一种结核分枝杆菌自然感染非人灵长类动物模型的建立方法及装置.pdf

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1、10申请公布号CN104127444A43申请公布日20141105CN104127444A21申请号201410374917822申请日20140730A61K35/74200601A01K1/03200601A01K1/035200601A01K1/0020060171申请人武汉大学地址430072湖北省武汉市武昌区珞珈山武汉大学72发明人霍文哲付博文郭铭李湘东王勇74专利代理机构武汉科皓知识产权代理事务所特殊普通合伙42222代理人张火春54发明名称一种结核分枝杆菌自然感染非人灵长类动物模型的建立方法及装置57摘要本发明提供一种结核分枝杆菌自然感染非人灵长类动物模型的建立方法，通过将健康。

2、非人灵长类动物与经过人工感染结核并有咳嗽的非人灵长类动物一起饲养于气流自循环组合式负压隔离器中，使其自然感染上结核。自然感染模型的建立有助于揭示激活结核潜伏感染的条件因子（如艾滋病毒）及相关机制。并且为研发和评估抗结核疫苗和药物提供了更有临床意义的非人灵长类动物模型。51INTCL权利要求书2页说明书10页附图7页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书10页附图7页10申请公布号CN104127444ACN104127444A1/2页21一种气流自循环组合式负压隔离器，由隔离系统、负压调节系统、消毒清洗系统组成组合式负压隔离器，其中隔离系统包括两个或多个由不锈钢外。

3、壳以及玻璃门完整密封拼接之后形成的壳体，其特征在于还包括气流自循环系统，该系统由PLC控制单元、导流风扇、滤网及导流板、循环管道、循环风机、气动阀门、送风风机组成，PLC控制单元安装在负压隔离器左侧,导流风扇设置在隔离系统相邻壳体之间，滤网及导流板设置在负压隔离器右侧、循环管道、循环风机、气动阀门、送风风机设置在负压隔离器顶部。2根据权利要求1所述的负压隔离器，其特征在于多个壳体可并排安放，壳体内设置有动物笼，动物笼分为上、下两层。3根据权利要求1或2所述的负压隔离器，其特征在于所述负压调节系统包括安装在负压隔离器顶部的送风阀、送风口、送风风机、管道、安装在隔离系统相邻壳体之间的导流风扇、负压。

4、隔离器右侧背部的高效过滤器、排风管、排风风机、排风阀，排风口，排风口经过软管与实验室排风设备相连接，负压隔离器左侧用于监测过滤器的压差表、及控制送、排风风量的PLC控制单元组成，最终达到压力梯度的控制要求。4一种结核分枝杆菌自然感染非人灵长类动物模型的建立方法，其特征在于经过下列步骤A、选择对非人灵长类动物敏感的结核杆菌；B、活化结核杆菌，并制备成1020CFU/毫升浓度的菌悬液；C、用人工感染的方式感染至少2只健康非人灵长类动物；D、将人工感染的非人灵长类动物在感染结核分支杆菌后当天与健康非人灵长类动物一起放置于权利要求13任意一项所述的气流自循环组合式负压隔离器内进行饲养；E、在动物生物安。

5、全三级实验室内饲养与观察；F、判定动物结核病阳性模型。5根据权利要求4中建立结核分枝杆菌自然感染非人灵长类动物模型的方法，其特征在于非人灵长类动物是中国猕猴。6根据权利要求4中建立结核分枝杆菌自然感染非人灵长类动物模型的方法，其特征在于对非人灵长类动物敏感的结核杆菌是人型结核分枝杆菌H37RV株。7根据权利要求4中建立结核分枝杆菌自然感染非人灵长类动物模型的方法，其特征在于人工感染的方式为通过纤维支气管镜将结核杆菌直接接种到健康非人灵长类动物的肺部。8根据权利要求4中建立结核分枝杆菌自然感染非人灵长类动物模型的方法，其特征在于判定动物结核病感染阳性的评价指标是体温、体重、血沉、C反应蛋白、胸部。

6、X光片、旧结核菌素皮肤试验（TUBERCULINSKINTEST，TST）以及特异性免疫反应TB特异性IFN。9根据权利要求4中建立结核分枝杆菌自然感染非人灵长类动物模型的方法，其特征在于经过下列步骤A、选择对中国猕猴敏感的结核杆菌H37RV株；B、活化结核杆菌，并制备成10CFU/毫升浓度的菌悬液；C、用纤维支气管镜将结核杆菌直接接种到2只健康非人灵长类动物的肺部；D、将人工感染的非人灵长类动物在感染结核分支杆菌后当天与健康非人灵长类动物一起放置于权利要求13任意一项所述的气流自循环组合式负压隔离器内进行饲养；权利要求书CN104127444A2/2页3E、在动物生物安全三级实验室内饲养与观。

7、察50周；F、判定动物结核病阳性模型。10根据权利要求49任意一项建立的结核分枝杆菌自然感染非人灵长类动物模型用于抗结核分枝杆菌药物筛选的用途。11根据权利要求49任意一项建立的结核分枝杆菌自然感染非人灵长类动物模型用于抗结核分枝杆菌疫苗评价中的用途。权利要求书CN104127444A1/10页4一种结核分枝杆菌自然感染非人灵长类动物模型的建立方法及装置技术领域0001本发明涉及一种动物模型的建立方法及装置，特别涉及一种结核分枝杆菌自然感染非人灵长类动物模型的建立方法及装置。背景技术0002结核病TUBERCULOSIS,TB是由结核分枝杆菌MYCOBACTERIUMTUBERCULOSIS,。

8、MTB引起的全世界范围内高发、难治的呼吸道传染病之一，位居单一病原体引起死亡的严重传染病之首，是严重危害公众健康的全球性公共卫生问题1。自上世纪80年代以来，由于流动人口增加，艾滋病的迅速蔓延，卡介苗预防效果的局限性以及耐多药MTB株的出现等因素，使得一度得到较好控制的结核又死灰复燃，发病率和死亡率呈明显上升趋势，给结核的防治带来新的严峻挑战。据世界卫生组织报道全球有20亿人感染MTB。我国是仅次于印度的全球第二大结核高负担国家2。0003由于绝大多数90感染了结核的人群不发病，处于潜伏感染状态，因此，研发预防和治疗结核潜伏感染的疫苗和药物已成为当今结核研究领域的重大课题3。评估抗结核疫苗和药。

9、物有赖于合适的动物模型。尽管大、小鼠、豚鼠、兔等小动物结核模型已被用于结核病原学、药物毒理学以及发病机制的研究4，但这些模型难以模拟人类TB的疾病过程，尤其是MTB潜伏感染5。相比之下，从动物进化关系而言，非人灵长类动物是人类的近亲，在形态结构、生理机能、生化代谢和免疫功能等方面与人高度相似，其结核感染的临床表现、X线胸片观察和组织病理学变化、特异性T淋巴细胞免疫反应与人类结核极为接近610，因此，其实验结果最容易外推于人。正是由于非人灵长类动物结核发病及病程发展和人类结核的相似性，该模型已成为抗结核疫苗和药物研发最为重要的实验动物平台。0004尽管世界各国科学家积极致力于TB猕猴模型的研究，。

10、但是，这些研究均以人工的方式如纤支镜或支气管接种直接将结核分枝杆菌接种到猕猴气管或肺内1114，然后放置在独立的负压隔离器中饲养，现有技术中的负压隔离器的气流都是单体循环，气流速度快，空气不能在隔离器间循环流动如图1，这与结核分枝杆菌在人类传播的方式差别巨大。人类结核病是通过患者咳嗽产生的气溶胶传播结核菌，使之自然感染上其他人群。绝大多数90结核自然感染者不发病，处于潜伏感染状态。与此相反，大多数6080人工感染的猕猴发展为急性活动性结核病，在短期内迅速死亡。显然，经口、鼻以及上下呼吸道的自然途径感染与人工结核感染有很大差别，主要体现在机体对侵入的结核分枝杆菌免疫反应模式方面。由于没有受到上呼。

11、吸道粘膜免疫系统的识别和干扰，人工感染使结核分枝杆菌能顺利进入下呼吸道，建立肺部感染，导致大部分被感染的猕猴急性发病死亡。而在临床上，大部分人感染结核分枝杆菌而不发病，只有当机体免疫力低下时如感染艾滋病毒后，潜伏感染可转变成活动性结核。此外，气管人工感染方式，感染菌株均为体外培养的菌株，这些培养基中扩增的菌株和在自然界中宿主体内菌株生长环境不同，因此其表型说明书CN104127444A2/10页5也有差异。这样的体外扩增菌株不能完全模拟自然界中感染菌株从一宿主体内转移到另一宿主体内的这一完整过程。因此，这种通过人工感染方式建立的猕猴结核感染模型与人类感染结核分枝杆菌后大部分成为潜伏感染差别甚大。

12、，建立结核自然感染空气传播非人灵长类感染模型将具有十分重要的临床意义，是研发和评估新型抗结核药物和疫苗的必不可少的组成部分。0005参考文献00061王黎霞,成诗明,陈明亭2010年全国第五次结核病流行病学抽样调查报告中国防痨杂志,2012,3448550800072ORGANIZATIONWHGLOBALTUBERCULOSISCONTROLWHOREPORTWORLDHEALTHORGANIZATION,201000083ANDERSENP,DOHERTYTMTHESUCCESSANDFAILUREOFBCGIMPLICATIONSFORANOVELTUBERCULOSISVACCINEN。

13、ATREVMICROBIOL,2005；365666200094DHARMADHIKARIAS,NARDELLEAWHATANIMALMODELSTEACHHUMANSABOUTTUBERCULOSISAMJRESPIRCELLMOLBIOL,2008；3950350800105黎友伦,王国治,罗永艾结核分枝杆菌潜伏感染动物模型及评价中华结核和呼吸杂志,2005；2855255400116FLYNNJL,CAPUANOSV,CROIXD,PAWARS,MYERSA,ZINOVIKA,KLEINENONHUMANPRIMATESAMODELFORTUBERCULOSISRESEARCHTUBER。

14、CULOSISEDINB,2003；8311611800127MEHRAS,PAHARB,DUTTANK,CONERLYCN,PHILIPPIFALKENSTEINK,ALVAREZX,ANDKAUSHALDTRANSCRIPTIONALREPROGRAMMINGINNONHUMANPRIMATERHESUSMACAQUETUBERCULOSISGRANULOMASPLOSONE,2010；58E1226600138DIEDRICHCR,MATTILAJT,KLEINE,JANSSENC,PHUAHJ,STURGEONTJ,MONTELARORC,LINPL,ANDFLYNNJLREACTIV。

15、ATIONOFLATENTTUBERCULOSISINCYNOMOLGUSMACAQUESINFECTEDWITHSIVISASSOCIATEDWITHEARLYPERIPHERALTCELLDEPLETIONANDNOTVIRUSLOADPLOSONE,2010；53E961100149MEHRAS,GOLDENNA,DUTTANK,MIDKIFFCC,ALVAREZX,DOYLELA,ASHERM,RUSSELLLODRIGUEK,MONJUREC,ROYCJ,BLANCHARDJL,DIDIERPJ,VEAZEYRS,LACKNERAA,ANDKAUSHALDREACTIVATIONOF。

16、LATENTTUBERCULOSISINRHESUSMACAQUESBYCOINFECTIONWITHSIMIANIMMUNODECIENCYVIRUSJMEDPRIMATOL,2011；404233243001510CEPEDAM,SALASM,FOLWARCZNYJ,LEANDROAC,HODARAVL,DELAGARZAMA,DICKEJ,JR,OWSTONM,ARMITIGELY,ANDGAUDUINMCESTABLISHMENTOFANEONATALRHESUSMACAQUEMODELTOSTUDYMYCOBACTERIUMTUBERCULOSISINFECTIONTUBERCULO。

17、SISEDINB,2013；93SUPPLS5159001611LUCIWPA,OSLUNDKL,YANGXW,ADAMSONL,RAVINDRANR,CANFIELDDR,TARARAR,HIRSTL,CHRISTENSENM,LERCHENW,OFFENSTEINH,LEWINSOHND,VENTIMIGLIAF,BRIGNOLOL,WISNERER,ANDHYDEDMSTEREOLOGICALANALYSISOFBACTERIALLOADANDLUNGLESIONSINNONHUMANPRIMATESRHESUSMACAQUES说明书CN104127444A3/10页6EXPERIMEN。

18、TALLYINFECTEDWITHMYCOBACTERIUMTUBERCULOSISAMJPHYSIOLLUNGCELLMOLPHYSIOL,2011；3015731738001712PAYNEKS,NOVAKJJ,JONGSAKULK,IMERBSINR,APISITSAOWAPAY,PAVLINJA,ANDHINDSSBMYCOBACTERIUMTUBERCULOSISINFECTIONINACLOSEDCOLONYOFRHESUSMACAQUESMACACAMULATTAJAMASSOCLABANIMSCI,2011；501105108001813WALSHGP,TANEV,DELACR。

19、UZEC,ABALOSRM,VILLAHERMOSALG,YOUNGLJ,CELLONARV,NAZARENOJB,HORWITZMATHEPHILIPPINECYNOMOLGUSMONKEYMACACAFASICULARISPROVIDESANEWNONHUMANPRIMATEMODELOFTUBERCULOSISTHATRESEMBLESHUMANDISEASENATMED,1996；2430436001914CAPUANOSV,3RD,CROIXDA,PAWARS,ZINOVIKA,MYERSA,LINPL,BISSELS,FUHRMANC,KLEINE,FLYNNJLEXPERIMEN。

20、TALMYCOBACTERIUMTUBERCULOSISINFECTIONOFCYNOMOLGUSMACAQUESCLOSELYRESEMBLESTHEVARIOUSMANIFESTATIONSOFHUMANMTUBERCULOSISINFECTIONINFECTIMMUN,2003；7158315844发明内容0020针对现有TB猕猴模型均以人工的方式如纤支镜或支气管接种直接将结核分枝杆菌接种到猕猴气管或肺内，大多数6080人工感染的猕猴发展为急性活动性结核病，在短期内迅速死亡，无法模拟人类感染结核分枝杆菌后大部分成为潜伏感染的过程的缺陷，本发明提供一种在生物安全三级实验室内建立自然MTB感。

21、染空气传播的非人灵长类动物模型的方法及装置。0021通过改造现有单个负压隔离室成气流自循环组合式负压隔离器，其包括由隔离系统、负压调节系统、消毒清洗系统组成的组合式负压隔离器，其中隔离系统包括两个或多个由不锈钢外壳以及玻璃门完整密封拼接之后形成的壳体，其特征在于还包括气流自循环系统，该系统由PLC控制单元、导流风扇、滤网及导流板、循环管道、循环风机、气动阀门、送风风机组成，PLC控制单元安装在负压隔离器左侧,导流风扇设置在隔离系统相邻壳体之间，滤网及导流板设置在负压隔离器右侧、循环管道、循环风机、气动阀门、送风风机设置在负压隔离器顶部。0022进一步地，多个壳体可并排安放，与外界形成的一道物理。

22、屏障。壳体内设置有动物笼，动物笼分为上、下两层。0023更进一步地，所述负压调节系统包括安装在负压隔离器顶部的送风阀、送风口、送风风机、管道、安装在隔离系统相邻壳体之间的导流风扇、负压隔离器右侧背部的高效过滤器、排风管、排风风机、排风阀，排风口，排风口经过软管与实验室排风设备相连接，负压隔离器左侧用于监测过滤器的压差表、及控制送、排风风量的PLC控制单元组成，最终达到压力梯度的控制要求。0024隔离室间空气相互交流，反复循环，保证健康动物能最大限度地接触到带有致病病原的气溶胶通过人工感染的动物咳嗽所产生空气，造成感染。0025本发明通过下列技术方案完成一种建立结核分枝杆菌自然感染非人灵长类动物。

23、或小动物模型的方法，其特征在于经过下列步骤0026A、选择对非人灵长类动物或小动物敏感的结核分枝杆菌；说明书CN104127444A4/10页70027B、将活化结核分枝杆菌制备成1020CFU/毫升浓度的菌悬液；0028C、用人工感染的方式感染12只健康非人灵长类动物或小动物；0029D、在感染结核分支杆菌后当天，将人工感染的非人灵长类动物或小动物与健康非人灵长类动物或小动物一起放置于权利要求13任意一项所述的气流自循环组合式负压隔离器内进行饲养；0030E、在动物生物安全三级实验室内饲养与观察50周或更长时间；0031F、判定动物是否感染上结核。0032在本发明中，有选择性地选用人型结核分。

24、枝杆菌ERDMANKO1、H37RV株或临床株，作为对非人灵长类动物敏感的结核杆菌使用。ERDMANKO1来源于美国食品药品管理局，编号为WIT0628；H37RV登录在中国医学微生物菌种目录中，保藏号是CMCC93009。0033在活化人型结核分枝杆菌后，将菌株制备成1020CFU/毫升浓度的菌悬液，2毫升注射入非人灵长类动物。0034在本发明中，通过纤维支气管镜将结核杆菌直接接种到健康非人灵长类动物的肺部，使其感染，并在动物生物安全三级实验室内饲养，每日观察被感染的非人灵长类动物的食欲和咳嗽等临床表现，和检测各项临床指标体温、体重、血沉、C反应蛋白、胸部X光片、旧结核菌素皮肤试验TUBER。

25、CULINSKINTEST，TST以及免疫学检查，通过这些指标，综合判断是否感染结核杆菌。人工感染结核杆菌的非人灵长类动物在感染后当天即被置于有健康非人灵长类动物的气流自循环组合式负压隔离器中。这种组合式负压隔离器由2个或2个以上隔离室组成，隔离室间空气相互交流，反复循环，保证健康动物能最大限度地接触到带有致病病原气溶胶的空气。0035在动物生物安全三级实验室内饲养与观察。在随后的实验中，密切观察临床表现和检测各项临床指标体温、体重、血沉、C反应蛋白、胸部X光片、旧结核菌素皮肤试验TST以及免疫学检查。当组合隔离室内的健康非人灵长类动物出现结核临床表观指征体温上升，血沉加快，C反应蛋白增高和特。

26、异性免疫反应TST阳性，TB特异性IFN时，继续观察6个月，在动物生物安全三级实验室内饲养和观察50周或更长时间。达到安乐死标准的实验动物将被安乐死，并进行尸检和细菌载量检测。0036采用本发明的方法和装置建立了MTB自然感染非人灵长类动物模型，该模型建立成功将是TB动物模型研究领域的突破性进展。由于通过空气中的MTB气溶胶感染非人灵长类动物和人类感染MTB完全相似，因此，无论是在MTB进入途径，机体的局部和全身免疫应答、免疫机理、发病机制方面，还是在临床表现方面，该模型较现有人工感染模型更有优势。此外，气管人工感染方式，感染菌株均为体外培养的菌株，这些培养基中扩增的菌株和在自然界中宿主体内菌。

27、株生长环境不同，因此其表型也有差异。本发明完全模拟自然界中感染菌株从一宿主体内转移到另一宿主体内的这一完整过程。建立结核自然感染空气传播非人灵长类感染模型将具有十分重要的临床意义，是研发和评估新型抗结核药物和疫苗的必不可少的组成部分。附图说明0037图1现有技术中负压单笼的送风、出风示意图；0038图2本发明设备的右视图；说明书CN104127444A5/10页80039图3本发明设备的左视图；0040图4本发明设备的后视图；0041图5本发明设备的右剖视图；0042图6本发明设备的送风、排风示意图；0043图7本发明设备的气流自循环系统示意图；0044其中1、排风阀；2、排风风机；3、顶置灯。

28、罩LED照明灯；4、高效过滤器；5、门；6、小门；7、支撑架；8、滤网及导流板；9、循环管道；10、排风管；11、导流风扇；12、送风风机；13、猴笼；14、PLC控制单元；15、排风口；16、送风阀；17、送风口；18、循环风机；19、气动阀门；20、壳体；21、压差表；22、后置灯罩LED照明灯。0045图8旧结核菌素皮肤试验结果；0046图9外周血PBMC体外结核菌素PPD刺激后产生IFNELISPOT实验结果；0047图10猴全血中结核特异性干扰素的分泌流式细胞技术检测结果；0048图11血清中C反应蛋白检测结果；0049图1250周的实验观察期中，实验动物的体重观察结果；0050图1。

29、3实验动物WNP4和WNP6在第44周和第46周出现死亡，其肺部各叶的组织块结核分枝杆菌载量；0051图14实验动物WNP4和WNP6肺部大体解剖图片；具体实施方式0052下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不能限制本发明的保护范围。0053参见附图2附图7，一种气流自循环组合式负压隔离器，所述隔离系统包括两个或多个由不锈钢外壳以及玻璃门完整密封拼接之后形成的外部壳体20，壳体内设置有猴笼13，猴笼分为上、下两层。在壳体上部及背部设置有上面猴笼和下面猴笼的顶置灯罩3和后置灯罩22。所述的壳体有送风通道和排风通道，送风通道位于壳体上方，送风通道依次设置。

30、有送风口17、送风阀16、送风风机12、管道9、安装在隔离系统相邻壳体之间的导流风扇11、负压隔离器右侧的滤网及导流板8；所述的排风通道设置有右侧背部排风高效过滤器4、与此相连的排风管10、壳体上方排风阀1、排风风机2、排风口15，排风口经过软管与实验室排风设备相连接，如图27所示。以及安装在壳体顶部用于切换自循环模式及补新风模式的气动阀门19。负压隔离器左侧安装有监测过滤器的压差表21、PLC控制单元14对自循环模式、补新风模式之间的切换进行控制，通过控制送、排风风量，最终达到压力梯度的控制要求。0054所述的气流自循环系统参见附图2附图7，首先通过PLC控制单元14打开气动阀门19，关闭送。

31、风阀16、气流通过滤网及导流板8，循环风机18、管道9、气动阀门19、送风风机12进入壳体20内，再通过导流风扇11，形成平流层，起到活塞效应，到达滤网及导流板8，实现气流自循环，参见图7。在此过程中，可按照需求送新风，通过PLC控制单元对送、排风进行控制，调节风量，此时关闭气动阀门19，打开送风阀16，新风通过送风口17、进入管道9，随后经送风风机12进入壳体内，通过导流风扇11，到达右侧背部高效过滤器4，经过排风管10、打开排风阀1、经排风风机2，通过排风口15排到实验室排风设备。在达到送新风说明书CN104127444A6/10页9要求的同时，保证壳体内的负压梯度的要求，最终达到污染空气。

32、不会泄露到壳体外。00551、结核菌的制备0056感染动物所用的菌种为人型结核分枝杆菌H37RV株，取1107CFU能引起感染小鼠2周左右发生半数死亡经预试验确定的结核分枝杆菌H37RV株菌种保藏斜面一支，用无菌接种环刮取斜面上的菌苔少许，接种于新鲜改良罗氏培养基斜面上，置37培养3周。使用无菌的培养环，刮取斜面上菌苔，准确称量后置于无菌研钵内研磨，按1020MG/ML加入无菌生理盐水，边加边磨，直至完全分散地呈均匀混浊的菌液。将该菌悬液用定量无菌吸管分装到15ML容量的冻存管内，每管1ML，放入做有标记的冻存盒内，放入80冰箱冻存，作为菌种保存管。0057将以上冻存菌液管的菌落进行平板培养计。

33、数，根据计数结果所得菌液浓度，按动物感染的实际需要的细菌个数CFU，用无菌生理盐水进行定量稀释至约10CFU/毫升即可作感染用菌液。00582、动物选择0059选择67岁，雌性，体重57KG的中国猕猴，排查分枝杆菌、志贺菌、沙门菌、猴逆转录D病毒、猴免疫缺陷病毒、猴嗜T淋巴细胞病毒I型、猴B病毒、粪类圆线虫、肺螨等病原物生物感染。00603、饲养观察0061感染后每日观察动物的精神状态、呼吸、饮食、咳嗽、排泄等表现，并进行记录评分，定期称量体重和体温，采集血液检测免疫学和生化指标。00624、旧结核菌素OT皮肤试验TST0063动物于感染后数周进行一次OT皮试。动物经肌注盐酸氯胺酮麻醉后，仰卧。

34、于操作台上，用75酒精小心消毒双眼睑皮肤酒精不得入眼后，一侧用1毫升注射器445号针头，在上眼睑部皮内注射01ML兽用结核菌素TUBERCULINMAMMALIAN，SYNBIOTICS，USA，另一侧注射同样量无菌生理盐水。注射后24、48、72小时观察结果。0064结果观察注射部位眼睑无反应；0065注射部位轻微擦伤或瘀伤；0066注射部位不同程度红斑而无肿胀；0067注射部位不同程度红斑并有轻微肿胀，或轻微肿胀而无红斑；0068注射部位明显红肿和眼睑下垂，且有不同程度红斑；0069注射部位有红肿和破溃，甚至眼睑闭合；0070盐水对照侧无反应，结核菌素侧出现及以上者，皮试判为阳性；0071。

35、5、特异性的细胞免疫功能检测0072本研究选择目前国际多数承认的ELISPOT法检测动物外周血单个核细胞PBMC经结核抗原刺激后产生IFN的水平，作为结核特异性细胞免疫功能指标。如动物感染了结核，且细胞免疫功能正常，其外周血PBMC体外再次受结核菌素PPD刺激，即能分泌IFN。如动物未受结核抗原感染，其外周血PBMC体外受PPD刺激，不能分泌IFN。因此，该试验可作为动物是否感染结核菌的重要参考指标。0073选用CPT采血管BDVACUTAINERTM采集实验猴外周全血67ML，1750G25分钟离心，吸取CPT采血管内分离胶上的白色细胞层，移至无菌15ML离心管内。用RPMI1640培说明书。

36、CN104127444A7/10页10养基洗2遍，重悬至1ML，计数后用于ELISPOT检测结核特异性T细胞的比例，按UCYTECHMONKEYIFNELISPOTKIT说明书进行。统计培养板PVDF膜上的斑点数目，除以加入孔内细胞的总数，计算阳性细胞的频率。ELISPOT实验所需刺激物见下表0074表1ELISPOT实验所需刺激物00750076于1周及感染后多个时间点，各组动物取静脉血用淋巴细胞分层液立即分离每个动物的PBMC进行ELISPOT试验。1表示在接种结核菌前一周。00776、流式细胞技术检测猴全血中结核特异性干扰素的分泌0078在肝素钠抗凝猴外周血1ML中，加入抗CD281G/。

37、ML和抗CD49D1G/ML单克隆抗体，同时加入PPD5G/ML进行刺激。在37，5CO2孵育6小时。然后加入BREFELDINAGOLGIPLUG,BD，继续孵育6小时，然后用BDFACS溶解液进行破红，再用CYTOX/CYTOPERM,BD打孔45分钟，最后用CD3，CD4，CD8和IFN抗体见下表进行染色，流式细胞仪分析。0079表2染色方案008000817、全自动生化仪检测血清中C反应蛋白CRP的含量0082选择日本和光制药C反应蛋白原装试剂盒，运用日立7080全自动生化分析仪采取多点定标，并用免疫透射比浊法原理对分离的血清标本进行检测。感染前及感染后每隔1周检测一次。00838、胸。

38、部X光检查0084于接种结核菌前一周及感染后每个月各时间点各组动物均进行胸部X光拍片检查。胸片用数字式X光机拍摄，拍摄于动物麻醉后进行。拍摄由有经验的专业技术人员按数字式X光机操作程序进行。每只动物拍摄前后位、右侧位或左侧位两张胸片。拍摄结束说明书CN104127444A108/10页11由放射科医生阅片并报告结果。00859、病理学检查0086安乐死实验动物到达实验终点或处于濒死状态时采用经静脉注射过量戊巴比妥钠行安乐死术，注射剂量为100MG/KG体重。动物经安乐死后，进行大体病理解剖，记录肺脏的大体病理改变。随机取肺组织用4的多聚甲醛固定，组织切片，HE染色和抗酸染色，用于组织病理学观察。

39、。008710、组织细菌载量检测0088在大体病理解剖过程中无菌手段随机获取肺部各叶以及脾脏的组织块。利用机械破碎方法对组织块进行匀浆，破碎细胞结构释放组织中的结核分枝杆菌。再利用PBS对匀浆液进行10倍梯度稀释，将各稀释度的匀浆液均匀涂布于7H11平板中，置于37摄氏度培养35周。当平板长出结核杆菌克隆后进行计数，并计算每克组织中结核杆菌含量。008911、MTB感染前后检测指标及实验安排表0090表3MTB感染后检测指标及实验安排表00910092【实施例1】纤维支气管镜感染中国猕猴009311麻醉00942只实验猴WNP1、WNP2在麻醉前禁食812小时，麻醉前15分钟肌肉注射阿托品00。

40、4MG/KG体重，肌肉注射盐酸氯胺酮10MG/KG体重给予麻醉，待动物肌肉松弛，呼吸、心律平稳后，将动物放置于操作台上。009512动物感染0096动物麻醉后，仰卧于操作台上，用开口器打开口腔，喉镜暴露会厌，1丁卡因对会厌表面麻醉。按照纤维支气管镜OLYMPUSBFTYPEXP60，外径28MM使用说明进行操作，用喷雾器将1利多卡因从动物两侧鼻孔喷入，纤支镜经动物鼻道缓慢插入，到达会厌部时，通过纤支管镜的生物活检通道缓慢注入1ML1利多卡因，随后将镜子推进主支气管，通过监视器确认后，注入1ML1利多卡因，将装有菌液的注射器插到活检通道入口缓慢滴入2ML约10CFU/毫升菌液，然后用1ML无菌生。

41、理盐水缓慢冲洗活检通道以保证菌液完全到达肺部。冲洗完成后再将支气管镜缓慢地从动物气管内取出。感染结束后，使动物保持坐姿直至麻醉苏醒后放回隔离室内继续观察。009713饲养观察，判定实验猴人工感染上结核杆菌0098感染后每日观察动物的精神状态、呼吸、饮食、咳嗽、排泄等表现，并进行记录评说明书CN104127444A119/10页12分，按照表3的安排定期称量体重和体温，采集血液检测血液学和生化指标。人工感染实验猴和健康猴一起放到气流自循环组合式负压隔离器内后，按表3安排各项检测。实验猴WNP1,WPN2均为人工感染，在人工感染后第4周，两只实验动物ELISPOT检测PPD特异性IFN反应均为阳性。

42、如图9，该结果证实两只实验动物均成功感染上结核杆菌。其中WNP2号猴在人为感染后第16周出现咳嗽等结核临床症状。0099【实施例2】结核分枝杆菌通过自然途径气溶胶感染中国猕猴0100人为感染纤支镜直接将MTB株接种到肺内的WPN1、WPN2猕猴，在人工感染结束后的当天，将它们放置在气流自循环组合式负压隔离器内见图7，然后将4只健康猴WPN3、WPN4、WPN5、WPN6也放入组合式负压隔离器中，启动气流自循环系统，使健康猴能反复接触来自感染猴笼的空气，可按照需求送新风，通过PLC控制单元对送、排风进行控制，调节风量。接触后，每天观察食欲、咳嗽等临床症状；按照表3安排各项检测。0101【实施例3。

43、】确定通过空气传播建立了MTB自然感染猕猴模型0102结核自然感染猕猴与人工感染结核猕猴共同饲养并按照实验计划如表3所示定期观察结核相关指标，如图8图12所示。在50周的实验观察期中，实验动物的体重有显著变化，感染结核后，大部分实验动物会出现不同程度的体重降低，如图12所示；结果表明自然感染猕猴实验中结核相关指标陆续转为阳性，证明这些实验动物陆续被结核分枝杆菌感染成功，详情如下表4所示0103表4结核自然感染猕猴与人工感染结核猕猴结核相关指标结果01040105N/A直至实验第50周未出现异常0106实验动物WNP4和WNP6在实验第44周和第46周时达到安乐死标准，我们对其安乐死处理后进行尸。

44、体解剖。如图14所示WNP4和WNP6实验动物肺部均有肉眼可见的结核肉芽肿病变。我们对其进行细菌载量计算，结果如图13所示，所检肺部各叶的组织块都可检测到结核分枝杆菌，细菌载量在1045107CFU/G以上。0107【实施例4】自然感染和人工感染在针对TB的免疫激活和影像学病理改变的异同0108与人工感染结核分枝杆菌的实验动物一样，自然感染的实验动物在感染后也会出现结核典型的免疫反应应答见图9图11。人工感染结核分枝杆菌的实验动物在感染后2个月便会出现影像学病理改变，但自然感染实验动物影像学病理改变明显延迟，这说明自然感染实验动物发病时间明显延迟。同时和人工感染实验动物原发病灶主要集中在右下肺。

45、说明书CN104127444A1210/10页13不同，自然感染实验动物原发病灶可存在多个不同位点，且以肺的中上部为主。自然感染实验动物原发病灶位置更接近于人类结核病。详情见下表0109表5人工感染和自然感染结核分枝杆菌的猕猴免疫应答和影像学病理改变比较0110说明书CN104127444A131/7页14图1图2说明书附图CN104127444A142/7页15图3图4说明书附图CN104127444A153/7页16图5图6图7说明书附图CN104127444A164/7页17图8图9说明书附图CN104127444A175/7页18图10图11说明书附图CN104127444A186/7页19图12图13说明书附图CN104127444A197/7页20图14说明书附图CN104127444A20。