技术领域
本发明涉及一种用于辅助治疗周围神经损伤的胶原蛋白膜及其制备方法和用途，特别涉及一种用于辅助神经融合剂治疗周围神经损伤的胶原蛋白膜及其制备方法和用途。本发明属于医用器械技术领域。
背景技术
现研究认为，在神经损伤后，损伤平面远端神经纤维全长的轴突和髓鞘破坏，神经支配的靶器官与神经元之间的联系争端，整个神经通路崩溃，这一系列的反应称之为华勒变性(Wallerian degeneration)。在损伤后早期，神经细胞胞体中蛋白酶的激活和释放使得神经的远端部位变性。随着细胞膜的溶解，细胞骨架开始崩解。神经近端因逆行性变性而开始水肿。在细胞骨架和细胞膜变性后，髓鞘崩解脱失，游离出脂滴。巨噬细胞和施万细胞等吞噬细胞开始清除髓鞘和轴突碎片。与此同时，这些细胞也产生可以提高轴突生长的细胞因子，有助于微环境的改善。层粘连蛋白靠捆绑特殊的受体作用于神经元和施万细胞，这些受体可以引导神经发芽和髓鞘形成，并且在细胞外基质和肌动蛋白细胞骨架之间提供分子连接。上述机体对神经损伤的反应中，诸如神经生长因子(NGF)和胶质细胞源神经营养因子GDNF)的表达将被增高，并可促进轴突再生。随着崩解产物的清除，神经近端开始再生并向远端延伸。但是周围神经的再生速度十分缓慢，只有1mm/day。
目前针对周围神经的治疗局限于显微外科缝合后神经营养药物辅助支持，这种方法恢复的速度较慢，而且由于恢复周期较长给患者带来了较大的经济负担和精神压力。
本发明发明人在研究工作中，获得了一种能够促进神经融合的神经融合剂，其由聚乙二醇，骨髓间充质干细胞，诱导性多能干细胞(IPS CELL)，施万细胞，胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)，丹参多酚酸以及纳米石墨烯组成。研究表明，使用该神经融合剂能够以最快的速度完成破裂神经细胞膜修复，从而达到损伤周围神经融合的目的。但是融合周围神经术后，周围神经断端存在张力，是影响周围神经恢复效果的一大因素。为了创造神经融合剂修复神经断端的良好环境，本发明发明人设计了一种胶原蛋白膜。在断端的神经外膜和束膜缝合后，将胶原蛋白膜包裹在周围神经断端周围，将胶原蛋白膜的两边分别与断端的近端和远端的神经外膜缝合，来消除现有的神经束膜外膜缝合术产生的张力。并且在恢复早期胶原蛋白膜的降解可以促进周围神经的恢复，有效的缩短了患者的恢复周期，减轻了患者的痛苦。
发明内容
本发明的目的在于克服经典的神经外膜和束膜缝合术造成对周围神经断端产生张力，不利于神经修复的问题，并辅助周围神经融合剂克服了现有技术中治疗外周神经损伤依赖损伤后神经细胞再生的缺点，将治疗的中心转移至损伤早期，通过外周神经融合修复损伤的神经纤维束，恢复神经细胞的结构完整性和电传导功能，在损伤早期最大限度的尽快恢复神经功能。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
本发明的一种用于辅助治疗周围神经损伤的胶原蛋白膜，是按照以下方法制备得到：
(1)按照以下重量百分比称取各原料：
1w/w％浓度的胶原蛋白水溶液40％-50％，2w/w％浓度的壳聚糖的稀醋酸溶液5-15％，5w/w％浓度的聚乙烯醇水溶液20％-30％，0.000001w/w％浓度的神经生长因子水溶液5％-10％，10w/w％浓度的B12水溶液1-10％，聚乙二醇1％-5％以及浓度为0.25w/w％浓度的戊二醛水溶液1％-3％；
(2)将胶原蛋白水溶液，壳聚糖的稀醋酸溶液，聚乙烯醇水溶液，神经生长因子水溶液，B12水溶液和聚乙二醇进行共混，充分搅拌均匀，室温静置脱泡；
(3)向步骤(2)的共混液中加入戊二醛水溶液，混合均匀，将混合均匀的溶液倒入培养皿中，水平置于鼓风干燥箱中，40℃下进行干燥，制备得到所述的胶原蛋白膜。
其中，优选的，按照以下重量百分比称取各原料：
1w/w％浓度的胶原蛋白水溶液48％，2w/w％浓度的壳聚糖的稀醋酸溶液10％，5w/w％浓度的聚乙烯醇水溶液25％，0.000001w/w％浓度的神经生长因子水溶液7％，10w/w％浓度的B12水溶液5％，聚乙二醇3％以及浓度为0.25w/w％浓度的戊二醛水溶液2％。
其中，优选的，所述的2w/w％浓度的壳聚糖的稀醋酸溶液为含有2w/w％的壳聚糖的1w/w％的醋酸溶液。
其中，优选的，所述聚乙二醇的相对分子量为400-1000，优选为聚乙二醇600。
进一步的，本发明还提出了所述的胶原蛋白膜在制备辅助治疗周围神经损伤的药物中的用途。
其中，优选的，所述的胶原蛋白膜用于辅助神经融合剂治疗周围神经损伤。
其中，优选的，所述的神经融合剂由聚乙二醇，骨髓间充质干细胞，诱导性多能干细胞，施万细胞，胶质细胞源性神经营养因子，丹参多酚酸以及纳米石墨烯组成。
其中，优选的，按重量百分比计，各成分所占的重量百分数为骨髓间充质干细胞0.01-1％，诱导性多能干细胞0.01-1％，施万细胞0.01-1％，胶质细胞源性神经营养因子0.01-1％，丹参多酚酸1-5％，纳米石墨烯0.01-1％，其余为聚乙二醇。更优选的，按重量百分比计，各成分所占的重量百分数为骨髓间充质干细胞0.1％，诱导性多能干细胞0.1％，施万细胞0.01％，胶质细胞源性神经营养因子0.01％，丹参多酚酸1％，纳米石墨烯1％，聚乙二醇97.78％。
其中，优选的，所述聚乙二醇的相对分子量为400-1000，优选为聚乙二醇600。
相较于现有技术，本发明的有益效果是：
目前针对周围神经的治疗局限于显微外科缝合后神经营养药物辅助支持，这种方法会对周围神经断端产生一定的张力，不利于断端的修复。本发明可以克服的周围神经断端产生张力的问题并且在恢复早期胶原蛋白膜的降解可以促进周围神经的恢复，在SD大鼠模型中能够在短时间内恢复其基本运动功能，而且较单独的断端神经束膜外膜缝合术或者断端神经束膜外膜缝合术结合神经融合剂效果更佳。
附图说明
图1为术后一周普通缝合+生理盐水组的电生理检测结果；
图2为术后一周普通缝合+神经融合剂组的电生理检测结果；
图3为术后四周普通缝合+生理盐水组的电生理检测结果；
图4为术后四周普通缝合+神经融合剂组的电生理检测结果；
图5为普通缝合+生理盐水组以及普通缝合+神经融合剂组的坐骨神经功能评分；
图6为本发明实验例的流程图；
图7为术后一周普通缝合+神经融合剂组的电生理检测结果
图8为术后一周普通缝合+胶原蛋白膜+神经融合剂组的电生理检测结果
图9为术后四周普通缝合+神经融合剂组的电生理检测结果
图10为术后四周普通缝合+胶原蛋白膜+神经融合剂组的电生理检测结果
图11为普通缝合+神经融合剂组以及普通缝合+胶原蛋白膜+神经融合剂组的坐骨神经功能评分。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1用于辅助治疗周围神经损伤的胶原蛋白膜的制备
1、溶液的配制
1w/w％浓度的胶原蛋白水溶液：称取1g的可溶性胶原蛋白粉溶于99ml蒸馏水水中，即得。
2w/w％浓度的壳聚糖的稀醋酸溶液：称取1.0g冰乙酸溶于99ml蒸馏水水中，得到1w/w％浓度的稀醋酸溶液；称取1.0g壳聚糖溶于49.0ml所配制的稀醋酸溶液中，即得。
5w/w％浓度的聚乙烯醇水溶液：称取聚乙烯醇5g溶于95ml蒸馏水中，即得。
0.000001w/w％浓度的神经生长因子水溶液：称取0.01g神经生长因子溶于100ml蒸馏水中，得到0.01w/w％浓度的神经生长因子水溶液，然后稀释至0.000001w/w％浓度。
10w/w％浓度的B12水溶液：称取维生素B12 10g，溶于90ml蒸馏水中，即得。
0.25w/w％浓度的戊二醛水溶液：称取0.25g戊二醛溶于99.75ml的水中，即得。
2、胶原蛋白膜的制备
(1)按照以下重量百分比称取各原料：
1w/w％浓度的胶原蛋白水溶液48％，2w/w％浓度的壳聚糖的稀醋酸溶液10％，5w/w％浓度的聚乙烯醇水溶液25％，0.000001w/w％浓度的神经生长因子水溶液7％，10w/w％浓度的B12水溶液5％，聚乙二醇3％以及浓度为0.25w/w％浓度的戊二醛水溶液2％；
(2)将胶原蛋白水溶液，壳聚糖的稀醋酸溶液，聚乙烯醇水溶液，神经生长因子水溶液，B12水溶液和聚乙二醇进行共混，充分搅拌均匀，室温静置脱泡；
(3)向步骤(2)的共混液中加入戊二醛水溶液，混合均匀，将混合均匀的溶液倒入培养皿中，水平置于鼓风干燥箱中，40℃下恒温干燥24h，制备得到所述的胶原蛋白膜。
实施例2用于辅助治疗周围神经损伤的胶原蛋白膜的制备
1、溶液的配制
同实施例1。
2、胶原蛋白膜的制备
(1)按照以下重量百分比称取各原料：
1w/w％浓度的胶原蛋白水溶液41％，2w/w％浓度的壳聚糖的稀醋酸溶液15％，5w/w％浓度的聚乙烯醇水溶液20％，0.000001w/w％浓度的神经生长因子水溶液10％，10w/w％浓度的B12水溶液7％，聚乙二醇4％以及浓度为0.25w/w％浓度的戊二醛水溶液3％；
(2)将胶原蛋白水溶液，壳聚糖的稀醋酸溶液，聚乙烯醇水溶液，神经生长因子水溶液，B12水溶液和聚乙二醇进行共混，充分搅拌均匀，室温静置脱泡；
(3)向步骤(2)的共混液中加入戊二醛水溶液，混合均匀，将混合均匀的溶液倒入培养皿中，水平置于鼓风干燥箱中，40℃下进行干燥，制备得到所述的胶原蛋白膜。
实施例3用于辅助治疗周围神经损伤的胶原蛋白膜的制备
1、溶液的配制
同实施例1。
2、胶原蛋白膜的制备
(1)按照以下重量百分比称取各原料：
1w/w％浓度的胶原蛋白水溶液48％，2w/w％浓度的壳聚糖的稀醋酸溶液8％，5w/w％浓度的聚乙烯醇水溶液24％，0.000001w/w％浓度的神经生长因子水溶液8％，10w/w％浓度的B12水溶液5％，聚乙二醇600 5％以及浓度为0.25w/w％浓度的戊二醛水溶液2％；
(2)将胶原蛋白水溶液，壳聚糖的稀醋酸溶液，聚乙烯醇水溶液，神经生长因子水溶液，B12水溶液和聚乙二醇进行共混，充分搅拌均匀，室温静置脱泡；
(3)向步骤(2)的共混液中加入戊二醛水溶液，混合均匀，将混合均匀的溶液倒入培养皿中，水平置于鼓风干燥箱中，40℃下进行干燥，制备得到所述的胶原蛋白膜。
实验例1：神经融合剂治疗大鼠模型周围神经损伤的实验研究
方法：
1、构建周围神经损伤的动物模型
动物选择为SD大鼠20只，造模方式为坐骨神经完全离断，随机分为对照组以及神经融合剂治疗组，每组10只；
2、神经融合剂的制备
2.1材料及其来源
本实施例所用聚乙二醇600为无菌液体原液，从sigma公司购买；骨髓间充质干细胞提取自自体骨髓；诱导性多能干细胞购自上海中乔新舟生物科技有限公司；施万细胞提取自自体腓肠神经；GDNF为本发明申请人自行合成；丹参多酚酸为注射剂，购自天津天士力之骄；纳米石墨烯微管购置于日本三井公司，为粉末。
2.2方法
1)取骨髓间充质干细胞104个，诱导性多能干细胞104个，施万细胞103个，放入0.05ml 01M PBS缓冲液中，标记为溶液1；
2)取胶质细胞源性神经生长因子(GDNF)0.01g，纳米石墨烯0.01g，丹参多酚酸0.01g，混于23.76ml聚乙二醇600中，并搅拌均匀，标记为溶液2；
3)将溶液1与溶液2混合后，立即使用。
3、分组
神经融合剂治疗组：离断前对坐骨采用神经融合剂浸泡，离断过程在神经融合剂中进行，离断后，进行普通缝合并再次滴加神经融合剂；
对照组：离断前对坐骨采用0.9％NaCl溶液浸泡，离断过程在0.9％NaCl溶液中进行，离断后，进行普通缝合并再次滴加0.9％NaCl溶液；
4、术后第一周和第四周进行坐骨神经功能评分及电生理检测。
5、实验结果：
5.1电生理检测：
对照组以及神经融合剂治疗组的电生理检测结果如图1-4所示。从该结果可以看出，治疗组的神经融合情况好于对照组。
5.2坐骨神经功能评分：
对照组以及神经融合剂治疗组的坐骨神经功能评分结果如图5所示。从该结果可以看出，神经融合剂治疗组的坐骨神经功能好于对照组。
实验例2：胶原蛋白膜辅助神经融合剂治疗大鼠模型周围神经损伤的实验研究
方法：
1、构建周围神经损伤的动物模型
动物选择为SD大鼠20只，造模方式为坐骨神经完全离断，随机分为神经束膜外膜缝合术+神经融合剂治疗组以及神经束膜外膜缝合术+神经融合剂+胶原蛋白膜治疗组，每组10只；
2、神经融合剂的制备
同实验例1。
3、分组
神经束膜外膜缝合术+神经融合剂治疗组：离断前对坐骨采用神经融合剂浸泡，离断过程在神经融合剂中进行，离断后，再次滴加神经融合剂并且缝合周围神经断端的神经束膜和外膜；
神经束膜外膜缝合术+神经融合剂+胶原蛋白膜治疗组：离断前对坐骨采用神经融合剂浸泡，离断过程在神经融合剂中进行，离断后，再次滴加神经融合剂并且缝合周围神经断端的神经束膜和外膜，然后，将胶原蛋白膜(实施例1制备)包裹在周围神经断端周围，将胶原蛋白膜的两边分别与断端的近端和远端的神经外膜缝合，分层缝合肌肉，脂肪，皮肤。
4、术后第一周和第四周进行坐骨神经功能评分及电生理检测。
本发明实验例的流程图如图6所示。
5、实验结果：
5.1电生理检测：
神经束膜外膜缝合术+神经融合剂治疗组以及神经束膜外膜缝合术+神经融合剂+胶原蛋白膜治疗组的电生理检测结果如图7-10所示。从该结果可以看出，神经束膜外膜缝合术+神经融合剂+胶原蛋白膜治疗组的神经融合情况好于神经束膜外膜缝合术+神经融合剂治疗组。
5.2坐骨神经功能评分：
神经束膜外膜缝合术+神经融合剂治疗组以及神经束膜外膜缝合术+神经融合剂+胶原蛋白膜治疗组的坐骨神经功能评分结果如图11所示。从该结果可以看出，神经束膜外膜缝合术+神经融合剂+胶原蛋白膜治疗组的坐骨神经功能好于神经束膜外膜缝合术+神经融合剂治疗组。
以上结果表明，在断端的神经外膜和束膜缝合后，将胶原蛋白膜包裹在周围神经断端周围，将胶原蛋白膜的两边分别与断端的近端和远端的神经外膜缝合，来消除现有的神经束膜外膜缝合术产生的张力。并且在恢复早期胶原蛋白膜的降解可以促进周围神经的恢复。