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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201811164698.5 (22)申请日 2018.10.06 (71)申请人 淮安安莱生物科技有限公司 地址 223001 江苏省淮安市清江浦区韩侯 大道191号112室 (72)发明人 郑嘉荣 区伟平 (51)Int.Cl. A61K 31/336(2006.01) A61K 31/357(2006.01) A61K 31/35(2006.01) A61K 31/352(2006.01) A61P 39/06(2006.01) (54)发明名称 一种玫瑰酸D在抗造血干细胞。
2、衰老方面的应 用 (57)摘要 本发明公开了一种玫瑰酸D在抗造血干细胞 衰老方面的应用。 造血干细胞经历自我更新、 分 化、 衰老与死亡等复杂过程而维持机体终生血细 胞产生； 机体在衰老过程中造血系统的基本成分 虽得以维持， 但造血干细胞的功能和数量却逐渐 降低， 这导致机体造血功能降低、 免疫功能衰退。 本发明发现， 环氧胡萝 卜烯醛A、 环氧胡萝 卜烯醛B、 玫瑰酸A或玫瑰酸D可以通过抑制p16基因转录抵 抗造血干细胞衰老， 环氧胡萝 卜烯醛A、 环氧胡萝 卜 烯醛B、 玫瑰酸A或玫瑰酸D可以制成p16基因转录 抑制剂和抗造血干细胞衰老的药物。 权利要求书1页 说明书4页 附图2页 CN 。
3、109223757 A 2019.01.18 CN 109223757 A 1.玫瑰酸D用作p16基因转录抑制剂的用途。 2.玫瑰酸D用于制备抗造血干细胞衰老的药物的用途。 3.一种用于抗造血干细胞衰老的药物制剂， 其特征在于： 以玫瑰酸D为活性成分， 制成 药学上可以接受的剂型。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 109223757 A 2 一种玫瑰酸D在抗造血干细胞衰老方面的应用 技术领域 0001 本发明属于生物医药领域， 涉及造血干细胞抗衰老， 具体涉及一种玫瑰酸D在抗造 血干细胞衰老方面的应用。 背景技术 0002 造血干细胞经历自我更新、 分化、 衰老与死亡等复杂过程而维持。
4、机体终生血细胞 产生。 机体在衰老过程中造血系统的基本成分虽得以维持， 但造血干细胞的功能和数量却 逐渐降低， 这导致机体造血功能降低、 免疫功能衰退。 0003 目前认为衰老是一种与基因相关的疾病， 抑癌基因p16是调控细胞衰老的关键基 因。 研究已经证实， 细胞衰老时， p16基因的转录及蛋白质表达水平增高， 抑制细胞有丝分 裂， 刺激发生反应而产生RB蛋白的磷酸化， 从而维持了衰老细胞不可逆的生长停滞状态。 抑 制p16基因的转录及蛋白表达可以抑制细胞衰老。 0004 环氧胡萝 卜烯醛A、 环氧胡萝 卜烯醛B、 玫瑰酸A、 玫瑰酸B和玫瑰酸D为重瓣玫瑰花中 的成分， 其化学结构如图1所示。
5、。 目前尚未见这些化合物抗造血干细胞衰老的报道。 发明内容 0005 本发明的目的在于提供一种玫瑰酸D在抗造血干细胞衰老方面的应用。 0006 本发明上述目的通过如下技术方案实现： 0007 玫瑰酸D用作p16基因转录抑制剂的用途。 0008 玫瑰酸D用于制备抗造血干细胞衰老的药物的用途。 0009 一种用于抗造血干细胞衰老的药物制剂， 以玫瑰酸D为活性成分， 制成药学上可以 接受的剂型。 0010 有益效果： 0011 本发明发现， 环氧胡萝 卜烯醛A、 环氧胡萝 卜烯醛B、 玫瑰酸A或玫瑰酸D可以通过抑制 p16基因转录抵抗造血干细胞衰老， 环氧胡萝 卜烯醛A、 环氧胡萝 卜烯醛B、 玫瑰。
6、酸A或玫瑰酸D 可以制成p16基因转录抑制剂和抗造血干细胞衰老的药物。 附图说明 0012 图1为各化合物结构式； 0013 图2为各组造血干细胞中p16mRNA表达水平； 0014 图3为各组造血干细胞SA- -Gal染色结果； 0015 图4为各组造血干细胞混合集落培养结果。 具体实施方式 0016 下面结合实施例具体介绍本发明实质性内容， 但并不以此限定本发明的保护范 围。 说 明 书 1/4 页 3 CN 109223757 A 3 0017 一、 实验材料 0018 健康清洁级C57BL/6J小鼠， 雌雄各半， 68周龄， 体重1820g， 由中国药科大学动 物中心提供。 环氧胡萝 。
7、卜烯醛A、 环氧胡萝 卜烯醛B、 玫瑰酸A、 玫瑰酸B和玫瑰酸D自制， 纯度 98， 干燥保存。 Anti-Sca-1MicroBead Kit购自Miltenyi公司。 SA- -Gal Staining Kit购 自Cell Signaling公司。 甲基纤维素培养基MethoCult GF M3434购自Stem Cell公司。 0019 二、 实验方法 0020 1、 造血干细胞衰老模型制备及分组干预 0021 C57BL/6J小鼠随机分为对照组、 模型组和给药组(包括环氧胡萝 卜烯醛A、 环氧胡萝 卜烯醛B、 玫瑰酸A、 玫瑰酸B和玫瑰酸D给药组)， 每组24只。 模型组和给药组小鼠。
8、采用X线 3.0Gy全身均匀照射(照射能量6MeV， 照射源距动物的高度为100cm， 照射面积为25cm 25cm， 每次照射1min)每10天1次， 共8次。 给药组于照射当日分别灌胃给予环氧胡萝 卜烯醛A、 环氧胡萝 卜烯醛B、 玫瑰酸A、 玫瑰酸B或玫瑰酸D 50mg/kg， 对照组和模型组灌胃给予等容量 0.5CMC-Na， 隔天1次， 共40次。 末次照射后第10天处死。 0022 2、 造血干细胞分离与纯化 0023 无菌条件下取出小鼠股骨及胫骨， 分离骨髓单个核细胞(MNCs)。 采用抗Sca-1+免 疫磁珠分选干细胞。 取(25)107个MNCs加入90 L Buffer和1。
9、0 LAnti-Sca-1-FITC抗体， 4孵育15min， 离心弃上清， 加入80 L Buffer和20 LAnti-FITC MicroBeads， 4孵育 25min， 离心弃上清， 0.5mLBuffer重悬细胞， 加入磁性分离柱内， 分选柱用Buffer洗涤3次， 加入0.5mLBuffer收集Sca-1+细胞， 即分离纯化得到造血干细胞。 用流式细胞仪检测Sca-1+ 细胞比例即为造血干细胞的纯度。 0024 3、 RT-PCR检测p16mRNA表达 0025 采用Trizol方法提取各组造血干细胞的总RNA， 检测完整性。 取1 g总RNA， 用AMV逆 转录酶进行逆转录， 。
10、逆转录产物PCR扩增， 以GAPDH为内参， 检测p16mRNA表达。 引物序列如 下。 PCR反应体系： 反转录产物1 L、 Taq酶(5u/ L)0.45 L、 dNTPs(10mmo1/L)1 L、 含15mmol/L Mg2+缓冲液5 L， GAPDH的上、 下游引物各1 L， p16上、 下游引物各1 L， 用灭菌水补充至50 L。 PCR反应条件为： 93， 30s； 94， 3min； 64， 30s； 71， 1min； 35个循环， 71， 7min。 以p16 灰度值/GAPDH灰度值之比表示p16mRNA的相对值。 0026 p16mRNA上游引物： 5 -CCATGTC。
11、CAAAAGTGGTGTAAT-3 0027 p16mRNA下游引物： 5 -ATGGATGCATTGAGTGAAGTA-3 0028 GAPDH上游引物： 5 -GACGCCTATCGGTTAGTC-3 0029 GAPDH下游引物： 5 -GAACTGTGCGTCTCTGTC-3 0030 4、 造血干细胞衰老指标检测 0031 SA- -Gal染色： 收集各组1105个造血干细胞， 加Fixative工作液1mL充分混匀， 固定10min； PBS洗涤2次， 加入含SolutionA， Solution B， Staining Solution三者的工作液 1mL混匀， 37、 无CO2。
12、条件下孵育16h， 甘油封片镜检， 以随机计数的400个细胞中阳性细胞 的个数计算阳性细胞率。 0032 混合集落培养： 收集各组1104个造血干细胞， 离心弃上清， 加甲基纤维素半固体 培养基1mL混匀， 接种于96孔板， 在37、 5CO2及饱和湿度培养箱孵育1012d， 依接种造 血干细胞数量与形成混合集落形成单位(CFU-Mix)的数量评价造血干细胞的多向分化能 说 明 书 2/4 页 4 CN 109223757 A 4 力。 0033 5、 统计学分析 0034 采用SPSS 19.0统计学软件， 实验重复3次， 数据资料用均值标准差表示， 样本均 数比较采用组间t检验。 P0.0。
13、5为差异有显著性意义。 0035 三、 实验结果 0036 1、 造血干细胞纯度检测 0037 分离纯化后Sca-1+细胞纯度达(90.557.24)， 提示分选的Sca-1+HSCs纯度较 高。 0038 2、 各组造血干细胞中p16mRNA表达水平 0039 结果如表1和图2所示， 与对照组相比， 模型组造血干细胞中p16mRNA表达水平显著 升高， 说明p16与造血干细胞衰老有关； 与模型组相比， 环氧胡萝 卜烯醛A、 环氧胡萝 卜烯醛B、 玫瑰酸A和玫瑰酸D给药组造血干细胞中p16mRNA表达水平显著降低， 说明环氧胡萝 卜烯醛A、 环氧胡萝 卜烯醛B、 玫瑰酸A和玫瑰酸D通过抑制p1。
14、6转录抑制了造血干细胞的衰老。 玫瑰酸B 对p16转录水平无明显影响。 0040 表1各组造血干细胞中p16mRNA表达水平 0041 0042 3、 各组造血干细胞SA- -Gal染色结果 0043 各组造血干细胞SA- -Gal染色阳性百分比如表2和图3所示， 与对照组相比， 模型 组SA- -Gal染色阳性百分比显著升高； 与模型组相比， 环氧胡萝 卜烯醛A、 环氧胡萝 卜烯醛B、 玫瑰酸A和玫瑰酸D给药组SA- -Gal染色阳性百分比显著降低； 玫瑰酸B给药组SA- -Gal染 色阳性百分比与模型组比较无显著差异。 0044 表2各组造血干细胞SA- -Gal染色结果 说 明 书 3/。
15、4 页 5 CN 109223757 A 5 0045 0046 4、 各组造血干细胞混合集落培养结果 0047 各组造血干细胞CFU-Mix如表3和图4所示， 与对照组相比， 模型组CFU-Mix显著降 低； 与模型组相比， 环氧胡萝 卜烯醛A、 环氧胡萝 卜烯醛B、 玫瑰酸A和玫瑰酸D给药组CFU-Mix显 著升高； 玫瑰酸B给药组CFU-Mix与模型组比较无显著差异。 0048 表3各组造血干细胞混合集落培养结果 0049 0050 上述结果表明， 环氧胡萝 卜烯醛A、 环氧胡萝 卜烯醛B、 玫瑰酸A或玫瑰酸D可以通过抑 制p16基因转录抵抗造血干细胞衰老， 环氧胡萝 卜烯醛A、 环氧胡萝 卜烯醛B、 玫瑰酸A或玫瑰酸 D可以制成p16基因转录抑制剂和抗造血干细胞衰老的药物。 说 明 书 4/4 页 6 CN 109223757 A 6 图1 图2 说 明 书 附 图 1/2 页 7 CN 109223757 A 7 图3 图4 说 明 书 附 图 2/2 页 8 CN 109223757 A 8 。