技术领域
本发明涉及一种携载阿霉素的壳聚糖纳米级超声造影剂及其制备方法与应用，属于超声分子影像学技术领域。
背景技术
随着超声分子成像技术和生物纳米技术的迅猛发展，纳米级超声造影剂发展迅速。纳米级超声造影剂是分子影像学领域近年来的研究热点之一，也是靶向给药系统(Targeted drug delivery system,TDDS)的重要研究方向之一，其可以有效克服传统肿瘤药物治疗靶向性差、全身毒副作用大等缺点。与传统微米级超声造影剂(血池显像剂)不同，纳米级超声造影剂具有很强的穿透力，能穿过肿瘤组织血管壁间隙，其开发和应用还有利于进一步发展靶向性、高效性、小型化且具有辅助治疗作用的新型超声造影剂。纳米级超声造影剂是超声分子影像学发展的重要方向，也是肿瘤靶向性、可视化及精准治疗的新方向。
壳膜材料是决定超声造影剂性能的关键要素。目前，多种材料被用于超声造影剂的制备，包括：脂质、高分子聚合体、表面活性剂等，但均存在一定的缺点。脂质超声造影剂稳定性良好，成像效果好，但价格较为昂贵并且对肾脏和肝脏都有潜在的毒性，存在安全性问题；高分子聚合体如乳酸/羟基乙酸共聚物(PLGA)等可制备出较为稳定的超声造影剂，延长诊断时间，但由于造影剂外壳较硬，弹性较差，成像较差，需要较高的超声输出频率，可能会对正常组织产生非治疗性损失；表面活性剂超声造影剂成像好，但稳定性差，不易被修饰。壳聚糖材料无毒性、无刺激性，不仅具有良好的生物相容性及生物可降解性，还具有独特的生理和药理活性，最重要的是它含有丰富的自由氨基和羟基等活性基团，具有良好的修饰性，是一种理想的超声造影剂壳膜材料。中国专利文献CN106139174A提供了一种包裹液态氟碳的基于壳聚糖衍生物纳米级超声造影剂的制备方法，是通过酰化反应对羧甲基壳聚糖进行改性，合成具有两亲性的正己酰羧甲基壳聚糖，在此基础上加入液态氟碳，采用超声乳化方法制得由液态氟碳内核和壳聚糖衍生物外壳构成的纳米级超声造影剂。该方法所用的高分子材料安全无毒，且造影剂制备工艺简便，操作条件温和。但是该方法制备的纳米级超声造影剂为纳米液滴状态，在实际应用时尚需一定的外界刺激使之发生液气相变，而且没有对其靶向性及载药特性作进一步研究及评价。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种携载阿霉素的壳聚糖纳米级超声造影剂及其制备方法，以壳聚糖为壳膜材料制备纳米级超声造影剂，该造影剂具有较强的增强显像能力，较高的药物包封率及载药量，生物安全性高。
本发明还提供了上述携载阿霉素的壳聚糖纳米级超声造影剂在治疗肿瘤及制备抗肿瘤药物中的应用。
术语说明：
阿霉素：Doxorubicin(DOX)，是一种抗肿瘤抗生素，可抑制RNA和DNA的合成，对RNA的抑制作用最强，抗瘤谱较广，对多种肿瘤均有作用，属周期非特异性药物，对各种生长周期的肿瘤细胞都有杀灭作用。
室温：25±2℃。
本发明的技术方案为：
一种携载阿霉素的壳聚糖纳米级超声造影剂，该纳米级超声造影剂以壳聚糖为壳膜，壳聚糖壳膜内部包裹有阿霉素和气态氟碳，所述纳米级超声造影剂的粒径为300～900nm，其中，壳聚糖和阿霉素的质量比为1:1～4。
上述携载阿霉素的壳聚糖纳米级超声造影剂的制备方法，步骤如下：
(1)将棕榈酸、卵磷脂分散于磷酸盐缓冲液中制成混悬液，向混悬液中加入壳聚糖及阿霉素，25℃共孵育20～40mim，得孵育产物；
(2)向步骤(1)制得的孵育产物中充入气态氟碳，室温下超声震荡1～5min，得乳化产物；
(3)将步骤(2)制得的乳化产物于4℃静置，静置时间≥2h，分层后取下层液，稀释后低速离心，取下层液体，即为携载阿霉素的壳聚糖纳米级超声造影剂。
根据本发明优选的，步骤(1)所述棕榈酸和卵磷脂的质量比为1:2，所述混悬液中棕榈酸的浓度为0.4～0.5g/L；其中棕榈酸纯度≥99％，购自sigma，产品编号200-312-9；卵磷脂纯度≥99％，购自sigma，产品编号232-715-0。
根据本发明优选的，步骤(1)中所述磷酸盐缓冲液的组分为：Na2HPO4 8mM，KH2PO42mM，pH 7.2-7.4。
根据本发明优选的，步骤(1)中所述壳聚糖和阿霉素的质量比为1:1～4，所述混悬液中壳聚糖的浓度为0.4～0.6g/L；其中壳聚糖的分子量为160kDa，购自sigma，产品编号MFCD00161512；所述阿霉素纯度≥98％，购自sigma，产品编号246-818-3。
进一步优选的，所述壳聚糖和阿霉素的质量比为1:2，
根据本发明优选的，步骤(2)中所述气态氟碳为全氟丙烷气体。
根据本发明优选的，步骤(3)中所述稀释的倍数为5～10倍。
根据本发明优选的，步骤(3)中所述低速离心为500rpm离心5min。
上述携载阿霉素的壳聚糖纳米级超声造影剂联合超声靶向破坏微泡在治疗肿瘤中的应用。
上述携载阿霉素的壳聚糖纳米级超声造影剂联合超声靶向破坏微泡在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明的技术特点：棕榈酸和卵磷脂有助于壳聚糖的溶解，壳聚糖溶解后有利于孵育产物的制备，将壳聚糖与阿霉素的孵育产物采用超声乳化的方式，得到以壳聚糖为外壳、以阿霉素和气态氟碳为内核的乳化产物，经静置后，粒径较大的超声造影剂分布在上层，粒径相对较小的纳米级超声造影剂分布在下层，取下层液经稀释和低速离心，得到粒径较小且均匀的纳米级超声造影剂。
有益效果：
1、本发明制备的携载阿霉素的壳聚糖纳米级超声造影剂，是以壳聚糖为壳膜，阿霉素(DOX)和全氟丙烷气体包裹在壳聚糖壳膜内部，粒径为300～900nm，平均粒径为641nm(聚合物分散指数PDI：0.256)，在纳米级范围，能穿过肿瘤组织血管壁间隙，对于肿瘤的治疗具有靶向性和高效性。
2、本发明制备的携载阿霉素的壳聚糖纳米级超声造影剂具有较强的增强显像能力，而且可以在较长的时间内维持显影，还具有较高的药物包封率及载药量，生物安全性高，辐照强度为0.5W/cm2，辐照时间为30sec或60sec，细胞生存率均＞80％，适宜于超声显影及肿瘤疾病的辅助治疗。
3、本发明利用超声辐照的方式，一方面可以增强携载阿霉素的壳聚糖纳米级超声造影剂显影，另一方面可以借助超声辐照产生的声孔效应促进阿霉素更多的进入肿瘤细胞内，实现诊疗一体化。
4、本发明制备的携载DOX的壳聚糖纳米级超声造影剂联合超声靶向破坏微泡(UTMD)能显著提高DOX的提取率和降低肿瘤细胞生存率，有利于肿瘤疾病的治疗。
附图说明
图1是携载DOX的壳聚糖纳米级超声造影剂的光镜图；
图2是携载DOX的壳聚糖纳米级超声造影剂的粒径图；
图3是体外自制超声增强显像装置；
图4是携载DOX的壳聚糖纳米级超声造影剂体外显影图；
图5是携载DOX的壳聚糖纳米级超声造影剂体外显影随时间变化趋势图；
图6是不同超声参数下携载DOX的壳聚糖纳米级超声造影剂的生物安全性评价；
图7是携载DOX的壳聚糖纳米级超声造影剂中DOX摄取情况的流式细胞术图；
图8是携载DOX的壳聚糖纳米级超声造影剂对乳腺癌MCF-7细胞生存率影响图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，但本发明的保护范围并不仅限于此。
棕榈酸购自sigma，产品编号200-312-9；卵磷脂购自sigma，产品编号232-715-0；壳聚糖购自sigma，产品编号MFCD00161512；阿霉素购自sigma，产品编号246-818-3。
本实施例涉及药品及试剂如无特殊说明，均为普通市售产品。
实施例1：携载DOX的壳聚糖纳米级超声造影剂的制备
一种携载阿霉素的壳聚糖纳米级超声造影剂的制备方法，步骤如下：
(1)称取棕榈酸和卵磷脂分散于磷酸盐缓冲液(Na2HPO4 8mM，KH2PO4 2mM，pH7.2)中，混匀制成混悬液备用，所述混悬液中，棕榈酸的浓度为0.45g/L，卵磷脂的浓度为0.9g/L；向上述混悬液中加入壳聚糖(分子量为160kDa)及阿霉素，壳聚糖及阿霉素在混悬液中的浓度分别为0.5g/L和1g/L，25℃共孵育30mim，得孵育产物；
(2)向步骤(1)制得的孵育产物中充入全氟丙烷气体，室温下超声震荡2min，得乳化产物；
(3)将步骤(2)制得的乳化产物置于4℃静置2h，分层后取下层液，稀释5倍后500rpm低速离心5min，取下层液体，即为携载阿霉素的壳聚糖纳米级超声造影剂(DOX-NB)。
取上述制备的携载阿霉素的壳聚糖纳米级超声造影剂，稀释后滴加到载玻片上，通过光学显微镜观察造影剂的表观形貌，结果如图1所示，1000×光学显微镜下可见造影剂均呈球形，粒径均一，分散均匀无聚集；
取上述制备的携载阿霉素的壳聚糖纳米级超声造影剂，稀释后，使用纳米激光粒度及Zeta电位分析仪检测超声造影剂的粒径，结果如图2所示，造影剂的粒径为300～900nm，造影剂的平均粒径为641nm(聚合物分散指数PDI：0.256)，表面电位为67.12±2.1mW。
实施例2
一种携载阿霉素的壳聚糖纳米级超声造影剂的制备方法，步骤如下：
(1)称取棕榈酸和卵磷脂分散于磷酸盐缓冲液(Na2HPO4 8mM，KH2PO4 2mM，pH7.3)中，混匀制成混悬液备用，所述混悬液中，棕榈酸的浓度为0.4g/L，卵磷脂的浓度为0.8g/L；向上述混悬液中加入壳聚糖(分子量为160kDa)及阿霉素，壳聚糖及阿霉素在混悬液中的浓度分别为0.4g/L和1.6g/L，25℃共孵育25mim，得孵育产物；
(2)向步骤(1)制得的孵育产物中充入全氟丙烷气体，室温下超声震荡3min，得乳化产物；
(3)将步骤(2)制得的乳化产物置于4℃静置4h，分层后取下层液，稀释6倍后500rpm低速离心5min，取下层液体，即为携载阿霉素的壳聚糖纳米级超声造影剂(DOX-NB)。
本实施例制备的携载阿霉素的壳聚糖纳米级超声造影剂在1000×光学显微镜下呈球形，粒径均一，分散均匀无聚集，造影剂的粒径为300～900nm。
实施例3
一种携载阿霉素的壳聚糖纳米级超声造影剂的制备方法，步骤如下：
(1)称取棕榈酸和卵磷脂分散于磷酸盐缓冲液(Na2HPO4 8mM，KH2PO4 2mM，pH7.4)中，混匀制成混悬液备用，所述混悬液中，棕榈酸的浓度为0.5g/L，卵磷脂的浓度为1.0g/L；向上述混悬液中加入壳聚糖(分子量为160kDa)及阿霉素，壳聚糖及阿霉素在混悬液中的浓度分别为0.6g/L和1.8g/L，25℃共孵育35mim，得孵育产物；
(2)向步骤(1)制得的孵育产物中充入全氟丙烷气体，室温下超声震荡4min，得乳化产物；
(3)将步骤(2)制得的乳化产物置于4℃静置6h，分层后取下层液，稀释8倍后500rpm低速离心5min，取下层液体，即为携载阿霉素的壳聚糖纳米级超声造影剂(DOX-NB)。
本实施例制备的携载阿霉素的壳聚糖纳米级超声造影剂在1000×光学显微镜下呈球形，粒径均一，分散均匀无聚集，造影剂的粒径为300～900nm。
实施例4：DOX-NB的药物包封率及载药量检测
取实施例1～3在制备DOX-NB时静置后的下层液，采用酶标仪检测下层液中底层液体在480nm处的吸光度，根据标准曲线计算底层液体中游离的DOX质量，再根据以下公式计算DOX-NB的药物包封率(EE％)和载药量(LD％)：
EE％＝(载有的DOX质量/加入的初始DOX质量)×100％。
LD％＝(载有的DOX质量/加入的壳聚糖纳米级超声造影剂的质量)×100％
其中，
载有的DOX质量＝加入的初始DOX质量-游离的DOX质量，
加入的壳聚糖纳米级超声造影剂的质量为加入的初始原料的总质量，包括壳聚糖、阿霉素、棕榈酸和卵磷脂。
计算结果如表1所示，本发明制备的DOX-NB的药物包封率在50％以上，载药量≥59.38mg DOX/g造影剂。
表1不同携载DOX的壳聚糖超声纳米级造影剂的包封率及载药量
实施例5：DOX-NB的体外超声显影能力检测
自制4％琼脂凝胶模型，观察实施例1制备的DOX-NB的增强显像能力，操作装置如图3所示，将浓度为1.0×106bubbles/mL的DOX-NB加入琼脂凝胶模型的圆孔中，采用临床诊断超声仪(LOGIQ E9；GE，USA)检测超声显影能力，主要参数为：频率9.0MHz；机械指数：0.12；焦距：3.0cm；动态范围：60dB，二维与超声造影模式同步观察，参数设置保持不变。
用超声仪内部工作站存储图像资料，图像如图4所示，在灰阶显像和增强显像模式下，均能呈现出清晰的图像；Image J软件分析获取图像的灰度值，结果如图5所示，以上结果都表明，该造影剂有较强的超声显影能力，并能在较长时间(15min)内维持显影。
实施例6：壳聚糖纳米级超声造影剂的生物安全性检测
按照实施例1所述的制备方法制备壳聚糖纳米级超声造影剂，不同之处在于步骤(1)中不添加阿霉素。取上述制备的壳聚糖纳米级超声造影剂，使用CCK-8试剂测定其在MCF-7细胞系中的生物安全性，具体操作为：将MCF-7细胞接种于96孔板中，以含10％FBS的DMEM为培养基，细胞的密度为1.0×104个/孔，37℃、5％CO2孵育箱中培养24h，细胞贴壁，将培养基更换为含有上述壳聚糖纳米级超声造影剂的新鲜10％FBS DMEM培养基，DMEM培养基中壳聚糖纳米级超声造影剂的体积分数分别为0、10％、20％、30％，并进行超声辐照，超声辐照处理如下表所示：
表2不同的超声辐照处理方式
辐照结束后，37℃、5％CO2孵育箱中培养48h，然后用PBS洗涤细胞，加入含有10μL CCK-8试剂的新鲜10％FBS DMEM培养基，继续孵育1-4h，用酶标仪在480nm波长处检测其光吸收值。结果如图6所示：当壳聚糖纳米级超声造影剂的体积分数≤30％，辐照强度为0.5W/cm2时，各组细胞生存率均＞80％；当将辐照强度提高至1.0W/cm2时，壳聚糖纳米级超声造影剂的体积分数≤20％，细胞生存率也在80％以上，表明在一定的超声强度范围之内，该造影剂细胞毒性小，生物安全性好。
实施例7：DOX-NB联合靶向破坏微泡(UTMD)对DOX摂取率的影响
取实施例1制备的DOX-NB，检测MCF-7细胞对DOX-NB中DOX的摄取率，步骤如下：将MCF-7细胞以每孔2.5×105个细胞的密度接种在6孔板中过夜贴壁，更换新鲜的10％FBS DMEM培养基，10％FBS DMEM培养基中分别含有游离DOX、DOX-NB、游离DOX和UTMD、DOX-NB和UTMD，其中，DOX-NB在培养基中的体积分数为20％，各组DOX的含量保持一致。37℃、5％CO2孵育箱中培养1h，给予超声辐照或无超声辐照处理，处理方式如下表：
表3.包含不同成分的DMEM培养基中不同的超声辐照处理方式
超声辐照处理结束后，收集MCF-7细胞进行流式细胞术检测，结果如图7所示，结果表明：DOX-NB联合UTMD组DOX摄取效率显著高于对照组和游离DOX联合UTMD组，且辐照时间60sec时的摄取效率高于辐照时间30sec时的摄取效率。
实施例8：DOX-NB联合靶向破坏微泡(UTMD)对MCF-7细胞的作用
取实施例1制备的DOX-NB，使用CCK-8试剂测定其联合UTMD对MCF-7细胞的作用，预测DOX-NB在肿瘤治疗方面的应用价值。具体操作为：将MCF-7细胞接种于96孔板中，以含10％FBS的DMEM为培养基，细胞的密度为1.0×104个/孔，37℃、5％CO2孵育箱中过夜培养，细胞贴壁，更换新鲜的10％FBS DMEM培养基，培养基中分别含有游离DOX、DOX-NB、游离DOX和UTMD、DOX-NB和UTMD，其中，DOX-NB在培养基中的体积分数为20％，各组DOX的含量保持一致，给予超声辐照或无超声辐照处理，处理方式如表3所示；另外，以不含有其他成分的10％FBS DMEM培养基培养的MCF-7细胞为空白对照，无超声辐照处理。
超声辐照结束后，37℃、5％CO2孵育箱中培养24小时，然后用PBS洗涤细胞，加入含有10μLCCK-8试剂的新鲜10％FBS DMEM培养基，继续孵育1-4h，用酶标仪在480nm波长处检测其光吸收值，计算细胞生存率，结果如图8所示，结果显示：DOX-NB联合UTMD在超声强度为0.5W/cm2、辐照时间为60sec时，MCF-7细胞的生存率最低，为2.2±0.9％，明显低于DOX-NB组(21.0±2.2％)和游离DOX组(6.4±0.7％)，差异均有统计学差异(p＜0.01)，表明DOX-NB联合UTMD在超声辐照的条件下可有效降低肿瘤细胞的生存率，应用于肿瘤治疗。