技术领域
本发明涉及生物免疫及疫苗，具体地说，涉及具备交叉免疫保护力的球虫病疫苗组分。
背景技术
鸡球虫病是规模化养殖场必须进行防控的疫病之一，其防控措施依赖于药物预防和疫苗接种。然而，球虫耐药性产生之迅速、抗球虫新药研发之困难、绿色健康养殖之需求使得药物防控愈发受到限制。鸡球虫病活卵囊疫苗是目前唯一批准上市的用于防控鸡球虫病的原虫病疫苗，其免疫保护效果良好，已广泛应用于种鸡、蛋鸡和肉鸡的球虫病防控。
以活卵囊为主要组分的球虫病疫苗不能够全面代替抗球虫药进行球虫的防控主要是由于其疫苗虫种的特点决定的。首先，感染鸡的艾美耳属球虫有7种，但不同虫种间不存在交叉免疫力，导致各商品化球虫病疫苗组分均是多种球虫的混合组分。不同虫种的疫苗组分需单独生产，互不污染，才能保证各虫种的免疫剂量和疫苗质量，这无疑增加了疫苗生产的难度和成本。其次，不同虫种免疫原性各异，免疫原性强的虫种如巨型艾美耳球虫经过一次免疫就可以提供安全保护，但免疫原性弱的虫种需经过反复食入垫料中的卵囊，进行2次或多次加强免疫才能建立良好的免疫保护力。此时，若防控不当或鸡舍饲养管理水平下降极易导致球虫病的爆发。
发明内容
为了解决现有球虫病疫苗组分不存在交叉免疫保护以及由此引起的球虫病疫苗接种给养殖业带来的风险，本发明的目的是构建一类具备交叉免疫保护的虫种作为球虫病疫苗组分，即利用转基因技术构建表达其他虫种单一或多个免疫优势抗原的转基因虫株。
为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：
第一方面，本发明提供了具备交叉免疫保护力的球虫病疫苗组分，其为表达异种球虫免疫优势抗原的转基因球虫株。该转基因球虫株由于同时具有亲本虫株和异种虫株的免疫原性，在作为球虫病疫苗组分时，可提高球虫病疫苗组分的交叉免疫保护力。
进一步地，所述免疫优势抗原可为一个或多个。经试验研究发现，该类新型疫苗组分提供的交叉免疫保护力与其表达的异种优势抗原的数量呈正相关性，因此所述免疫优势抗原优选为多个。
更进一步地，所述免疫优势抗原可来自一个或多个球虫虫种。为了提高交叉免疫保护能力，优选来自多种异种球虫。
作为优选，所述免疫优势抗原为IMP1蛋白、AMA1蛋白或系列膜表面蛋白中的一种或多种。所述系列膜表面蛋白为Profilin蛋白、SAG13蛋白、SAG1蛋白、SO7蛋白、Mic1蛋白、Mic2蛋白、Mic4蛋白、Mic6蛋白、TA4蛋白、GAM56蛋白或GAM82蛋白。这些蛋白由于具有膜分布，易于被宿主免疫系统识别的特点，格外适宜作为免疫优势抗原。
记忆部的，所述转基因球虫株的构建方法为：
S1、构建球虫转染载体：
以球虫基因调控原件如启动子等构建表达上述免疫优势抗原基因和筛选基因(乙胺嘧啶抗性基因与荧光报告进)的球虫转染载体。本发明采用球虫子孢子膜抗原13基因的调控序列，包括启动子与3’非编码区(见图1A)。
S2、将所述球虫转染载体线性化后利用限制性内切酶介导的核转染方式转染到球虫子孢子，获得转基因球虫卵囊；
S3、筛选获得阳性群体；
S4、单卵囊或孢子囊扩增阳性群体，即得转基因球虫株。
之后，可利用分子生物学、免疫学等实验手段进行验证；并利用该类新型疫苗组分进行球虫经典免疫试验，验证其提供的交叉免疫保护力。
其中，S3中利用药物压力筛选与荧光流式分选相结合筛选阳性群体。基于转基因球虫表达荧光蛋白报告基因，野生型虫体则无，可利用流式细胞分选仪将两种群体区分开来；同时转基因球虫对乙胺嘧啶具有抗性，野生型则无，可通过药物压力筛选。将上述筛选方法相结合，可快速得到阳性群体。
进一步优选S2中的球虫子孢子为柔嫩艾美耳球虫子孢子。柔嫩艾美耳球虫子孢子具有较好的转基因操作背景，且转染后子孢子可经泄殖腔接种，利于获得阳性群体；同时，柔嫩艾美耳球虫繁殖量高，节约疫苗生产成本。
更进一步地，所述免疫优势抗原为以下(1)～(13)中的一种或多种，优选两种以上，更优选三种或三种以上：
(1)来自巨型、毒害、堆型、和缓、布氏或早熟艾美耳球虫的抗原IMP1；
(2)来自巨型、毒害、堆型、和缓、布氏或早熟艾美耳球虫的抗原AMA1；
(3)来自巨型、毒害、堆型、和缓、布氏或早熟艾美耳球虫的抗原Profilin；
(4)来自巨型、毒害、堆型、和缓、布氏或早熟艾美耳球虫的膜抗原SAG13；
(5)来自巨型、毒害、堆型、和缓、布氏或早熟艾美耳球虫的膜抗原SAG1；
(6)来自巨型、毒害、堆型、和缓、布氏或早熟艾美耳球虫的抗原SO7；
(7)来自巨型、毒害、堆型、和缓、布氏或早熟艾美耳球虫的抗原Mic1；
(8)来自巨型、毒害、堆型、和缓、布氏或早熟艾美耳球虫的抗原Mic2；
(9)来自巨型、毒害、堆型、和缓、布氏或早熟艾美耳球虫的抗原Mic4；
(10)来自巨型、毒害、堆型、和缓、布氏或早熟艾美耳球虫的抗原Mic6；
(11)来自巨型、毒害、堆型、和缓、布氏或早熟艾美耳球虫的抗原TA4；
(12)来自巨型、毒害、堆型、和缓、布氏或早熟艾美耳球虫的抗原GAM56；
(13)来自巨型、毒害、堆型、和缓、布氏或早熟艾美耳球虫的抗原GAM82。
当所述免疫优势抗原为多种时，利用SEQ ID NO.1所示序列(P2A序列)连接所述免疫优势抗原的基因，构建球虫转染载体，可保证各抗原之间互不影响。
第二方面，本发明提供了一种含有前述球虫病疫苗组分的球虫病免疫疫苗。
本发明的有益效果在于：
本发明提供了一类具备交叉免疫保护力的球虫病疫苗组分及其构建策略，即能够针对多虫种感染提供免疫保护力的新型疫苗组分。该类新型疫苗组分提供的交叉免疫保护力具有普适性。
附图说明
图1为本发明实施例1的转基因球虫构建与鉴定图。
图2为本发明实施例1的评估转基因操作对虫体免疫原性影响的图。
图3为本发明实施例1的评估表达IMP1抗原的转基因球虫抵抗异种球虫感染保护效力的图。
图4为本发明实施例2的评估共表达巨型IMP1与AMA1抗原的转基因球虫抵抗巨型艾美耳球虫感染保护效力的图。
图5为本发明实施例3的评估共表达巨型IMP1、Profilin和AMA1抗原的转基因球虫抵抗巨型艾美耳球虫感染保护效力的图。
图6为本发明实施例4的评估表达毒害AMA1抗原的转基因球虫抵抗毒害艾美耳球虫感染保护效力的图。
图7为本发明实施例5的评估共表达巨型、毒害和堆型IMP1抗原的转基因球虫抵抗巨型艾美耳球虫和毒害艾美耳球虫感染保护效力的图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
本实施例以危害养禽业最为严重的球虫虫种之一，柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)为表达载体，利用本发明的的策略表达巨型艾美耳球虫的免疫优势抗原IMP1(Immune mapped protein 1,IMP1)。评估其免疫原性和针对巨型艾美耳球虫感染的免疫保护力。衡量指标为卵囊排出量、鸡群体增重和肠道病变计分。
新型疫苗组分的构建系利用限制性内切酶介导的核转染技术将转染载体(图1A)转染球虫子孢子后，泄殖腔接种雏鸡，获得转基因球虫卵囊(Trans 1)，经连续药物筛选和流式分选得到大量转基因球虫群体。免疫用新型疫苗组分是从上述转基因虫体中经单卵囊分离获得的克隆群体，生物学特性稳定。经鉴定，确定IMP1基因插入转基因球虫基因组中(图1B)。其卵囊排出与亲本虫株无显著差异(图1C)，可以消除生物学特性对免疫效果的影响。
100羽1周龄SPF鸡随机分为4组：不免疫攻虫组(Ctrl)、亲本球虫种即野生球虫免疫组(WT)、转基因遗传操作球虫对照组(Trans C)和新型疫苗组分免疫组(Trans 1)。上述各组每羽鸡分别口服接种200μl PBS、200μl PBS(含200WT卵囊)、200μl PBS(含200表达荧光蛋白的转基因球虫卵囊)和200μl PBS(含200新型疫苗组分卵囊)，免疫后各组鸡群同等条件垫料饲养，自由采食、饮水。免疫后2周，各免疫组进行攻虫感染，各组分别口服接种10,000卵囊/羽(柔嫩艾美耳球虫)。为了反映本发明新型疫苗组分抵抗亲本虫株感染的免疫保护力，本案例统计了攻虫后的卵囊排出量、鸡群体增重及盲肠的病变程度，详述如下：
1、通过免疫攻虫后粪便中卵囊的排出(图2A)评估新型疫苗组分抵抗亲本虫株感染的保护力。可以看出，新型疫苗组分与其亲本虫株保持同等的免疫原性，即抵抗亲本虫株感染的保护力相同；同时也说明转基因遗传操作及外源抗原基因的插入没有影响虫体的免疫原性(WT组与Tans C组免疫保护效果相当)。
2、鸡群体增重是评估疫苗免疫保护效果的重要指标之一，本案例对攻虫前后鸡群的体重进行统计(图2B)。可以看出，不免疫攻虫组鸡群的体增重受到严重抑制。各组球虫组分免疫组鸡群的体增重无显著差异，进一步说明新型疫苗组分保持了其亲本虫株的免疫原性。
3、盲肠病变积分是反映球虫病疫苗免疫，对鸡群再次感染球虫提供保护力的重要指征(图2C)。可以看出，不免疫攻虫组鸡群的盲肠病变严重。各组球虫组分免疫组鸡群的病变相当，且计分均小于不免疫攻虫组，说明新型疫苗组分能够提供良好的针对其亲本虫株感染的免疫保护力。
和上述试验方案设计类似，100羽1周龄SPF鸡做同样免疫处理，2周后采用异种虫株(巨型艾美耳球虫)进行攻虫，剂量为1000卵囊/羽。同样采用攻虫后的卵囊排出量、鸡群体增重及小肠中段的病变程度，反映本发明新型疫苗组分抵抗异种虫株感染的免疫保护力，详述如下：
1、以卵囊排出量为指标衡量新型疫苗组分抵抗异种虫株的保护力(图3A)。可以看出，新型疫苗组分免疫组的卵囊排出显著低于传统疫苗组分(即野生型球虫WT免疫组)与转基因球虫操作对照组的卵囊排出，说明新型疫苗组分能够对异种虫种感染免疫保护力；同时各组卵囊排出与不免疫攻虫组相比，说明此种交叉保护为新型疫苗组分所特有。
2、以体增重为指标衡量新型疫苗组分抵抗异种虫株的保护力(图3B)。可以看出，新型疫苗组分免疫组攻虫后的体增重显著高于传统疫苗组分(即野生型球虫WT免疫组)与转基因球虫操作对照组的体增重，进一步说明新型疫苗组分能够对异种虫种感染免疫保护力且此种交叉保护为新型疫苗组分所特有。
3、以小肠中段的病变指数为指标衡量新型疫苗组分抵抗异种虫株的保护力(图3C)。可以看出，新型疫苗组分免疫组攻虫后的病变显著低于传统疫苗组分(即野生型球虫WT免疫组)与转基因球虫操作对照组的病变，验证了新型疫苗组分能够对异种虫种感染免疫保护力且此种交叉保护为新型疫苗组分所特有。
实施例2
本实施例在已有新型疫苗组分(实施例1所述Trans 1)的基础上，又增加表达了巨型艾美耳球虫的免疫优势抗原AMA1(Apical membrane antigen 1，AMA1)。构建一株表达2种免疫优势抗原的新型疫苗组分(Trans 2)。其自身生物学特性、免疫原性的验证按照实施例1中的描述进行，并无显著变化。采用攻虫后的卵囊排出量、鸡群体增重及小肠中段的病变程度，反映本发明新型疫苗组分抵抗异种虫株感染的免疫保护力，详述如下：
1、以卵囊排出量为指标衡量新型疫苗组分抵抗异种虫株的保护力(图4A)。可以看出，新型疫苗组分免疫组的卵囊排出显著低于传统疫苗组分(即野生型球虫WT免疫组)与转基因球虫操作对照组的卵囊排出，说明新型疫苗组分能够对异种虫种感染免疫保护力；与Trans 1纵向比较发现，表达2种免疫优势抗原的新型疫苗组分(Trans 2)优于Trans 1。
2、以体增重为指标衡量新型疫苗组分抵抗异种虫株的保护力(图4B)。可以看出，新型疫苗组分免疫组攻虫后的体增重显著高于传统疫苗组分(即野生型球虫WT免疫组)与转基因球虫操作对照组的体增重，进一步说明新型疫苗组分能够对异种虫种感染免疫保护力且Trans 2优于Trans 1。
3、以小肠中段的病变指数为指标衡量新型疫苗组分抵抗异种虫株的保护力(图4C)。可以看出，新型疫苗组分免疫组攻虫后的病变显著低于传统疫苗组分(即野生型球虫WT免疫组)与转基因球虫操作对照组的病变，验证了新型疫苗组分能够对异种虫种感染免疫保护力且且Trans 2优于Trans 1。
实施例3
本实施例在已有新型疫苗组分(实施例2所述Trans 2)的基础上，又增加表达了巨型艾美耳球虫的免疫优势抗原Profilin(图5A)。构建一株表达3种免疫优势抗原的新型疫苗组分(Trans 3)。其自身生物学特性、免疫原性的验证按照实施例1中的描述进行，并无显著变化。采用攻虫后的卵囊排出量、鸡群体增重及小肠中段的病变程度，反映本发明新型疫苗组分抵抗异种虫株感染的免疫保护力，详述如下：
1、以卵囊排出量为指标衡量新型疫苗组分抵抗异种虫株的保护力(图5B)。可以看出，新型疫苗组分免疫组的卵囊排出显著低于传统疫苗组分(即野生型球虫WT免疫组)与转基因球虫操作对照组的卵囊排出，说明新型疫苗组分能够对异种虫种感染免疫保护力；与Trans 1、Trans 2纵向比较发现，表达3种免疫优势抗原的新型疫苗组分(Trans 3)优于Trans 1和Trans 2。
2、以体增重为指标衡量新型疫苗组分抵抗异种虫株的保护力(图5C)。可以看出，新型疫苗组分免疫组攻虫后的体增重显著高于传统疫苗组分(即野生型球虫WT免疫组)与转基因球虫操作对照组的体增重，进一步说明新型疫苗组分能够对异种虫种感染免疫保护力且Trans 3优于Trans 2，更优于Trans 1。
3、以小肠中段的病变指数为指标衡量新型疫苗组分抵抗异种虫株的保护力(图5D)。可以看出，新型疫苗组分免疫组攻虫后的病变显著低于传统疫苗组分(即野生型球虫WT免疫组)与转基因球虫操作对照组的病变，验证了新型疫苗组分能够对异种虫种感染免疫保护力且且T Trans 3优于Trans 2，更优于Trans 1。
实施例4
本实施例构建另一株新型疫苗组分(Trans 4)，系表达毒害艾美耳球虫的免疫优势抗原AMA1(Apical membrane antigen 1，AMA1)。其自身生物学特性、免疫原性的验证按照实施例1中的描述进行，并无显著变化。采用攻虫后的卵囊排出量、鸡群体增重及小肠中段的病变程度，反映本发明新型疫苗组分抵抗异种虫株感染的免疫保护力，详述如下：
1、以卵囊排出量为指标衡量新型疫苗组分抵抗异种虫株的保护力(图6A)。可以看出，新型疫苗组分免疫组的卵囊排出显著低于传统疫苗组分(即野生型球虫WT免疫组)与转基因球虫操作对照组的卵囊排出，说明新型疫苗组分能够对异种虫种感染免疫保护力；同时各组卵囊排出与不免疫攻虫组相比，说明此种交叉保护为新型疫苗组分所特有。
2、以体增重为指标衡量新型疫苗组分抵抗异种虫株的保护力(图6B)。可以看出，新型疫苗组分免疫组攻虫后的体增重显著高于传统疫苗组分(即野生型球虫WT免疫组)与转基因球虫操作对照组的体增重，进一步说明新型疫苗组分能够对异种虫种感染免疫保护力且此种交叉保护为新型疫苗组分所特有。
3、以小肠中段的病变指数为指标衡量新型疫苗组分抵抗异种虫株的保护力(图6C)。可以看出，新型疫苗组分免疫组攻虫后的病变显著低于传统疫苗组分(即野生型球虫WT免疫组)与转基因球虫操作对照组的病变，验证了新型疫苗组分能够对异种虫种感染免疫保护力且此种交叉保护为新型疫苗组分所特有。
实施例5
本实施例构建另一株新型疫苗组分(Trans 5)，系表达堆型艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫和毒害艾美耳球虫的免疫优势抗原IMP1(图7A)。其自身生物学特性、免疫原性的验证按照实施例1中的描述进行，并无显著变化。采用攻虫后的卵囊排出量(堆型、巨型毒害艾美耳球虫分别计数)、鸡群体增重及十二指肠与小肠中段的病变程度，反映本发明新型疫苗组分抵抗多虫种异源虫株感染的免疫保护力，详述如下：
1、以卵囊排出量为指标衡量新型疫苗组分抵抗异种虫株的保护力(图7B-D)。可以看出，新型疫苗组分免疫组的卵囊排出(包括堆型、巨型毒害艾美耳球虫)显著低于传统疫苗组分(即野生型球虫WT免疫组)与转基因球虫操作对照组的卵囊排出，说明新型疫苗组分能够对多种异种虫种感染免疫保护力；同时各组卵囊排出与不免疫攻虫组相比，说明此种交叉保护为新型疫苗组分所特有。
2、以体增重为指标衡量新型疫苗组分抵抗异种虫株的保护力(图7E)。可以看出，新型疫苗组分免疫组攻虫后的体增重显著高于传统疫苗组分(即野生型球虫WT免疫组)与转基因球虫操作对照组的体增重，进一步说明新型疫苗组分能够对异种虫种感染免疫保护力且此种交叉保护为新型疫苗组分所特有。
3、以十二指肠(评估针对堆型艾美耳球虫感染的保护力)、小肠中段(评估针对巨型与毒害艾美耳球虫感染的保护力)的病变指数为指标衡量新型疫苗组分抵抗异种虫株的保护力(图7F，G)。可以看出，新型疫苗组分免疫组攻虫后的病变显著低于传统疫苗组分(即野生型球虫WT免疫组)与转基因球虫操作对照组的病变，验证了新型疫苗组分能够对异种虫种感染免疫保护力且此种交叉保护为新型疫苗组分所特有。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。