技术领域
本发明涉及一种补脾益肠丸的质量标准检测方法。
背景技术
补脾益肠双层丸是我厂首创的专利产品(申请(专利)号：87106202)，它采用胃肠分溶 的工艺制备，具有显著的疗效。
原有的质量检测方法只有显微鉴别和薄层色谱鉴别，不能全面的反映药物的质量，并且 技术含量较低。我们通过对药物内外层的研究，应用高效液相色谱，发明了一种梯度洗脱， 变化检测波长的检测方法，此方法的优点是同时检测了内外层有效成分的含量，快速，简便， 十分有效的保证了药物的质量，并且在现有的质量检测方法中属于技术领先水平。
发明内容
本发明的目的是提供一种补脾益肠丸的质量检测方法。利用高效液相色谱法梯度洗脱分 离药物中内外层的有效成分芍药苷、补骨脂素和异补骨脂素，使有效成分能够在最佳的流动 相、最大吸收波长条件下得到最精确的检验。
本发明通过以下技术方案实现：
采用高效液相色谱法：
(1)色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂以甲醇或乙腈为流 动相A，以水为流动相B，分两个梯度进行洗脱，两梯度用不同的波长检测，检测方法为双 波长检测法或变换波长检测法，理论板数按芍药苷峰计算应不低于2000。
(2)对照品溶液的制备取芍药苷、补骨脂素、异补骨脂素对照品适量，精密称定，加 甲醇制成每1ml含芍药苷25～35μg、补骨脂素2～6μg、异补骨脂素2～6μg的混合溶液， 即得。
(3)供试品溶液的制备取供试品适量，研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中， 精密加入甲醇25ml，称定重量，超声40分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量， 摇匀，滤过，取续滤液，即得。
(4)测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定， 即得。
(5)供试品每1g含白芍以芍药苷(C23H28O11)计，不得少于1.1mg；含补骨脂以补骨脂素 (C11H6O3)和异补骨脂素(C11H6O3)的总量计，不得少于0.16mg。
在上述步骤(1)的色谱条件与系统适应性试验，流动相A为甲醇梯度洗脱时，梯度1 流动相的优选体积比为：A∶B＝15％～30％∶85％～55％，A+B＝100％，流速1ml/min，检 测波长为220～250nm，待芍药苷峰出现后0～15分钟流动相变化到梯度2，梯度2流动相的 优选体积比为：A∶B＝35％～60％∶65％～40％，A+B＝100％，流速1ml/min，检测波长为 230～260nm，待补骨脂素和异补骨脂素峰出现后，继续洗脱至无杂质峰，即可。
在上述步骤(1)的色谱条件与系统适应性试验，其特征在于方法(1)中：流动相A为 乙腈梯度洗脱时，梯度1流动相的体积比为：A∶B＝10％～25％∶90％～75％，A+B＝100％， 流速1ml/min，检测波长为220～250nm，待芍药苷峰出现后0～15分钟流动相变化到梯度2， 梯度2流动相的体积比为：A∶B＝35％～45％∶65％～55％，A+B＝100％，流速1ml/min， 检测波长为230～260nm，待补骨脂素和异补骨脂素峰出现后，继续洗脱至无杂质峰，即可。
当流动相A为甲醇梯度洗脱时，优选的方案为：梯度1流动相的体积比例为A∶B＝30∶ 70，流速1ml/min1，检测波长230nm，待芍药苷峰出现后0～5分钟流动相变化到梯度2， 梯度2流动相的体积比为：A∶B＝45∶55，流速1ml/min，检测波长246nm，待补骨脂素和 异补骨脂素峰出现后，继续洗脱至无杂质峰，即可。
在上述步骤(2)的对照品溶液的制备，取芍药苷、补骨脂素、异补骨脂素对照品适量， 精密称定，加甲醇制成每1ml含芍药苷30μg、补骨脂素4μg、异补骨脂素4μg的混合溶 液，即得。
其研究步骤和详细数据如下：
实验材料与仪器：
实验材料：补脾益肠丸(广州陈李济药厂生产)；补脾益肠丸芍药苷阴性制剂(广州陈 李济药厂提供)；芍药苷对照品(中国药品生物制品检定所，110736-200423)；补骨脂素(中 国药品生物制品检定所，110739-200310)；异补骨脂素(中国药品生物制品检定所， 110738-200309)。
仪器：高效液相色谱仪Agilent 1200 Series，G1315B DAD。色谱柱：Agilent Hypersil ODS(4.0×250mm，5μm，柱号：USL0009671)。天平：Sartorious(CP225D)十万分之一天平， Sartorious(BS110S)万分之一天平。超声仪：SB5200DTD超声波清洗机(300W，40Hz)。
方法验证：
1.准确度：
1.1回收用对照品母液的制备：
精密称取芍药苷对照品20.00mg置50ml量瓶A中，补骨脂素对照品6.77mg置25ml量 瓶B中，异补骨脂素对照品5.86mg置25ml量瓶C中，B、C瓶加甲醇适量，使溶解，稀释至 刻度，摇匀。分别精密吸取B瓶中溶液7ml、C瓶中溶液7.3ml至A瓶中，使溶解，稀释至 刻度，摇匀，作为回收用对照品母液(每1ml含芍药苷0.4mg、补骨脂素0.037912mg、异 补骨脂素0.03422mg，相当于含补骨脂<以补骨脂素和异补骨脂素的总量计>0.07213mg)。
1.2回收供试品溶液的制备：
取同一批已知含量的供试品(批号：B06005，含量：芍药苷1.8819mg/g、补骨脂素 0.1779mg/g、异补骨脂素0.1616mg/g、补骨脂<以补骨脂素和异补骨脂素的总量计> 0.3395mg/g)粉末0.25g，精密称定，共取6份，分别置具塞锥形瓶中，精密加入上述回收 用对照品混合母液1.3ml，精密加入甲醇25ml，称定重量，超声40分钟，放冷，再称定重 量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
1.3回收试验测定结果(见表1)：
表1 回收试验测定结果(批号：B06005) NO 1 2 3 4 5 6 供试品取量(g))) 0.2562 0.2608 0.2651 0.2569 0.2628 0.2762 供 试 品 中 含 量 (mg ) 芍药苷 0.4821 0.4908 0.4989 0.4835 0.4946 0.5198 补骨脂素 0.0455 8 0.0464 0 0.0471 6 0.0457 0 0.0467 5 0.0491 4 异补骨脂 素 0.0414 0 0.0421 5 0.0428 4 0.0415 2 0.0424 7 0.0446 3 补骨脂 0.0869 8 0.0885 4 0.0900 0 0.0872 2 0.0892 2 0.0937 7 加 入 量 (mg ) 芍药苷 0.5200 0.5200 0.5200 0.5200 0.5200 0.5200 补骨脂素 0.0492 9 0.0492 9 0.0492 9 0.0492 9 0.0492 9 0.0492 9 异补骨脂 素 0.0444 9 0.0444 9 0.0444 9 0.0444 9 0.0444 9 0.0444 9 补骨脂 0.0937 7 0.0937 7 0.0937 7 0.0937 7 0.0937 7 0.0937 7 测 得 量 (mg ) 芍药苷 0.9921 1.0167 1.0418 1.0085 1.0380 1.0615 补骨脂素 0.0954 0.0966 0.0967 0.0967 0.0953 0.0982 异补骨脂 素 0.0954 0.0966 0.0967 0.0967 0.0953 0.0982 补骨脂 0.1808 0.1830 0.1832 0.1831 0.1807 0.1860 回 收 率 (％ ) 芍药苷 98.1 101.1 104.4 101.0 104.5 104.2 补骨脂素 101.1 101.9 100.5 103.4 98.6 99.6 异补骨脂 素 101.1 101.9 100.5 103.4 98.6 99.6 补骨脂 100.0 100.7 99.4 102.3 97.6 98.4 结 果 平均 SD RSD 芍药苷 102.2 2.59 2.54％ 补骨脂素 100.9 1.70 1.68％ 异补骨脂素 98.5 1.66 1.69％ 补骨脂 99.7 1.68 1.68％
2.精密度：
2.1重复性：取同一批号的供试品(批号：B06005)粉末约0.5g，精密称定，共6份， 依法制备供试液，测定，即得。结果见表2。
表2 重复性试验结果(批号：B06005) NO 取样量 (g) 芍药苷 (mg/g) 补骨脂素 (mg/g) 异补骨脂素 (mg/g) 补骨脂 (mg/g) 1 0.5046 1.7939 0.1739 0.1581 0.3320 2 0.4975 1.9292 0.1724 0.1570 0.3294 3 0.5101 1.8969 0.1773 0.1611 0.3384 4 0.5010 1.9239 0.1801 0.1637 0.3438 5 0.4956 1.8551 0.1851 0.1680 0.3531 6 0.4971 1.8924 0.1783 0.1620 0.3403 平均 1.8819 0.1779 0.1616 0.3395 SD 0.0506 0.0046 0.0040 0.0085 RSD 2.69％ 2.56％ 2.47％ 2.52％
2.2中间精密度：取同一批号的供试品(批号：B06005)6份，分别由A、B、C三人， 在不同时间，用同一台设备，按含量测定方法测定。结果见表3。
表3 中间精密度试验结果(批号：B06005) NO 取样量 (g) 芍药苷 (mg/g) 补骨脂素 (mg/g) 异补骨脂素 (mg/g) 补骨脂 (mg/g) 1 0.5016 1.9073 0.1984 0.1814 0.3797 0.5055 1.9347 0.1883 0.1709 0.3592 2 0.4998 2.1350 0.1951 0.1941 0.3892 0.5065 2.0868 0.1983 0.1970 0.3953 3 0.5109 2.0210 0.1819 0.1653 0.3472 0.5020 2.0123 0.1790 0.1631 0.3421 平均 2.0162 0.1902 0.1786 0.3612 SD 0.09 0.0084 0.0146 0.016 RSD 4.3％ 4.4％ 8.2％ 4.4％
3.专属性：
精密吸取对照品溶液、供试品溶液、白芍的阴性样品溶液、补骨脂的阴性样品溶液各10 μl，分别注入液相色谱仪，按含量测定方法测定。
结果，补脾益肠丸芍药苷阴性样品色谱在芍药苷对照品色谱相应位置上无干扰，补骨脂 素、异补骨脂素阴性样品色谱在补骨脂素、异补骨脂素对照品色谱相应位置上的干扰小于5 ％，可忽略不计(结果见表4)。供试品色谱中芍药苷峰、补骨脂素峰、异补骨脂素峰与相邻 峰的分离度均大于1.5，符合《中国药典》2005年版一部附录的有关要求。
表4 专属性结果 芍药苷 补骨脂素 异补骨脂素 补骨脂 保留时间(分) 7.3 20.6 22.1 - 样品(峰面积) 717.6 330 366.7 696.7 补骨脂阴性(峰面 积) - 9 11.7 20.7 干扰大小 - 2.7％ 3.2％ 3.0％
4线性：
精密吸取3.1.1中回收用对照品母液10ml，置100ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇 匀即得(每1ml含芍药苷0.04mg、补骨脂素0.0037912mg、异补骨脂素0.003422mg)，作为 低浓度对照品混合溶液。精密吸取上述低浓度对照品混合溶液1μl、2μl、3μl、5μl、10 μl，3.1.1中回收用对照品母液(作为高浓度对照品混合溶液)2μl、3μl、4μl，注入液 相色谱仪，按含量测定方法测定，平行进样各两次，以两次峰面积平均值为纵坐标、分别以 芍药苷进样量、补骨脂素进样量、异补骨脂素进样量(μg)为横坐标，分别绘制标准曲线， 芍药苷在0.04μg～1.6μg的范围内，得回归方程为：Y＝1231.4781X-3.3727(r＝0.99999)； 补骨脂素在0.0037912μg～0.151648μg的范围内，得回归方程为：Y＝6871.2627X-2.0545 (r＝0.99999)；异补骨脂素在0.003422μg～0.13688μg的范围内，得回归方程为： Y＝6961.1953X-1.1296(r＝0.99999)。结果见表5。
表5 线性考察 进样 体积 (μl) 进样量(μg) 峰面积 芍药苷 补骨脂素 异补骨脂 素 芍药苷 补骨脂素 异补骨脂素 低 浓 度 1 0.04 0.0037912 0.003422 49.3 24.9 22.45 2 0.08 0.0075824 0.006844 96.7 50.2 46.6 3 0.12 0.0113736 0.010266 144.7 76.2 70.05 5 0.2 0.018956 0.01711 241.1 127.85 117.8 10 0.4 0.037912 0.03422 478.1 257.8 237.15 高 浓 度 2 0.8 0.075824 0.06844 987.3 516 473.35 3 1.2 0.113736 0.10266 1481.7 779.8 713.9 4 1.6 0.151648 0.13688 1961.5 1041 952 斜率a 1231.4781 6871.2627 6961.1953 截距b -3.3727 -2.0545 -1.1296 相关系数r 0.99999 0.99999 0.99999
5.范围：
本标准规定每1g含白芍以芍药苷(C23H28O11)计，不得少于1.1mg；含补骨脂以补骨脂素 (C11H6O3)和异补骨脂素(C11H6O3)的总量计，不得少于0.16mg。故按限度的50％(即芍药苷 0.55mg/g、补骨脂0.08mg/g)和500％(即芍药苷5.5mg/g、补骨脂0.8mg/g)来考察测定范围 的准确度。
取同一批已知含量的供试品(批号：B06005，含量：芍药苷1.8819mg/g、补骨脂素 0.1779mg/g、异补骨脂素0.1616mg/g、补骨脂0.3395mg/g)12份，其中低限取6份，每份 约70mg，精密称定，分别精密加入3.4中低浓度对照品混合溶液3.3ml；高限取6份，每份 约0.7g，精密称定，分别精密加入3.1.1中回收用对照品母液3.3ml，依法制备供试液，按 含量测定的方法测定，计算芍药苷、补骨脂素、异补骨脂素和补骨脂的回收率。结果见表6、 表7。
表6 高浓度回收试验测定结果(批号：B06005) NO 1 2 3 4 5 6 供试品取量(g))) 0.6756 0.7092 0.6870 0.6923 0.6825 0.6917 供 试 品 中 含 量 (mg ) 芍药苷 1.2714 1.3346 1.2929 1.3028 1.2844 1.3017 补骨脂素 0.1202 0.1262 0.1222 0.1232 0.1214 0.1231 异补骨脂 素 0.1092 0.1146 0.1110 0.1119 0.1103 0.1118 补骨脂 0.2294 0.2408 0.2332 0.2350 0.2317 0.2348 加 入 量 (mg ) 芍药苷 1.3200 1.3200 1.3200 1.3200 1.3200 1.3200 补骨脂素 0.1251 0.1251 0.1251 0.1251 0.1251 0.1251 异补骨脂 素 0.1129 0.1129 0.1129 0.1129 0.1129 0.1129 补骨脂 0.2380 0.2380 0.2380 0.2380 0.2380 0.2380 测 得 量 (mg ) 芍药苷 2.5809 2.7143 2.6183 2.6847 2.6404 2.6318 补骨脂素 0.2459 0.2483 0.2491 0.2456 0.2486 0.2518 异补骨脂 素 0.2204 0.2224 0.2227 0.2207 0.2233 0.2255 补骨脂 0.4663 0.4707 0.4718 0.4663 0.4719 0.4773 回 收 芍药苷 99.2 104.5 100.4 104.7 102.7 100.8 补骨脂素 100.5 97.6 101.4 97.9 101.7 102.9 率 (％) 异补骨脂 素 98.5 95.5 98.9 96.4 100.1 100.7 补骨脂 99.5 96.6 100.2 97.2 100.9 101.9 结 果 平均 SD RSD 芍药苷 102.1 2.28 2.23％ 补骨脂素 100.3 2.13 2.13％ 异补骨脂素 98.3 2.06 2.09％ 补骨脂 99.4 2.09 2.10％
表7 低浓度回收试验测定结果(批号：B06005) NO 1 2 3 4 5 6 供试品取量(g))) 0.0677 4 0.0678 9 0.0697 1 0.0645 2 0.0683 7 0.0669 8 供 试 品 中 含 量 (mg ) 芍药苷 0.1275 0.1278 0.1312 0.1214 0.1287 0.1260 补骨脂素 0.0120 5 0.0120 8 0.0124 0 0.0114 8 0.0121 6 0.0119 2 异补骨脂 素 0.0109 5 0.0109 7 0.0112 7 0.0104 3 0.0110 5 0.0108 2 补骨脂 0.0230 0 0.0230 5 0.0236 7 0.0219 0 0.0232 1 0.0227 4 加 入 量 (mg ) 芍药苷 0.1200 0.1200 0.1200 0.1200 0.1200 0.1200 补骨脂素 0.0113 7 0.0113 7 0.0113 7 0.0113 7 0.0113 7 0.0113 7 异补骨脂 素 0.0102 7 0.0102 7 0.0102 7 0.0102 7 0.0102 7 0.0102 7 补骨脂 0.0216 4 0.0216 4 0.0216 4 0.0216 4 0.0216 4 0.0216 4 测 得 量 (mg ) 芍药苷 0.2482 0.2431 0.2482 0.2449 0.2482 0.2452 补骨脂素 0.0231 1 0.0235 4 0.0238 3 0.0223 5 0.0237 4 0.0229 5 异补骨脂 素 0.0207 3 0.0211 4 0.0214 2 0.0202 3 0.0214 8 0.0207 3 补骨脂 0.0438 4 0.0446 8 0.0452 5 0.0425 8 0.0452 2 0.0436 8 回 收 率 (％) 芍药苷 100.6 96.1 97.5 102.9 99.6 99.3 补骨脂素 97.2 100.8 100.5 95.6 101.8 97.0 异补骨脂 素 95.3 99.0 98.9 95.5 101.6 96.5 补骨脂 96.3 100.0 99.8 95.6 101.7 96.8 结 果 平均 SD RSD 芍药苷 99.3 2.36 2.38％ 补骨脂素 98.8 2.51 2.54％ 异补骨脂素 97.8 2.46 2.52％ 补骨脂 98.3 2.46 2.50％
根据线性、准确度、精密度的试验结果，样品在芍药苷的含量为0.55mg/g～5.5mg/g、 补骨脂的含量为0.08mg/g～0.8mg/g的范围内，含量测定方法的精密度和准确度均符合规定。
6.耐用性：
6.1稳定性：取同一份供试品溶液，按含量测定方法，分别在不同时间测定，结果供 试品溶液在24小时内测得的峰面积基本稳定。结果见表8。
表8 供试品溶液稳定性考察 时间间隔 (h) 峰面积 芍药苷 补骨脂素 异补骨脂素 0 514.8 289.9 261 1 519.6 294 264.9 3 527.4 295.7 265.2 5 535.2 295.2 266.6 8 528.3 294.4 265.7 11 531.6 296 266.6 15 521.3 295.8 266.8 24 546.1 296.2 264.9 平均 528.0 294.7 265.2 RSD 1.87％ 0.70％ 0.71％
6.2提取条件的考察：
6.2.1提取方法的选择：
超声法：取供试品适量，研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇 50ml，称定重量，超声1小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过， 取续滤液，即得。
回流法：取供试品按超声法操作，将“超声1小时”改为“回流2小时”，其余同超声 法制备。
取上述两种溶液，分别测定芍药苷、补骨脂(以补骨脂素、异补骨脂素的总量计)的含 量。结果两种提取方法效果基本一致(见表9)。因此选用超声法提取。
表9 不同提取方法的试验结果 提取方法 回流法 超声法 含量 (mg/g) 芍药苷 1.7753 1.7714 补骨脂 0.3212 0.3265
6.2.2不同溶剂的选择：
取同一批供试品3份，按超声法提取，分别用甲醇25ml、50ml、乙醇50ml超声30分钟， 其余照3.6.2.1中超声法操作，制成供试品溶液，分别测定芍药苷、补骨脂(以补骨脂素、 异补骨脂素的总量计)的含量。以上提取方法，结果基本一致，(见表10)。选用甲醇25ml 提取。
表10 不同溶剂体积的选择结果 溶剂 甲醇25ml 甲醇50ml 乙醇50ml 含量 (mg/g) 芍药苷 1.7456 1.7716 1.7429 补骨脂 0.3289 0.3265 0.3316
6.2.3提取时间的选择：
取同一批供试品6份，按超声法提取，分别超声处理15分钟、30分钟、40分钟、60 分钟，其余照3.6.2.1中超声法操作，制成供试品溶液，分别测定芍药苷、补骨脂(以补骨 脂素、异补骨脂素的总量计)的含量。结果见表11。选用超声提取40分钟。
表11 提取时间的考察 提取方法 取样量(g) 测得含量(mg/g) 芍药苷 补骨脂 超声15分钟 0.5127 1.7668 0.3232 超声30分钟 0.5036 1.7456 0.3289 超声40分钟 0.5195 1.7859 0.3345 超声60分钟 0.4873 1.6579 0.3278
7.含量测定：
取不同批号的补脾益肠丸，按含量测定方法，分别测定芍药苷、补骨脂(以补骨脂素、 异补骨脂素的总量计)的含量。结果详见表12。
表12 补脾益肠丸的含量测定结果 批号 取样量 (g) 含量(mg/g) 平均含量(mg/g) 芍药苷 补骨脂 芍药苷 补骨脂 B06012 0.5109 2.4046 0.4018 2.3655 0.3991 0.5020 2.3264 0.3964 B06014 0.5025 2.5933 0.3934 2.5867 0.3924 0.5073 2.5801 0.3913 B06017 0.5054 2.2013 0.3939 2.1938 0.3938 0.4987 2.1863 0.3936 H06070 0.5008 2.4159 0.4262 2.4275 0.4277 0.5030 2.4366 0.4305 0.5033 2.4301 0.4264 EKF04010 0.4820 3.3859 0.3572 3.2623 0.3749 0.4727 3.1387 0.3925 B06011 0.5013 2.5129 0.4068 2.5059 0.4084 0.5058 2.4988 0.4100 B06015 0.5062 2.3620 0.4103 2.3615 0.4062 0.5190 2.3609 0.4020 B06013 0.5016 2.3901 0.3591 2.4063 0.3607 0.5104 2.4225 0.3623 V06155 0.5003 1.6687 0.4127 1.6831 0.4100 0.5059 1.6975 0.4074 B06005 0.4975 1.9292 0.3294 1.9131 0.3339 0.5101 1.8969 0.3384
8.限度制订：
依照供试品处方，每1g丸含白芍0.0759g，按《中国药典》2005年版一部“白芍”[含 量测定]规定，白芍中含芍药苷不得少于1.6％，按此推算成品中芍药苷理论含量的90％计 算，供试品芍药苷的限度暂订为每1g不得低于1.1mg。
依照补脾益肠丸的处方，水蜜丸每1g含补骨脂0.0253g，按《中国药典》2005年版一 部“补骨脂”[含量测定]规定，补骨脂中补骨脂素、异补骨脂素的总量的限度为0.7％，按 补骨脂中补骨脂素、异补骨脂素的总量的低限推算成品中的理论含量的90％计算，水蜜丸中 补骨脂中补骨脂素、异补骨脂素的总量的限度暂订为每1g不得低于0.16mg。
通过以上的方法学考察，可见本发明所述的质量检测方法相对简单，具良好的精密度， 重现性和可靠性，可同时测定补脾益肠丸中白芍和补骨脂的活性成分的含量，可用于补脾益 肠丸的质量控制。
附图说明
下面给出补脾益肠丸在不同条件下的含量测定图谱，进一步说明本发明的特点(得到的色谱 峰依次为芍药苷、补骨脂素、异补骨脂素，均已注明保留时间)：
图1：芍药苷、补骨脂素和异补骨脂素混合对照品溶液，以甲醇-水为流动相(梯度1为30∶ 70；梯度2为45∶55)，梯度洗脱，变换波长检测得到的色谱图
图2：补脾益肠丸样品溶液，以甲醇-水(梯度1为30∶70；梯度2为45∶55)为流动相， 梯度洗脱，变换波长检测得到的色谱图
图3：芍药苷、补骨脂素和异补骨脂素混合对照品溶液，以乙腈-水为流动相(梯度1为23∶ 77；梯度2为45∶55)，梯度洗脱，变换波长检测得到的色谱图
图4：补脾益肠丸样品溶液，以乙腈-水(梯度1为23∶77；梯度2为45∶55)为流动相， 梯度洗脱，变换波长检测得到的色谱图
图5：补脾益肠丸样品溶液，以甲醇-水(梯度1为15∶85；梯度2为35∶65)为流动相， 梯度洗脱，变换波长检测得到的色谱图
图6-1：补脾益肠丸样品溶液，以甲醇-水(梯度1为30∶70；梯度2为45∶55)为流动 相，梯度洗脱，双波长检测(检测波长为230nm)得到的色谱图
图6-2：补脾益肠丸样品溶液，以甲醇-水(梯度1为30∶70；梯度2为45∶55)为流动 相，梯度洗脱，双波长检测(检测波长为246nm)得到的色谱图
具体实施方式
实施例1(补脾益肠丸：陈李济药厂提供，批号：B06012)
【含量测定】白芍 补骨脂 照高效液相色谱法(中国药典2005年版一部附录VI D)测 定。
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇为流动相A，以水 为流动相B，变波长检测，按下表进行梯度洗脱检测。理论板数按芍药苷峰计算应不低于2000。 时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％) 波长 0～10 30 70 230nm 10～15 30→45 70→55 246nm 15～30 45 55
对照品溶液的制备 精密称取芍药苷对照品、补骨脂素对照品、异补骨脂素对照品适量，加 甲醇制成每1ml含芍药苷30μg、补骨脂素4μg、异补骨脂素4μg的混合溶液，即得。
供试品溶液的制备 取供试品适量，研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加 入甲醇25ml，称定重量，超声40分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀， 滤过，取续滤液，即得。
测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。 供试品每1g含白芍以芍药苷(C23H28O11)计，不得少于1.1mg；含补骨脂以补骨脂素(C11H6O3) 和异补骨脂素(C11H6O3)的总量计，不得少于0.16mg。
测定结果 芍药苷含量为2.3655mg/g，补骨脂(以补骨脂素和异补骨脂素总量计)含量为 0.3991mg/g。
实施例2(补脾益肠丸：陈李济药厂提供，批号：B06012)
【含量测定】白芍 补骨脂 照高效液相色谱法(中国药典2005年版一部附录VI D)测 定。
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以水 为流动相B，变波长检测，按下表进行梯度洗脱检测。理论板数按芍药苷峰计算应不低于2000。 时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％) 波长 0～7 23 77 230nm 7～10 23→45 77→55 246nm 10～30 45 55
对照品溶液的制备 精密称取芍药苷对照品、补骨脂素对照品、异补骨脂素对照品适量，加 甲醇制成每1ml含芍药苷30μg、补骨脂素4μg、异补骨脂素4μg的混合溶液，即得。
供试品溶液的制备 取供试品适量，研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加 入甲醇25ml，称定重量，超声40分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀， 滤过，取续滤液，即得。
测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。 供试品每1g含白芍以芍药苷(C23H28O11)计，不得少于1.1mg；含补骨脂以补骨脂素(C11H6O3) 和异补骨脂素(C11H6O3)的总量计，不得少于0.16mg。
测定结果 芍药苷含量为2.4022mg/g，补骨脂(以补骨脂素和异补骨脂素总量计)含量为 0.3965mg/g。
实施例3(补脾益肠丸：陈李济药厂提供，批号：B06012)
【含量测定】白芍 补骨脂 照高效液相色谱法(中国药典2005年版一部附录VI D)测 定。
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇为流动相A，以水 为流动相B，变波长检测，按下表进行梯度洗脱检测。理论板数按芍药苷峰计算应不低于2000。 时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％) 波长 0～20 15 85 230nm 20～35 15→35 85→65 246nm 35～60 35 65
对照品溶液的制备 精密称取芍药苷对照品、补骨脂素对照品、异补骨脂素对照品适量，加 甲醇制成每1ml含芍药苷30μg、补骨脂素4μg、异补骨脂素4μg的混合溶液，即得。
供试品溶液的制备 取供试品适量，研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加 入甲醇25ml，称定重量，超声40分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀， 滤过，取续滤液，即得。
测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。 供试品每1g含白芍以芍药苷(C23H28O11)计，不得少于1.1mg；含补骨脂以补骨脂素(C11H6O3) 和异补骨脂素(C11H6O3)的总量计，不得少于0.16mg。
测定结果 芍药苷含量为2.6501mg/g，补骨脂(以补骨脂素和异补骨脂素总量计)含量为 0.4008mg/g。
实施例4(补脾益肠丸：陈李济药厂提供，批号：B06012)
【含量测定】白芍 补骨脂 照高效液相色谱法(中国药典2005年版一部附录VI D)测 定。
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇为流动相A，以水 为流动相B，双波长检测，按下表进行梯度洗脱检测。理论板数按芍药苷峰计算应不低于2000。 时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％) 双波长 0～10 30 70 230nm 246nm 10～15 30→45 70→55 15～30 45 55
对照品溶液的制备 精密称取芍药苷对照品、补骨脂素对照品、异补骨脂素对照品适量，加 甲醇制成每1ml含芍药苷30μg、补骨脂素4μg、异补骨脂素4μg的混合溶液，即得。
供试品溶液的制备 取供试品适量，研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加 入甲醇25ml，称定重量，超声40分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀， 滤过，取续滤液，即得。
测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。 供试品每1g含白芍以芍药苷(C23H28O11)计，不得少于1.1mg；含补骨脂以补骨脂素(C11H6O3) 和异补骨脂素(C11H6O3)的总量计，不得少于0.16mg。
测定结果 芍药苷含量为2.2633mg/g，补骨脂(以补骨脂素和异补骨脂素总量计)含量为 0.3976mg/g。