《一种芦丁的新用途.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种芦丁的新用途.pdf（10页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201811090252.2 (22)申请日 2018.09.18 (71)申请人 四川大学 地址 610000 四川省成都市一环路南一段 24号 (72)发明人 王凌 蒋学华 余璐 (74)专利代理机构 成都为知盾专利代理事务所 (特殊普通合伙) 51267 代理人 杨宜付 (51)Int.Cl. A61K 31/7048(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 一种芦丁的新用途 (57)摘要 本发明公开了芦丁的新用途， 芦丁作为 PRMT1。
2、-PXR-P-gp通路抑制剂用于制备治疗与 PRMT1-PXR-P-gp通路调控有关的疾病的药物或 食品。 芦丁在细胞水平上能通过抑制PRMT1-PXR- P-gp通路， 明显的抑制人肝癌细胞系HepG2细胞 中P-gp的表达， 从而逆转由于长期化疗所导致的 P-gp表达增加而产生的肿瘤多药耐药的现象， 增 加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性， 提高肿瘤药物 的治疗效果。 权利要求书1页 说明书5页 附图3页 CN 109223814 A 2019.01.18 CN 109223814 A 1.一种芦丁的新用途， 其特征在于， 芦丁作为PRMT1-PXR-P-gp通路抑制剂用于制备治 疗与PRMT1。
3、-PXR-P-gp通路调控有关的疾病的药物或食品。 2.根据权利要求1所述的新用途， 其特征在于， 所述疾病是癌症。 3.权利要求1或2中任一项所述的新用途， 其特征在于， 所述疾病是肝癌。 4.根据权利要求3所述的新用途， 其特征在于， 所述芦丁的血药浓度为45-55 M。 5.根据权利要求3所述的新用途， 其特征在于， 所述芦丁的血药浓度为50 M。 6.权利要求1或2中任一项所述的新用途， 其特征在于， 所述乳腺癌。 7.权利要求1或2中任一项所述的新用途， 其特征在于， 所述卵巢癌。 8.权利要求1或2中任一项所述的新用途， 其特征在于， 所述结肠癌。 权 利 要 求 书 1/1 页 。
4、2 CN 109223814 A 2 一种芦丁的新用途 技术领域 0001 本发明属于医药领域， 涉及芦丁的新用途， 具体涉及卢丁在制备用于治疗与 PRMT1-PXR-P-gp通路调控有关的疾病的药物或食品中的用途。 背景技术 0002 肿瘤多药耐药(Multidrug Resistance,MDR)是指肿瘤细胞长时间接触某一化疗 药物， 对这种化疗药物产生耐药的同时对化学结构、 细胞靶点和作用机制迥然不同的其他 抗肿瘤药物均出现耐药的现象。 肿瘤MDR是乳腺癌、 卵巢癌、 肺癌、 肝癌、 胃癌、 肠癌、 子宫内 膜癌、 各型白血病等许多临床常见恶性肿瘤化疗失败的主要原因。 0003 MDR的。
5、发生机制多样且复杂， 其中MDR-1基因的过度活化及其下游蛋白P-gp的异常 高表达是肿瘤细胞产生多药耐药的主要原因。 化疗药物进入肿瘤细胞后， P-gp结合药物分 子， 通过水解ATP获得能量， 迅速将化疗药物泵出细胞外， 降低细胞毒药物在细胞内的积累， 从而产生耐药。 此外， P-gp的底物特异性差， 大量结构、 功能、 作用靶点、 作用机制并不相关 的抗肿瘤药物均可被其转运， 这种特性使其具备产生交叉耐药或多药耐药的能力和基础。 0004 现有技术中已知有若干可抑制P-gp过表达的化合物， 然而， 它们却具有种种不足。 0005 例如第一代P-gp抑制剂是以钙通道阻滞剂维拉帕米为代表， 。
6、这些药物本身即为P- gp底物， 它们通过与目标P-gp底物竞争P-gp的底物结合位点而发挥P-gp抑制功能。 由于其 机制为竞争性抑制， 亲和力较低， 因此需要较大的应用剂量， 而过大的剂量往往带来临床不 能耐受的毒副作用。 0006 而第二代抑制剂的P-gp亲和力显著增强、 细胞毒性降低， 如PSC833的P-gp抑制效 果可达环孢菌素A的520倍。 然而， 这些化合物最大的缺陷为： 同时抑制肝脏CYP450酶系的 活性。 因此， 第二代抑制剂也未能应用于临床。 0007 从第三代直到目前的第四代P-gp抑制剂， 逐渐转向于植物化合物、 饮食成分中的 天然产物及其衍生物。 目前有报道的具有。
7、P-gp抑制功能的天然产物类型有很多。 天然产物 结构多样、 毒副作用小， 且具有良好的耐受性， 这些特点赋予了第四代P-gp抑制剂较好的临 床应用前景。 然而， 其临床MDR逆转效果仍不理想。 可能是由于这些抑制剂均直接作用于P- gp蛋白， 其作用时间短暂， 在体内与抗肿瘤药物不能起到很好的协同作用 0008 总结四代P-gp抑制剂研发失败的教训， 虽然肿瘤MDR主要由P-gp引起， 但直接作用 于P-gp蛋白并没有根本上抑制P-gp的过表达， 故未能有效的克服肿瘤MDR。 因此， 研究者逐 渐将关注点转移至肿瘤细胞中P-gp的基因表达调控， 从基因水平阻断或下调P-gp蛋白的过 表达， 。
8、有望能克服现有P-gp抑制剂的不足， 从而有效的实现肿瘤多药耐药的逆转。 发明内容 0009 鉴于此， 本发明的目的在于提供更有效的PRMT1抑制剂， 从而可制备用于减少与 PRMT1-PXR-P-gp通路调控有关的、 由于P-gp过表达所导致的肿瘤多药耐药有关的疾病的药 物或食品、 保健品。 本发明提供一种芦丁的新用途， 芦丁作为PRMT1-PXR-P-gp抑制剂用于制 说 明 书 1/5 页 3 CN 109223814 A 3 备治疗与PRMT1-PXR-P-gp通路调控有关的疾病的药物或食品。 芦丁在细胞水平上能通过抑 制PRMT1-PXR-P-gp通路， 明显的抑制人肝癌细胞系Hep。
9、G2细胞中P-gp的表达， 从而逆转由于 长期化疗所导致的P-gp表达增加而产生的肿瘤多药耐药的现象， 增加肿瘤细胞对化疗药物 的敏感性， 提高肿瘤药物的治疗效果。 0010 根据本发明芦丁的新用途的一个具体实施方式， 所述疾病是癌症。 0011 根据本发明芦丁的新用途的一个具体实施方式， 所述疾病是肝癌。 0012 根据本发明芦丁的新用途的一个具体实施方式， 所述芦丁的血药浓度为45-55 M。 0013 根据本发明芦丁的新用途的一个具体实施方式， 所述芦丁的血药浓度为50 M。 0014 根据本发明芦丁的新用途的一个具体实施方式， 所述乳腺癌。 0015 根据本发明芦丁的新用途的一个具体实。
10、施方式， 所述卵巢癌。 0016 根据本发明芦丁的新用途的一个具体实施方式， 所述结肠癌。 0017 发明人经过大量研究， 试验和筛选了多种化合物， 意外地发现： 芦丁可作为有效的 PRMT1抑制剂。 0018 芦丁的结构式如下： 0019 0020 中文名称： 芦丁 0021 英文名称： Rutinum 0022 分子式： C27H30O16 0023 分子量： 610.52 0024 CAS号： 153-18-4。 0025 本发明提供了芦丁在制备用于减少与PRMT1-PXR-P-gp通路调控有关的， 由于P-gp 过表达所导致的肿瘤多药耐药的药物中的用途。 在本发明的一个优选的实施方案中。
11、， 所述 与PRMT1-PXR-P-gp通路调控有关的疾病为化疗过程中所导致的肿瘤多药耐药， 特别优选的 疾病是肝癌。 0026 现有技术中已知： 以下疾病的多药耐药与P-gp的过表达相关： 肝癌、 乳腺癌、 卵巢 癌、 以及结肠癌等。 0027 孕烷X受体(Pregnane X Receptor,PXR)隶属核受体超家族NR1I亚家族， 是一种与 机体防御机制密切相关的转录因子， 主要调控代谢酶CYP3A4和主要的外排转运蛋白如P- gp、 BCRP、 MRP2等的表达， 从而保护机体免受外来物质的损害。 在众多P-gp过表达的肿瘤组 织中， 如乳腺癌、 卵巢癌、 子宫内膜癌、 结肠癌及肝癌。
12、等， PXR均呈现高表达状态， 即PXR的量 与P-gp表达量呈正相关。 体外研究发现， 采用传统化疗药物小剂量间歇诱导或大剂量冲击 诱导都可以使原本敏感的癌细胞逐渐高表达P-gp， 转变为耐药细胞。 而药理性抑制或基因 说 明 书 2/5 页 4 CN 109223814 A 4 敲除PXR都能有效的抑制这种诱导作用， 这提示PXR在癌细胞获得性高表达P-gp的调控中起 了非常关键的作用。 0028 蛋白精氨酸甲基转移酶(Proteinarginine methyltransferases,PRMTs)是表观 遗传学调控中常见的一类酶， 负责蛋白质上精氨酸残基的甲基化。 最近研究表明， PR。
13、MT1作 为组蛋白H4R3特异性的甲基转移酶， 参与多种核受体介导的转录激活， 其中也包括PXR的转 录调控。 0029 本发明的化合物可以配制成各种适合的药物制剂形式。 0030 与现有技术相比， 本发明的技术效果如下： 0031 芦丁在细胞水平上能通过PRMT1-PXR-P-gp通路， 明显的抑制人肝癌细胞系HepG2 细胞中P-gp的表达， 从而逆转由于长期化疗所导致的P-gp表达增加而产生的肿瘤多药耐药 的现象， 增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性， 提高肿瘤药物的治疗效果。 附图说明 0032 图1显示芦丁在不同浓度下对HepG2肝癌细胞的生长抑制作用。 0033 图2表示芦丁和阳性对照。
14、药物对HepG2细胞中PRMT1、 PXR、 P-gp的mRNA水平的影响。 0034 图3表示芦丁以及阳性对照药物对HepG2细胞PRMT1、 PXR、 P-gp的mRNA水平的影响。 0035 图4表示蛋白免疫共沉淀技术检测芦丁与AMI-1对HepG2细胞中PRMT1与PXR蛋白相 互作用的影响。 具体实施方式 0036 下面结合具体实验操作及数据， 进一步说明本发明的技术方案。 0037 以下通过试验说明芦丁对PRMT1-PXR-P-gp通路的调控作用。 0038 实施例1 0039 细胞实验 0040 发明人从细胞水平上证明了芦丁是PRMT1的抑制剂， 以人肝癌细胞系HepG2细胞为 。
15、例， 此化合物可降低HepG2细胞中的PRMT1与P-gp的mRNA水平。 免疫沉淀实验(Co-IP:Co- Immunoprecipitation,免疫共沉淀技术)是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于 研究蛋白质相互作用的经典方法。 是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效 方法。 当细胞在非变性条件下被裂解时， 完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作 用被保留了下来。 当用预先固化在磁珠上的蛋白质A的抗体免疫沉淀A蛋白， 那么与A蛋白在 体内结合的蛋白质B也能一起沉淀下来。 再通过蛋白变性分离， 对B蛋白进行检测， 进而证明 两者间的相互作用。 这种方法得到的目的蛋白是。
16、在细胞内与兴趣蛋白天然结合的， 符合体 内实际情况， 得到的结果可信度高。 这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合； 也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。 结果显示： PRMT1与PXR存在明显的相互作 用， 而应用化合物芦丁(Rutin)后(与阳性药物AMI-1结果相同)， P-gp表达降低的同时， PRMT1与PXR之间的相互作用被破坏， 这提示芦丁可能是通过抑制PRMT1与PXR发生相互作 用， 影响PXR对MDR1基因的转录活性， 最终介导P-gp表达下降， 起到逆转肿瘤多药耐药的现 象。 0041 具体实验过程如下： 0042 对肝癌细胞生长的抑制作用： 0043 MT。
17、T比色法常用于检测细胞的存活和生长， 其原理为:外源性加入MTT后， 活细胞线 说 明 书 3/5 页 5 CN 109223814 A 5 粒体中的琥珀酸脱氢酶能使其还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒， 而死细胞无此功能。 随 后， 用二甲基亚砜(DMSO)溶解细胞中的甲瓒， 用酶标仪在490nm波长处测定其光吸收值(OD 值)， 测得的吸光度值与活细胞数量成正比。 故可用作活细胞数的定量检测。 一般若细胞活 力90， 则认为该浓度药物对细胞生长具有抑制作用。 结果如图1所示， 经过48h处理后， 经 050 M的处理的HepG2肝癌细胞的细胞活力均在90以上， 说明该浓度范围内的芦丁对 Hep。
18、G2肝癌细胞无明显的生长抑制作用。 0044 对肝癌细胞中PRMT1、 PXR、 P-gp mRNA的表达的作用： 0045 采用研究采用了普通逆转录PCR(Reverse Transcription-PCR,RT-PCR)与实时荧 光定量PCR(Real-time Fluorescent Quantitative PCR， Real-time PCR)相结合的方法检 测MDR1、 PXR及PRMT1基因的mRNA表达水平。 RT-PCR的原理为提取组织或细胞中的总RNA， 以 其中的mRNA作为模板， 采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA； 再以cDNA为 模板， 利。
19、用针对目的基因的特异性引物进行PCR扩增以获得目的基因片段； 最后采用琼脂糖 凝胶电泳分离、 鉴定目的基因条带， 并利用灰度扫描软件将目的基因条带的亮度量化， 因 此， 被认为是半定量分析。 Real-time PCR是一种在DNA扩增反应中， 以荧光化学物质测每次 聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。 通过内参或者外参法对待测样品中的特定 DNA序列进行定量分析的方法。 Real-time PCR是在PCR扩增过程中， 通过荧光信号， 对PCR进 程进行实时检测。 由于在PCR扩增的指数时期， 模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性 关系， 所以成为定量的依据。 Real-tim。
20、e PCR与半定量PCR相比具有操作简便、 灵敏度高等优 点， 其缺点为容易与非特异性双链DNA结合， 产生假阳性。 逆转录PCR与Real-time PCR结合 可充分利用两者优点， 使检测结果更为准确、 可靠。 图2和图3显示芦丁对HepG2肝癌细胞的 生长抑制作用结果。 图2表示不同浓度的芦丁(Rutin)和阳性对照药物(Arginine Methyltransferase Inhibitor 1精氨酸甲基酶抑制剂1,AMI-1)作用于HepG2细胞24h后， 对HepG2细胞中PRMT1、 PXR、 P-gp的mRNA水平的影响(实验数据均以平均值标准差(Mean S.D.)表示， *。
21、P0.05， *P0.01， n3)。 图3表示50 M芦丁(Rutin)处理12h、 24h和48h后以及 4.5 g/mL阳性对照药物(精氨酸甲基酶抑制剂1,AMI-1)处理48小时后， 对HepG2细胞PRMT1、 PXR、 P-gp的mRNA水平的影响(实验数据均以平均值标准差(MeanS.D.)表示， *P 0.05， *P0.01， n3)。 实验结果如图2所示： 25 M、 50 M芦丁(Rutin)和4.5 g/mL的阳性对 照药物AMI-1(精氨酸甲基酶抑制剂1)均能显著抑制PRMT1和P-gp的mRNA水平(P0.05)； 并 且如图3所示， 50 M芦丁处理24h和48h。
22、均能显著下调PRMT1和P-gp的mRNA水平(P0.05)。 0046 芦丁抑制肝癌细胞系HepG2细胞上P-gp的表达的机制是： 通过阻断PRMT1与PXR 之间的相互作用， 从而减少P-gp的表达： 0047 利用蛋白免疫共沉淀技术(Co-Immunoprecipitation， Co-IP)研究了PRMT1与PXR 蛋白质之间的相互作用， 结果如图4所示： 所有组Input对照均有条带， 而同源IgG对照均无 条带， 说明结果特异性较好。 P-gp高表达的HepG2细胞中， PRMT1与PXR存在明显的相互作用， 而应用芦丁(Rutin)或阳性对照药物AMI-1后， P-gp表达降低的。
23、同时， PRMT1与PXR之间的相 互作用被破坏， 这提示芦丁(Rutin)和AMI-1可能是通过抑制PRMT1与PXR发生相互作用， 影 响PXR对MDR1基因的转录活性， 最终介导P-gp表达的调控。 图4表示了蛋白免疫共沉淀技术 检测芦丁(50 M)与AMI-1(4.5 g/mL)处理24h对HepG2细胞中PRMT1与PXR蛋白相互作用的影 响(实验数据均以平均值标准差(MeanS.D.)表示， *P0.05， *P0.01， n3)。 结果表明 说 明 书 4/5 页 6 CN 109223814 A 6 芦丁抑制HepG2细胞上P-gp的表达的机制是： 通过阻断PRMT1与PXR之。
24、间的相互作用， 从而减 少P-gp的表达。 0048 总之， 根据上述实验结果可知， 芦丁在细胞水平上能通过抑制PRMT1-PXR-P-gp通 路， 明显的抑制人肝癌细胞系HepG2细胞中P-gp的表达， 从而逆转由于长期化疗所导致的P- gp表达增加而产生的肿瘤多药耐药的现象， 增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性， 提高肿瘤 药物的治疗效果。 说 明 书 5/5 页 7 CN 109223814 A 7 图1 图2 说 明 书 附 图 1/3 页 8 CN 109223814 A 8 图3 说 明 书 附 图 2/3 页 9 CN 109223814 A 9 图4 说 明 书 附 图 3/3 页 10 CN 109223814 A 10 。