片 段与可药用的载体可以轻易地制成基于这些基因的表达产物的这些疫 苗。
本发明的另一个实施方案涉及支原体L-α-甘油磷酸氧化酶或其 免疫原性片段用于疫苗中。
还有另一个实施方案涉及支原体L-α-甘油磷酸氧化酶或其免疫 原性片段的用途，用来生产对抗支原体感染的疫苗。
另一种非常有吸引力的用来对抗支原体感染的疫苗接种方法是通 过使用活重组载体(LRC)，其包含编码支原体L-α-甘油磷酸氧化酶或 其免疫原性片段的基因或其片段，连同可药用的载体。这些LRC是微 生物或病毒，其中已经克隆了附加的遗传信息，在此情况下是编码支 原体L-α-甘油磷酸氧化酶或其免疫原性片段的基因或其片段。用这 些LRC感染的动物将产生免疫原性应答，不仅针对载体的免疫原，还 针对将其遗传密码另外克隆到LRC中的蛋白质例如支原体L-α-甘油 磷酸氧化酶的免疫原性部分。作为细菌LRC的实例，有吸引力地可以 使用本领域已知的减毒沙门氏菌(Salmonella)菌株。
Vermeulen，A.N.已经特别描述了活重组载体寄生虫(Int.Journ. Parasitol.28：1121-1130(1998))。
另外，LRC病毒可以用作将核酸运输到靶细胞中的途径。活重组 载体病毒也称作载体病毒。经常用作载体的病毒是痘苗病毒 (Panicali et al；Proc.Natl.Acad.Sci.US A，79：4927(1982)， 疱疹病毒(E.P.A.0473210A2)，和逆转录病毒(Valerio，D.et al； in Baum，S.J.Dicke，K.A.Lotzova，E.和Pluznik，D.H.(Eds.)， Experimental Haematology today-1988.Springer Verlag，New York： pp.92-99(1989)).
本领域公知的体内同源重组的技术可以用来将重组核酸导入选定 细菌、寄生虫或病毒的基因组，在宿主动物中能够诱导根据本发明的 插入核酸的表达。
因而，本发明的还要另一种实施方案涉及用来对抗支原体感染的 疫苗，所述疫苗包含编码支原体L-α-甘油磷酸氧化酶或其免疫原 性片段的活重组载体，以及可药用的载体。
显然包含在功能性连接的启动子控制下的编码支原体L-α-甘油 磷酸氧化酶或其免疫原性片段的基因或其片段的宿主细胞可以用来生 产该酶。没有必要在使用酶作为疫苗之前首先将它从宿主细胞中抽提 出来：宿主细胞也可以照这样使用。在宿主细胞包含表达该酶的LRC 的条件下，情况是相同的。其实例是包含病毒或细菌性LRC的真核细 胞。
所以，本发明的再一个实施方案涉及包含在功能性连接的启动子 控制下的编码支原体L-α-甘油磷酸氧化酶或其免疫原性片段的基因 或其片段的宿主细胞。这种形式还涉及含有包含编码支原体L-α-甘 油磷酸氧化酶或其免疫原性片段的基因或其片段的活重组载体的宿主 细胞。
宿主细胞可以是细菌来源的细胞，例如大肠杆菌(Escherichia coli)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和乳杆菌(Lactobacillus) 物种，结合基于细菌的质粒如pBR 322，或细菌表达载体如pGEX，或结合 噬菌体。宿主细胞还可以是真核来源的，例如酵母细胞结合酵母特异性 的载体分子，或较高等的真核细胞像昆虫细胞(Luckow et al； Biotechnology 6：47-55(1988))结合载体或重组杆状病毒，植物 细胞结合例如基于Ti-质粒的载体或植物病毒载体(Barton，K.A.et al；Cell 32：1033(1983)，哺乳动物细胞像Hela细胞，中国仓鼠卵 巢细胞(CHO)或Crandell猫肾细胞，也结合合适的载体或重组病毒。
上述基于活重组载体的根据本发明的疫苗，例如基于感染肠上皮 或例如呼吸道上皮的沙门氏菌载体或病毒载体，能够表达酶或其免疫 原性片段，具有超出亚单位疫苗的优点，即它们更好地模拟支原体感 染的天然途径。另外，它们的自我繁殖是优势，因为仅少量的重组载 体是进行免疫所必需的。
接种疫苗的备选和有效方式是直接用DNA进行疫苗接种，所述DNA 编码相关的抗原。已经成功地对许多不同的蛋白质用编码蛋白质的 DNA进行直接疫苗接种(如在例如Donnelly et al.The Immunelogist 2：20-26(1993)中所综述的)。
这种方式的疫苗接种对于针对支原体感染的哺乳动物疫苗接种也 是非常有吸引力的。
所以，本发明的这一实施方案的还要另一种形式涉及对抗支原体 感染的疫苗，其包含在功能性连接的启动子控制之下的编码支原体L- α-甘油磷酸氧化酶的基因或编码其免疫原性片段的所述基因的一部 分，以及可药用的载体。
可以通过真皮内应用轻易地施用DNA疫苗，例如使用无针注射 器。这种给药方式直接将DNA递送入待接种疫苗的动物细胞中。介于 1到100μg微克范围的DNA量提供非常好的结果。
上述疫苗全部都有助于主动疫苗接种，即宿主的免疫系统被酶或 其免疫原性片段所触发，以制造针对这些蛋白质的抗体。
或者，这些抗体可以在例如兔中培育或可以由如下所述的抗体生 产细胞系中获得。随后这些抗体可以施用给宿主动物。这种疫苗接种 方法，被动疫苗接种，是当动物已经被感染时所选择的疫苗接种，此 时没有时间来触发天然的免疫应答。它还是用来对免疫受损的动物进 行疫苗接种的优选方法。在这些情况下施用的针对支原体的抗体可以 直接结合细菌。这具有这样的优点，即它立即降低或停止支原体生长。
所以，本发明的这种实施方案的一种其它形式涉及包含针对支原 体L-α-甘油磷酸氧化酶或其免疫原性片段的抗体和可药用载体的疫 苗。
在此实施方案的还要另一种形式中，根据本发明的疫苗另外包含 源自其它生物或病毒的一种或多种抗原(所述生物或病毒对同样的宿 主是病原性的)，抗这些抗原的抗体或编码这些抗原的遗传信息。
毫无疑问优选的组合疫苗是除了支原体L-α-甘油磷酸氧化酶还 包含支原体全细胞制备物的疫苗。这种组合疫苗将会诱导保护作用， 不但抗支原体L-α-甘油磷酸氧化酶的有害作用，还抗其它支原体相 关蛋白质。
在制备支原体疫苗用来保护免受猪病原性支原体物种侵害时，这 些生物和病毒优选选自伪狂犬病病毒，猪流感病毒，猪细小病毒，传 染性胃肠炎病毒，轮状病毒，另一种支原体物种特别是猪肺炎支原体， 猪痢疾短螺菌(Brachyspira hyodysenteriae)，大肠杆菌 (Escherichia coli)，钩端螺旋体属物种，猪红斑丹毒丝菌 (Erysipelothrix rhusiopathiae)，支气管炎博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica)，猪痢疾短螺菌(Brachyspira hyodysenteriae)， 志贺氏菌属(shigella)物种，猪霍乱沙门氏菌(Salmonella choleraesuis)，鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)，肠 炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)，副猪嗜血菌(Haemophilus parasuis)，Lauwsonia，多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)， 猪链球菌(Streptococcus suis)，胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)，猪葡萄球菌(Staphylococcus hyicus)和产 气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)。
当制备用于保护对抗牛病原性支原体物种的支原体疫苗时，这些 生物和病毒优选选自牛疱疹病毒，牛病毒性腹泻病毒，3型副流感病 毒，牛副粘病毒，口蹄疫病毒，牛呼吸道合胞病毒，猪圆环病毒，猪 呼吸繁殖综合征病毒，另一支原体物种，溶血巴斯德氏菌(Pasteurella haemolytica)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，大肠杆 菌，钩端螺旋体属(Leptospira)物种，Staphylococcus uberis， 小泰累尔梨浆虫(Theileria parva)，环状泰累尔梨浆虫(Theiieria annulata)，牛巴贝虫(Babesia bovis)，二联巴贝虫(Babesia bigemina)，大巴贝虫(Babesia major)，锥虫属(Trypanosoma) 物种，边缘无形体(Anaplasma marginale)，红血球内生无形体 (Anaplasma centrale)和犬新孢子虫(Neospora caninum)。
当制备用于保护对抗家禽病原性支原体物种的支原体疫苗时，这 些生物和病毒优选选自禽痘病毒，传染性支气管炎病毒，传染性粘液 囊病(Gumboro)，马立克氏病病毒，鸡贫血因子(agent)，费-克二 氏禽呼肠孤病毒，火鸡鼻气管炎病毒，鸡痘病毒，禽脑脊髓炎病毒， 鸭疫病毒，新城疫病毒，减蛋综合征病毒，禽传染性喉气管炎病毒，火 鸡疱疹病毒，另一种支原体物种特别是鸡败血支原体(Mycoplasma gallisepticum)或关节液支原体(Mycoplasma synoviae)，副鸡嗜血 菌(Haemophilus paragallinarum)(Coryza)，鼻腔鸟杆菌 (Ornithobacterium rhinotracheale)，产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)，沙门氏菌属，弯曲杆菌属(Campylobacter)物种， 大肠杆菌和艾美球虫属(Eimeria)物种。
当制备用于保护对抗人病原性支原体物种的支原体疫苗时，这些 生物和病毒优选选自流感病毒，麻疹病毒，腮腺炎副粘病毒， Clostridium diphteriae，破伤风梭菌(Clostridium tetani)，百 日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)，另一支原体物种和痘病 毒。
优选地，上述支原体L-α-甘油磷酸氧化酶或其免疫原性片段是 由任何下列支原体所编码的支原体L-α-甘油磷酸氧化酶：牛支原体 (M.bovis)，支原体物种牛7型(M.sp.Bovine group 7)，蕈 状支原体山羊亚种(M.mycoides subsp.Capri)，穿透支原体(M. penetrans)，鸡败血支原体，关节液支原体，运动支原体(M.mobile)， 肺支原体(M.pulmonis)，猪肺炎支原体，肺炎支原体(M.pneumoniae)， 生殖道支原体(M.genitalium)，蕈状支原体SC(小菌落)菌株Afadé 或蕈状支原体SC(小菌落)菌株L2，特别是牛支原体，猪肺炎支原体， 鸡败血支原体或关节液支原体，更特别是牛支原体或猪肺炎支原体。
根据本发明的所有疫苗都包含可药用的载体。可药用的载体可以 是例如无菌水或无菌生理盐溶液。在更加复杂的形式中所述载体可以 是例如缓冲液。
制备疫苗的方法包括混合支原体L-α-甘油磷酸氧化酶或其免疫 原性片段，上述活重组载体，上述基因或其部分，上述宿主细胞或针 对支原体L-α-甘油磷酸氧化酶或其免疫原性片段的抗体，以及可药 用的载体。所以，本发明的另一个实施方案涉及制备对抗支原体感染 的疫苗的方法，该方法包括混合上述支原体L-α-甘油磷酸氧化酶或 其免疫原性片段，上述活重组载体，上述基因或其部分，上述宿主细 胞或上述针对支原体L-α-甘油磷酸氧化酶或其免疫原性片段的抗 体，以及可药用的载体。
在优选的方案中根据本发明的疫苗还可以包含佐剂。佐剂一般包 含以非特异性方式加强宿主免疫应答的物质。本领域已知多种不同的 佐剂。佐剂的实例是弗氏完全和不完全佐剂，维生素E，非离子性嵌 段聚合物，胞壁酰二肽，Quill A(R)，矿物油例如Bayol(R)或Markol(R)， 植物油，和Carbopol(R)(同聚物)，或Diluvac(R)Forte。疫苗还可以包 含所谓″媒介物″。媒介物是多肽粘附的化合物，而不共价结合它。经 常使用的媒介化合物是例如氢氧化铝，磷酸铝或氧化铝，硅石，高岭 土，和膨润土。
这种媒介物的特殊形式，其中抗原部分包埋在媒介物中，是所谓 ISCOM(EP 109.942，EP 180.564，EP 242.380)。
此外，疫苗可以包含一种或多种合适的表面活性化合物或乳化剂， 例如Span或Tween。
通常，将疫苗与稳定剂混合，例如保护降解倾向多肽免于降解， 提高疫苗的保存期，或提高冻干效率。有用的稳定剂特别是SPGA (Bovarnik et al；J.Bacteriology 59：509(1950))，糖类例如山 梨醇、甘露醇、海藻糖、淀粉、蔗糖、葡聚糖或葡萄糖，蛋白质如白 蛋白或酪蛋白或其降解产物，以及缓冲剂如碱金属磷酸盐。
此外，可以将疫苗混悬于生理上可接受的稀释剂中。显然，加佐 剂，加入媒介物化合物或稀释剂，乳化或稳定多肽的其它方式也包括 在本发明中。
根据本发明的疫苗可以非常适于以1-100微克蛋白质的量加以 施用，尽管原则上可以使用更小的剂量。超过100微克的剂量，尽管 在免疫上是非常合适的，但出于商业原因吸引力较小。
可以低得多的剂量来施用基于活减毒重组载体如上述LRC-病毒 和细菌的疫苗，因为它们在感染期间繁殖自身。所以，对于细菌和病 毒来说非常合适的量分别为103到109CFU/PFU之间。
可以应用许多给药方式。口服应用是非常有吸引力的给药方式， 因为它不费力。口服给药的优选方式是将疫苗包装在本领域已知和常 用的胶囊中，其只在它们穿过胃的高度酸性环境后崩解。另外，可以 将疫苗混合以本领域已知的化合物以便暂时性提高胃的pH。
全身性应用也是合适的，例如通过肌内应用疫苗。如果按照这种 途径，本领域已知的用于全身性应用的标准方法是非常合适的。
基于支原体L-α-甘油磷酸氧化酶的疫苗还非常合适作为标记疫 苗。标记疫苗是这样的疫苗，其允许例如在特征性抗体组不同于由野 生型感染所诱导的抗体组的基础之上，在接种疫苗和野生感染的 (field-infected)动物之间进行辨别区分。
基于纯化的支原体L-α-甘油磷酸氧化酶的疫苗将只是诱导针对 该蛋白的抗体，而基于活野生型、活减毒型或灭活型完整支原体的疫 苗以及野外感染将诱导针对全部或大多数细菌蛋白质的抗体：这将清 楚地给出高度不同的抗体组。
简单的EILSA测试，其具有含有纯化支原体L-α-甘油磷酸氧化 酶的孔和含有另一种支原体蛋白质的孔，足以检测来自动物的血清并 确定动物是用根据本发明的疫苗进行了接种还是遭受支原体野外感 染；用含有纯化的支原体L-α-甘油磷酸氧化酶的疫苗接种的动物将 不具有针对除支原体L-α-甘油磷酸氧化酶之外的其它支原体蛋白的 抗体。不过，遭受支原体野外感染的动物将具有针对所有免疫原性支 原体蛋白质，并且因而也针对其它非支原体L-α-甘油磷酸氧化酶蛋 白质的抗体。
因而，本发明的另一个实施方案涉及诊断测试，用于辨别用根据 本发明的疫苗进行了接种，或是用完整细胞疫苗进行了接种或野外感 染的情况，其中这种测试包含纯化的支原体L-α-甘油磷酸氧化酶或 其免疫原性片段，和分开地另一种非L-α-甘油磷酸氧化酶蛋白质。
如上所述表达的根据本发明的多肽或其免疫原性片段可以用来生 产抗体，其可以是多克隆的，单特异性的或单克隆的(或其衍生物)。如 果希望多克隆抗体，用来生产和加工多克隆血清的技术是本领域公知 的(例如Mayer和Walter，eds.Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology，Academic Press，London，1987)。
可以通过也是本领域已知的技术(Kohler和Milstein，Nature， 256，495-497，1975)免疫近交小鼠来制备根据本发明对根据本发明的 多肽(或其变体或片段)反应性的单克隆抗体。
大规模生产根据本发明的抗体的方法也是本领域已知的。这些方 法依赖于在丝状噬菌体中克隆编码根据本发明的蛋白质的遗传信息 (的片段)用于噬菌体展示。这些技术特别在http://aximtl.imt.uni -marburg.de/～rek/aepphage.html.上的″filamentous phage display″之下的″Antibody Engineering Page″上，以及在Cortese， R.等人，(1994)于Trends Biotechn.12：262-267中，Clackson， T.&Wells，J.A.(1994)于Trends Biotechn.12：173-183中， Marks，J.D.等人，(1992)于J.Biol.Chem.267：16007-16010 中，Winter，G.等人，(1994)于Annu.Rev.Immunol.12：433-455 中和Little，M.等人，(1994)Biotechn.Adv.12：539-555的综 述文章中进行了描述。随后使用噬菌体来筛选表达camelid重链抗体 的camelid表达文库(Muyldermans，S.和Lauwereys，M.Journ.Molec. Recogn.12：131-140(1999)和Ghahroudi，M.A.et al.FEBS Letters 414：512-526(1997))。可以复制文库中表达所需抗体的 细胞，随后用于大规模表达抗体。
实施例
实施例1
菌株，细胞，生长条件和DNA抽提
除非特别标记，使用蕈状支原体蕈状亚种SC菌株Afadé(1968 年在Farcha实验室，N′Djaména，Chad分离的高毒性野外菌株)来 进行毒力研究。这种菌株在自然和实验条件下引发CBPP。在特别指明 的地方，使用较小毒性的菌株，蕈状支原体蕈状亚种SC菌株L2，它 缺乏主动甘油摄取系统GtsABC。另外，在此研究中还使用模式株PG1 和来自非洲和欧洲疾病爆发的十种其它菌株进行遗传分析。将支原体 培养物生长在支原体肉汤培养基中至108-109菌落形成单位/ml (cfu/ml)的密度或在固体支原体琼脂培养基(Axcell Biotechnologies，St.Genis 1′Argentiere，France)上生长。在符 合BL3防范安全标准的生物安全实验室中进行活体蕈状支原体蕈状亚 种SC的生长和操作。如以往所述进行DNA抽提(Cheng，X.J.et al. 1995，Microbiology 141：3221-3228)。对于遗传操作和亚克隆， 使用大肠杆菌菌株DH5α[F-Φ80dlacZΔM15Δ(lacZYA-argF)U169 deoR recA1 endA1 hsdR17(rk-，mk+)phoAsupE44λ-thi-1 gyrA96relA1]和 BL21(DE3)[F′dcm ompT hsdS(rB-mB-)galλ(DE3)]。使用pETHIS-1 表达载体(Schaller，A.et al.1999，Microbiology 145：2105-2116) 来表达重组多-组氨酸N-和C-末端融合蛋白。
由获自当地屠宰场的胎兽来制备ECaNEp细胞，并在37℃于加湿 的5％CO2气氛中，维持在24孔微量滴定板里的添加了7％胎牛血清 (FCS)和青霉素(100I U/ml)的MEM-Earle培养基中并以2×105细 胞每孔的汇合密度使用。FCS和细胞培养基购自Seromed(Biochrom， Munich，Germany)。利用PCR(支原体)或利用免疫染色(BVD病毒) 来对细胞常规筛选污染。
PCR扩增，DNA印迹和DNA序列分析
利用标准PCR条件(Cheng，X.J.et al.1995，Microbiology 141：3221-3228)利用寡核苷酸引物glpO_EcoRI_N(5′- TCGAATTCAATGAAGCAAACAAAAGTTGATATTTG-3′)和glpO_NotI_C(5′- TTGCGGCCGCATTTCCATGGAAGAATAGCTTCTTC-3′)在地高辛配基-11-dUTP (Dig)(Roche Diagnostics，Rotkreuz，Switzerland)存在下通过PCR 来构建glpO特异性DNA探针。如以往所述由支原体抽提基因组DNA 并进行DNA印迹分析(Pilo，P.et al.2003，Vet.Microbiol.92： 37-48)。
用DNA测序仪AB 3100遗传分析仪和Taq染料脱氧终止循环测序 试剂盒(Applied Biosystems，Norwalk，Conn.)，用寡核苷酸引物 glpO_EcoRI_N和glpO_NotI_C通过引物步移利用glpO内引物来进行 DNA测序。用PC/Gene程序PROSITE(Bairoch，A.P.Bucher，和 K.Hofmann.1995，Nucleic Acids Res.24：189-196.)来分析DNA 和推导出的氨基酸序列。利用BLAST与GenBank和EMBL数据库中的 序列进行序列比较(Altschul，S.F.et al.1997，Nucleic Acids Res.25：3389-3402.)。通过利用程序Motif Scan (http://hits.isb-sib.ch/cgi-bin/hits_motifscan)和TMpred (http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)，和 ″toppred″软件(von Heijne，G.1992，J.MoI.Biol.225：487-494.) 来进行蛋白质的分析。
实施例2
重组GlpO的克隆、定点诱变和表达
首先用分别包含EcoRI和NotI限制性位点的引物glpO_EcoRI_N 和glpO_NotI_C来扩增蕈状支原体蕈状亚种SC菌株Afadé的glpO 基因。另外，引物glpO_NotI_C包括突变的TGGTrp密码子。利用重叠 延伸-PCR方法(Braman，J.C.Papworth，和A.Greener.1996， Methods MoI.Biol.57：31-44.)用引物对(携带合适的核苷酸置换) glpO_mutlL(5′-GAAGACTGGATCAAAGAAATGGA-3′)/glpO_mutlR(5′- TTTGATCCAGTCTTCATAACGTTT-3′)或glpO_mut2L(5’-GCTAATTG GCAACCAAAAGAAGA-3′)/glpO_mut2R(5′-TGGTTGCCAATTAGCCTTTTTATC -3′)用TGGTrp密码子替换glpO基因中的其它两个支原体特异性TGATrp密码子。通过将EcoRI和NotI剪切位点放于侧翼把PCR产物克隆入 pETHIS-1中。通过DNA测序来分析构建体并导入大肠杆菌BL21(DE3) 中进行表达并通过之前对于其它蛋白质所述的多组氨酸尾融合蛋白的 Ni2+-螯合层析来进行纯化(Schaller，A.et al.1999，Microbiology 145：2105-2116)。
实施例3
血清、多克隆抗体、免疫球蛋白纯化和Fab制备
Abdo和同事已经详细描述了来自非洲蕈状支原体蕈状亚种SC 菌株Afadé设对照实验感染的牛血清(Abdo，E.-M.et al.1998， Vet.Microbiol.59：109-122.)。通过用160μg纯化的重组多组氨 酸尾蛋白质GlpO皮下免疫兔，随后在第2和第4周用40和20μg蛋 白质进行加强免疫，获得针对重组GlpO的多克隆单特异性血清，所述 重组多组氨酸尾蛋白质GlpO是在混合了500μl Adjuvant 10(Gerbu Biotechnik GmbH，Gaiberg，Germany)的500μl PBS缓冲液pH 8.0 (50mM Na2HPO4/NaH2PO4pH 8.0，140mM NaCl)中。在最后一次加强 免疫后10天将兔放血。由血液样品制备抗血清并保存在-20℃。
用HiTrap Protein G试剂盒(Amersham Pharmacia Biotech， Uppsala，Sweden)根据生产商的指导纯化来自兔抗GlpO血清和来自 相同兔的之前血清的免疫球蛋白G(IgG)级分。用ImmunoPure Fab制 备试剂盒(Pierce，Rockford，I11.)根据生产商的说明书来制备Fab 片段。将Fab片段相对于PBS缓冲液pH 7.4透析过夜并随后进行过 滤除菌。利用Bradford的方法测定蛋白质浓度(Bradford，M.M.1976， Anal.Biochem.72：248-254.)。之前已经描述过针对脂蛋白LppC 的单特异性兔血清(Pilo，P.et al.2003，Vet.Res.34：761-775.)。
实施例4
免疫印迹分析，Triton X-114分配和生长抑制测试
如以往所述制备来自支原体的总抗原(Fleury，B.et al，2001， J.Clin.Microbiol.39：2814-2822)。用1∶2000稀释的牛血清和 1∶1000稀释的兔单特异性血清抗GlpO进行免疫印迹。
通过Triton X-114分配方法将来自稳定期培养物的蕈状支原体 蕈状亚种SC总抗原分离成疏水和亲水级分(Bordier，C.1981，J. Biol.Chem.256：1604-1607)。用针对GlpO的单特异性多克隆抗体 和针对蕈状支原体蕈状亚种SC的牛血清进行免疫印迹来分析来自 Triton X-114去污剂相和水相的样品。
通过将5和10μl未稀释的针对GlpO的去补体后单特异性兔血 清，纯化的IgG或抗GlpO IgG的Fab片段点样到包含支原体的琼脂 培养基上并将板在37℃孵育4天来进行生长抑制测试。使用抗蕈状支 原体蕈状亚种SC的血清作为阳性对照，抗LppQ的单特异性兔血清作 为阴性对照。如以往所述在光学显微镜下进行生长抑制的观察 (Papazisi，L.et al，2003，Microbiology 149：2307-2316，Poveda， J.B.和R.Nicholas，1998，Methods Mol.Biol.104：105-111.)。
实施例5
扫描电子显微镜(SEM)和免疫金标记
对于电子显微镜，将蕈状支原体蕈状亚种SC在37℃在喷金或铂 的盖玻片上于支原体肉汤培养基中培养5天，所述盖玻片已经预先涂 布了多L-赖氨酸。用PBS缓冲液pH 7.4于37℃将细胞洗涤三次并 在PBS中的4％多聚甲醛中于室温固定30分钟。在用PBS洗涤后，将 盖玻片在添加了0.2M甘氨酸和1％BSA的PBS缓冲液中于室温封闭 15min，其后在4℃将它们与来自在添加了1％BSA的PBS中1∶100 或1∶50稀释的抗GlpO兔血清的IgG一起孵育过夜。随后用PBS将样 品洗涤10min并于室温用在PBS中1∶50稀释的胶体金缀合的山羊抗 兔IgG(British Biocell International，Cardiff，UK)标记90min。 用0.1M二甲胂酸盐缓冲液pH 7.4洗涤盖玻片并按照标准方案处理用 于SEM。简言之，将样品在0.13M二甲胂酸盐缓冲液pH 7.4中的具 有0.11％钌红的1.33％Os O4中锇化15min，用0.1M二甲胂酸盐缓 冲液洗涤，通过逐渐提高的乙醇系列进行脱水，并通过六甲基二硅氮 烷的蒸发来进行干燥(Sigma，Buchs，Switzer land)。
在高分辨视野发射扫描电子显微镜DSM 982Gemini(Zeiss， Oberkochen，Germany)中以5kV的加速电压、8mm的工作距离和 50,000到100,000X的放大倍率来检查次级电子和相应的反向散射 电子信号。
对照实验分别包括省略一抗以及使用兔抗降钙素抗体(Anawa Biomedical Services and Products，Zurich Switzerland)和兔免 疫前血清。
实施例6
H2O2生产的定量和抑制测定
为了测量H2O2生产，将蕈状支原体蕈状亚种SC菌株于37℃在支 原体培养基中生长至大约5×108cfu/ml的密度。将培养物在4℃于8000 Xg离心10min，在孵育培养基(67.6mM HEPES pH 7.3，140mM NaCl， 7mM MgCl2)中洗涤一次，于37℃以109cfu/ml的密度重悬于预温的孵 育培养基中，分成1ml的等份并于37℃孵育1小时。为了诱导H2O2生 产，将甘油添加到支原体混悬液中至最终浓度为100μM-在牛血清中 的生理浓度。如以往所述(Vilei，E.M.和J.Frey，2001，Clin.Diagn. La b.Immunol.8：85-92.)在加入甘油后0，1，2，5，10，20和 120min用过氧化物测试(Merck KgaA，Darmstadt，Germany)来测量 H2O2生产。为了抑制支原体L-α-甘油磷酸氧化酶GlpO，通过在0.26 μg/ml到2.6μg/ml的浓度下孵育随后用PBS缓冲液洗涤两次，用 抗GlpO IgG的纯化Fab片段来预处理支原体。为了评估蕈状支原体 蕈状亚种SC细胞在诱导H2O2生产后的生存力，在测试最后将等份的 反应测定物铺在支原体琼脂平板上并在37℃下生长。
实施例7
细胞毒性的评估
将胚胎小牛鼻上皮细胞(ECaNEp细胞)(Schweizer，M.和E. Peterhans，1999，J.Gen.Virol.80：1147-1155.)生长在24- 孔板中直到达到汇合。在测定前，除去培养基并替换为无添加物的200 μl MEM-Earle培养基或添加了100M甘油的MEM-Earle培养基。 随后以50个支原体每细胞的感染复数(MOI)来感染ECaNEp细胞。为 了阻抑GlpO活性，以0.26μg/ml的抗GlpO Fab片段来预处理蕈 状支原体蕈状亚种SC。在固定和用0.75％结晶紫，0.25％NaCl，1.75％ 甲醛和50％乙醇染色后计数存活的ECaNEp细胞，并在感染后的不同 时间在相差显微镜下进行拍照。使用来自抗蕈状支原体蕈状亚种SC 的膜脂蛋白LppC的多克隆IgG的纯化Fab片段作为对照，因为LppC 与甘油代谢无关联。为了确定在与ECaNEp细胞接触前蕈状支原体蕈状 亚种SC生长期间产生的H2O2对于牛细胞是否有害，将在甘油存在下 生长的蕈状支原体蕈状亚种SC培养物上清液通过0.22-μm滤器 (Millipore，Bedford，Mass.)进行过滤，并加入到ECaNEp细胞中。 通过锥虫蓝排除法来评估ECaNEp细胞生存力。
实施例8
检测在ECaNEp细胞中由H2O2和其它ROS引发的氧化应激
利用5(和6)-氯甲基-2′，7′-二氯二氢荧光素二乙酸-乙酰酯 (CM-H2DCFDA；Molecular Probes，Eugene，Oreg.)的氧化来评估 ECaNEp细胞中胞内ROS造成的氧化应激。这种染料进入细胞并在被ROS 胞内氧化后产生荧光信号。采用评估细胞毒性所用相同的条件，进行 下列改进。作为对照，将半数包含ECaNEp细胞的孔用30mM N-乙酰 基-L-半胱氨酸(NAC)来处理以防止被H2O2和ROS氧化。随后，将 ECaNEp细胞与10μM CM-H2DCFDA一起孵育1小时并用MEM-Earle培 养基洗涤一次。随后500个支原体每细胞的MOI在甘油存在或缺失 的情况下感染细胞。为了阻抑G l pO活性，以0.26μg/ml的抗GlpO Fab片段来预处理蕈状支原体蕈状亚种SC。作为对照，用150μM 到4.4mM的H2O2溶液来处理细胞20分钟。在支原体感染后20min， 利用Nikon Eclipse TE 300显微镜通过荧光显微术来监测细胞内H2O2和ROS。注意所有涉及CM-H2DCFDA的步骤，包括这种化学品的操作， 都在黑暗下进行。
核苷酸序列登录号
来自蕈状支原体蕈状亚种SC菌株Afadé和L2的glpO的核苷酸 序列的EMBL/GenBank登录号分别是AJ581566和AJ581564。来自支 原体物种牛7型菌株PG50和蕈状支原体山羊亚种菌株PG3的glpO 基因序列保藏登录号分别是AJ581565和AJ581567。
实施例9
glpO基因的遗传和功能分析
来自蕈状支原体蕈状亚种SC的glpO基因编码387aa的多肽 GlpO，预测分子量为42.7kDa，pI 8.14。它包含三个TGA Trp密码子。 该蛋白质在氨基酸位置8到36具有推定的FAD结合位点，似乎是表 面暴露型的。TMpred鉴定了两个明显的跨膜区，跨越氨基酸6到25 和140到157。在高毒性的菌株Afadé中，glpO基因之后是基因 glpK(推定的甘油磷酸激酶)和glpF(推定的甘油促进剂因子)。对 于模式株PG1观察到相同的基因排列。用glpO的基因探针进行基因 组DNA的DNA印迹分析显示在蕈状支原体蕈状亚种SC菌株Afadé， L2，模式株PG1以及所分析的来自非洲和欧洲疾病爆发的十种其它菌 株中存在glpO(数据未显示)。用单特异性抗-GlpO IgG对总抗原进 行免疫印迹分析揭示一条明显的45-kDa蛋白质条带，确证了glpO基 因在测试的所有蕈状支原体蕈状亚种SC菌株中表达(数据未显示)。 发现来自蕈状支原体蕈状亚种SC菌株Afadé和菌株L2的GlpO的 氨基酸序列与模式株PG1(48)的GlpO的氨基酸序列相同，并且显示与 多种支原体物种的甘油-3-磷酸脱氢酶的相似性(表1)。
基因组序列分析预测支原体缺乏过氧化氢酶和歧化酶活性。由于 细胞质GlpO活性将诱导细胞内H2O2毒性，其又将对于支原体本身有 害，我们假定该酶必定位于表面膜处。利用″toppred″软件对来自各病 原性支原体物种(列于表1中)的GlpO或同源性酶的序列分析揭示 了跨膜结构，预测这些酶的结构域是位于表面的。在利用来自单特异 性兔抗GlpO血清的IgG进行免疫金标记后通过扫描电子显微镜(SEM) 提供了GlpO存在于蕈状支原体蕈状亚种SC细胞表面处的直接证据 (图1a-d)。为了确证GlpO位于支原体膜中，将蕈状支原体蕈状亚种 SC的总蛋白进行Triton X-114相分配。抗-GlpO血清与Triton X-114相中的45-kDa蛋白质(GlpO)反应强烈，所述45-kDa蛋白 质不存在于水相，表明GlpO是蕈状支原体蕈状亚种SC的一种膜内在 蛋白(图1e)。对蕈状支原体蕈状亚种SC的Triton X-114提取物用 来自用该菌株实验性感染的牛的牛血清进行免疫印迹分析揭示了在 45kDa的GlpO特异性条带在凝胶上与GlpO共迁移(数据未显示)， 表明GlpO涉及牛CBPP感染期间的血清转化。
为了确证GlpO作为支原体L-α-甘油磷酸氧化酶的功能，我们在 存在或缺乏单特异性抗-GlpO IgG的Fab片段的情况下向蕈状支原体 蕈状亚种SC纯性培养物中加入甘油后，测量了H2O2的生产。如图1f 所示，在对数生长中期向培养物中加入100μM甘油立即导致H2O2释 放入生长培养基中，10分钟后达到150μM，此浓度保持长达2小时 (图1f)。当支原体混悬液用单特异性多克隆抗-GlpO抗体或抗-GlpO IgG的Fab片段以最小浓度0.26μg/m l进行预处理时，可以特异性地 阻抑H2O2释放，但用作对照抗体的抗LppC IgG的Fab片段进行预处 理则不能(图1f)。LppC是蕈状支原体蕈状亚种SC的一种表面脂蛋 白，其与甘油代谢无关。在添加了甘油后向蕈状支原体蕈状亚种SC 培养物中加入过氧化氢酶将培养基中H2O2的水平减少到1μM(该测定 的检测水平)以下的浓度。不添加或添加抗-GlpO抗体或抗-GlpO Fab 片段，蕈状支原体蕈状亚种SC的世代时间是3.3小时。另外，在血 清-drop生长抑制测试中抗-GlpO抗体没有作用(数据未显示)。在 100μM甘油存在下生长2小时并产生150μM H2O2的纯性培养物显 示3.2小时的世代时间，而未加入甘油的对照培养物具有3.3小时的 世代时间。因此，甘油诱导H2O2产生并不影响支原体的生存力。
实施例10
蕈状支原体蕈状亚种SC针对牛上皮细胞的细胞毒性
为了评估缘自甘油代谢的H2O2和相关ROS的产生是否促成蕈状支 原体蕈状亚种SC的毒性，我们在各种条件下分析了对于胚胎小牛鼻 上皮细胞(ECaNEp)的细胞毒性(图2)。如图2b所示，蕈状支原体蕈 状亚种SC菌株Afadé以50个支原体每细胞的MOI感染ECaNEp细胞， 在培养基中缺少甘油的情况下感染1小时后只导致弱的细胞毒性效 应。不过，当在存在生理学浓度的甘油情况下用该支原体感染ECaNEp 细胞时，大多数ECaNEp细胞从表面脱离并随后经历完全溶解(图2c)。 当用0.26μg/ml浓度的抗-GlpO Fab片段预处理支原体时，这种 细胞毒性效应可以得到阻抑，所述抗GlpO Fab片段伴随性地阻抑H2O2的产生。在这些条件下，ECaNEp细胞在感染后1小时不显示形态改变 (图2d)。生长在包含甘油的培养基中的蕈状支原体蕈状亚种SC的细 胞毒性并不被用作对照的抗-LppC Fab片段所抑制(图2e)。当在甘油 存在时用毒性较小的菌株(L2)感染ECaNEp细胞时只观察到弱的细胞 毒性效应，该菌株缺乏主动甘油转运蛋白Gts ABC的基因并且只产生 低量的H2O2(图2f)。在对照实验中，单独或组合添加甘油，抗-GlpO Fab 或抗-LppC Fab并不影响ECaNEp细胞(数据未显示)。细胞毒性实验的 动力学(图2g)显示在向感染了蕈状支原体蕈状亚种SC的ECaNEp 细胞中加入甘油后快速出现了细胞毒性的诱导，在2小时后达到75％ 的死亡率。在较高MOI(500支原体每细胞)，在加入甘油后30分钟 达到细胞的完全死亡。用抗-GlpO Fab预处理支原体在整个观察期中 完全阻止细胞死亡(图2g)。在不添加甘油的情况下，蕈状支原体蕈 状亚种SC感染ECaNEp细胞只显示弱的细胞毒性效应(图2g)，其也 可以被抗-GlpO Fab所抑制，因此可能归因于细胞或培养基中残余量 的甘油。令人感兴趣的是，在甘油存在下生长的蕈状支原体蕈状亚种 SC培养物的经过滤的上清液，其包含大约150μM H2O2，或向细胞培 养物中添加150μM H2O2，在1小时接触后对于ECaNEp细胞并无明显 可见的细胞毒性效应。通过向ECaNEp细胞培养物中添加外源H2O2而诱 导的细胞毒性于4.4mM的浓度首次达到，大多数细胞在1小时接触后 死亡。这一浓度是在甘油存在时在蕈状支原体蕈状亚种SC生长培养 基中测量到的浓度的30倍。
为了监测感染了蕈状支原体蕈状亚种SC或添加了甘油以后细胞 内H2O2和其它ROS所引发的ECaNEp细胞中的氧化应激，我们用CM -H2DCFDA预处理了ECaNEp细胞并通过荧光显微镜检测了这种化合物 的细胞内氧化(图3)。通过CM-H2DCFDA的氧化切割酯基团导致在细胞 中形成高度荧光性的二氯荧光素(DCF)衍生物，而未经氧化的 CM-H2DCFDA是非荧光性的。如图3c-d中所示，蕈状支原体蕈状亚种SC 感染ECaNEp细胞导致在添加甘油后20min在ECaNEp细胞中强烈诱导 荧光，反映出细胞内H2O2或ROS的存在。相反，不添加甘油在感染的 ECaNEp细胞中未检测到荧光(图3a-b)。当在ECaNEp细胞感染之前 用抗-GlpO抗体处理支原体时，CM-H2DCFDA的细胞内氧化不发生(图 3e-f)。另外，在向培养基中添加甘油之前，用抗氧化剂NAC处理 ECaNEp细胞阻抑了CM-H2DCFDA的细胞内氧化(图3g-h)。加入150 μM外源H2O2，不发生ECaNEp细胞的细胞内氧化，所述150μM H2O2相当于蕈状支原体蕈状亚种SC在添加甘油后10min所释放的H2O2的浓度。如同对于诱导细胞毒性的情况，为了实现ECaNEp细胞中的细 胞内CM-H2DCFDA的氧化，必需4.4mM浓度的外源H2O2(图3i-j)。
结论
在本发明中蕈状支原体蕈状亚种SC的GlpO已经被鉴定为膜蛋 白，它在针对EcaNEp细胞的细胞毒性中发挥重要作用。在生理浓度的 甘油存在时，109cfu/ml密度的蕈状支原体蕈状亚种SC向培养基中 释放相对大量的H2O2，高达150μM。如果与在葡萄糖存在时生长的 支原体所产生的量相比，这种H2O2量是大约20倍，据报道葡萄糖刺激 H2O2产生仅仅50％。当ECaNEp细胞接触蕈状支原体蕈状亚种SC时， 在存在生理浓度的甘油的情况下，首先在它们的细胞质中检测到H2O2， 随后发生细胞死亡。我们注意到在由支原体向培养基中释放的H2O2浓 度和触发CM-H2DCFDA氧化和细胞死亡所需的H2O2浓度之间有显著的 差异。因而，包含150μM H2O2的经过滤的支原体生长培养基或向 ECaNEp细胞中添加150μM外源H2O2在1小时内并不导致细胞质中可 检测到的CM-H2DCFDA氧化，也不导致细胞死亡。这表明支原体和宿 主细胞之间紧密的接触是将毒性化合物成功靶向宿主细胞所必需的。 在此，值得注意的是蕈状支原体蕈状亚种SC-和为此大多数其它病原 性支原体-紧密地附着于它们的宿主细胞，但并不穿透。另外，主动摄 取甘油是获得对ECaNEp细胞的甘油诱导细胞毒性效应所必需的。蕈 状支原体蕈状亚种SC的欧洲菌株L2，其缺乏主动摄取甘油所需的 GtsABC转运蛋白并且其以显著较低的速率产生少10倍H2O2，在相同的 实验条件下对于ECaNEp细胞只具有弱的细胞毒性效应。据认为菌株 L2对甘油的残余摄取是由于较低效的转运途径而发生的，所述途径是 由推定的甘油促进剂因子GlpF所介导的。
基于我们的结果，我们提出触发蕈状支原体蕈状亚种SC对于真核 细胞的细胞损伤的下列模型(图4)：存在于间质液中的甘油通过高度 活性的ABC甘油转运蛋白(GtsA，GtsB和GtsC)主动导入并且随后磷 酸化成甘油-3-磷酸。接下来，这在O2存在下被GlpO氧化成DHAP， 其进入糖酵解途径，并产生一分子的H2O2。受到支原体与宿主细胞膜 的密切接触所促进，H2O2和伴随的ROS进入宿主细胞。在宿主细胞内， H2O2和ROS充当细胞损伤的有力介导物和炎性过程的诱导物。预期它 们通过直接损伤组织细胞或诱导宿主基因表达来损伤宿主，例如，通 过NF-κB的激活，或通过Fenton反应诱导促炎基因(Crichton，R.R. et al.2002，J.Inorg.Biochem.91：9-18)。令人感兴趣的是， 之前已经显示支原体诱导吞噬细胞中的呼吸爆发，提示宿主生成的 ROS可能进一步促成组织损伤。
H2O2和ROS还能够激活NF-κB，通过这样，诱导真核宿主中一系 列免疫和促炎基因的表达，这是可能在由支原体引发的呼吸道感染中 具有特别重要性的机制。
基于支原体L-α-甘油磷酸氧化酶或针对支原体L-α-甘油磷酸 氧化酶的抗体的疫苗成功地抑制H2O2和ROS的产生，通过这样，它们预 防宿主细胞损伤、炎症和疾病。
附图说明
图1.支原体L-α-甘油磷酸氧化酶的定位和活性。a-d，扫描电子 显微镜照片，分别显示与来自抗-GlpO(a，b)和免疫前血清(c，d) 的IgG一起孵育的蕈状支原体蕈状亚种SC菌株Afadé的免疫金标 记。次级电子显微照片显示细胞表面(a，c)而反向散射电子显微照片 揭示15nm胶体金缀合的二抗(b，d)。刻度比例，500nm。e，用GlpO 抗血清对蕈状支原体蕈状亚种SC菌株Afadé的Triton X-114分级 分离的总抗原的免疫印迹分析。泳道1，去污剂相，20μg蛋白质；泳 道2，水相，20μg蛋白质；Std，分子量标准，f，在加入100μM甘 油后蕈状支原体蕈状亚种SC菌株Afadé的过氧化氢产生。显示的数 据是五次独立测量的平均值。各次测量的标准偏差低于平均值的5％。 三角形和实线，未处理的蕈状支原体蕈状亚种SC；十字形和虚线， 用来自抗-GlpO IgG的Fab片段预处理的蕈状支原体蕈状亚种SC； 正方形和点线，用来自抗-LppC的Fab片段预处理的蕈状支原体蕈状 亚种SC。
图2.蕈状支原体蕈状亚种SC对ECaNEp细胞的细胞毒性(a-f) 和细胞生存力测定(g)。a，ECaNEp细胞(对照)；b，蕈状支原体蕈状 亚种SC菌株Afadé感染后1h的ECaNEp；c，在甘油(100μM) 存在时，菌株Afadé感染后1h的ECaNEp；d，在甘油(100μM)存 在时，用来自抗-GlpO IgG的Fab片段预处理的菌株Afadé感染后1 h的EcaNEp；e，在甘油(100μM)存在时，用来自抗-LppC IgG的 Fab片段预处理的菌株Afadé感染后1h的EcaNEp；f，在甘油(100 μM)存在时感染了蕈状支原体蕈状亚种SC菌株L2(其缺乏主动甘油 摄取系统)的ECaNEp细胞。在所有实验中的MOI是50个支原体每细 胞。g，在以50个支原体每细胞的MOI用蕈状支原体蕈状亚种SC菌 株Afadé感染后不同时间的活ECaNEp细胞。三角形和粗实线，在100 μM甘油存在时感染菌株Afadé；十字形和点线，在100μM甘油存 在时感染用抗-GlpO Fab片段(0.26μg/ml)预处理的菌株Afadé SC；正方形和虚线，无甘油时菌株Afadé感染；菱形和细实线，单独 的ECaNEP细胞(对照)。
图3.用蕈状支原体蕈状亚种SC菌株Afadé以MOI 500支原体 每细胞感染或用H2O2处理的ECaNEp细胞中的细胞内H2O2和ROS的检测。 ECaNEp细胞的相差显微照片(a，c，e，g和i)和荧光显微照片(b， d，f，h和j)：在甘油缺乏下用蕈状支原体蕈状亚种SC菌株Afadé 感染后20min(a，b)；在添加了甘油的培养基中用菌株Afadé感染 (c，d)；在添加了甘油的培养基中以用来自抗-GlpO IgG的Fab片段 预处理的菌株Afadé感染(e，f)；用N-乙酰基-L-半胱氨酸预处理， 随后在具有甘油的培养基中用菌株Afadé感染(g，h)；在添加了4.4 mM H2O2的培养基中孵育20分钟(i，j)。
图4.蕈状支原体蕈状亚种SC触发宿主细胞炎症的模型。GtsABC： 主动甘油运输和磷酸化系统；GlpF：甘油促进剂因子；GlpK：甘油激 酶；G3P：甘油-3-磷酸；DHAP：磷酸二羟丙酮；GlpO：支原体L-α- 甘油磷酸氧化酶。粗箭头表示蕈状支原体蕈状亚种SC的主要毒力途 径。
表1.来自蕈状支原体蕈状亚种SC菌株Afadé的GlpO和GtsABC 的蛋白质序列与来自其它支原体的同源物的序列的比较
GlpO(CAE46342)
序列表
<110>University of Bern
<120>支原体亚单位疫苗
<130>2005.006
<160>6
<170>Patentln version 3.2
<210>1
<211>35
<212>DNA
<213>支原体物种
<400>1
ttgcggccgc atttccatgg aagaatagct tcttc 35
<210>2
<211>35
<212>DNA
<213>支原体物种
<400>2
tcgaattcaa tgaagcaaac aaaagttgat atttg 35
<210>3
<211>24
<212>DNA
<213>支原体物种
<400>3
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<210>4
<211>23
<212>DNA
<213>支原体物种
<400>4
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<210>5
<211>24
<212>DNA
<213>支原体物种
<400>5
tttgatccag tcttcataac gttt 24
<210>6
<211>23
<212>DNA
<213>支原体物种
<400>6
gaagactgga tcaaagaaat gga 23