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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610793976.8 (22)申请日 2016.08.31 (71)申请人 宁波大学 地址 315221 浙江省宁波市江北区风华路 818号 (72)发明人 步世忠 罗春 袁燕燕 邹欣蓉 刘冰洋 (74)专利代理机构 贵阳派腾阳光知识产权代理 事务所(普通合伙) 52110 代理人 管宝伟 (51)Int.Cl. A61K 36/605(2006.01) A61P 3/10(2006.01) A61P 5/50(2006.01) A61K 35/64(2015.01) (。
2、54)发明名称 一种增加胰岛素敏感性的组合物及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种增加胰岛素敏感性的组 合物， 其特征在于， 所述组合物由蚕沙1020、 桑白皮5055、 桑叶2540混合提取。 本发 明的组合物对于增加胰岛素敏感性显示良好的 效果。 权利要求书1页 说明书5页 附图2页 CN 106420932 A 2017.02.22 CN 106420932 A 1.一种增加胰岛素敏感性的组合物， 其特征在于， 所述组合物由蚕沙1020、 桑白皮 5055、 桑叶2540混合提取。 2.如权利要求1所述的组合物在制备治疗/预防糖尿病药物中的应用。 3.一种增加胰岛素敏感性的组合物的提取。
3、方法， 其特征在于包括以下步骤： 粉碎步骤， 将蚕沙、 桑白皮、 桑叶分别干燥后， 粉碎成干燥粉末； 混合步骤， 将粉碎后的蚕沙1020、 桑白皮5055、 桑叶2540的干燥粉末搅拌 混匀， 得到混合物； 浸提步骤， 将所述混合物与提取溶液混合， 所述提取溶液是含水量4060的1， 3-丁 二醇， 得混合液， 将所述混合液置于水浴中搅拌提取， 所述水浴温度为8095； 过滤步骤， 将浸提后的混合液过滤得到滤液， 并使用NaOH将所述滤液的pH值调至10； 浓缩步骤， 将所述滤液减压浓缩至原浓度的2050； 离子交换树脂处理步骤， 将上述浓缩液通过离子交换树脂处理， 得到组合物原液； 干燥步骤。
4、， 将上述组合物原液冷冻干燥， 得褐色粉末。 4.如权利要求3所述的方法， 所述提取溶液是含水量50的1， 3-丁二醇。 5.如权利要求3所述的方法， 所述水浴温度为85。 6.如权利要求3所述的方法， 所述浸提步骤中， 浸提时间不小于24小时。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 106420932 A 2 一种增加胰岛素敏感性的组合物及其应用 技术领域 0001 本发明涉及一种增加胰岛素敏感性的组合物， 该组合物由蚕沙1020、 桑白皮 5055、 桑叶2540混合提取。 背景技术 0002 桑树是多年生的桑科桑属植物， 在亚洲、 欧洲、 北美、 南美、 非洲及印度的热带、 亚 热带。
5、、 温带等广泛分布， 在我国东南部浙江、 江苏等省蚕养殖基地多有种植， 含有丰富的黄 酮类物质。 桑白皮提取物来自桑科桑属植物的干燥根皮， 冬季采挖， 洗净， 趁新鲜刮去背棕 色栓皮， 分离皮部与木心， 剥取白皮， 晒干。 多项研究证实， 桑白皮提取物(mori cortex extract)具有多种药用功效， 包括抗炎、 抗肝癌作用， 如通过抑制微管组装诱导癌细胞凋 亡， 消除包括支气管炎在内的肺部炎症。 桑白皮提取物通过糖皮质激素受体的双向磷酸化 对海马具有抗抑郁作用。 桑白皮提取物桑黄酮G还可作为口腔致龋菌的抗菌剂。 0003 桑白皮的主要化学成分有黄酮类、 香豆素类、 多糖类、 以及其。
6、它化合物。 黄酮类主 要包括桑素、 环桑色烯素、 桑皮素、 环桑皮素、 桑色烯、 羟基二氢桑根皮素、 桑酮AV、 桑皮根 素氢过氧化物、 桑根皮素-4-葡萄糖、 环桑色醇、 二氢黄酮类桑根酮化合物A、 桑苷A-D、 桑根 皮醇、 5， 7-二羟基色酮、 摩查尔酮A等。 香豆素包括东莨菪素、 5， 7-羟基香豆素、 东莨菪内酯 (6-甲氧基-7-羟基-香豆素)、 伞形花内脂。 多糖类包括壳聚糖、 甲壳素、 粘液素、 桑多糖。 其 它化合物还包括桑糖苷元A、 1-脱氧野尻霉素、 二苯乙烯苷类化合物、 桑辛素(A、 B、 C、 D、 F、 G)、 丁醇、 苷类衍生物、 鞣质、 谷甾醇、 桦皮酸、 挥。
7、发油、 胡萝 卜苷、 齐墩果酸、 熊果酸、 3-甲氧 基-4-羟基-苯甲醛等。 0004 刘晓雯等研究报道， 桑白皮的醇提液能抑制肠上皮的蔗糖酶活性， 延缓单糖的吸 收， 从而降低餐后血糖的迅速升高； Hikino等研究发现了桑白皮具有降糖活性另一成分 moran A的糖蛋白可以明显降低正常小鼠和四氧嘧啶诱导所致糖尿病小鼠的血糖水平； 周 锋等用高脂饮食配以腹腔注射STZ建立糖尿病大鼠模型， 探讨桑白皮总黄酮的降糖作用， 结 果发现桑白皮总黄酮能降低2型糖尿病大鼠的血糖和甘油三酯水平， 具有抗糖尿病和调节 血脂的作用； 钟国连等用STZ诱导的糖尿病大鼠， 灌胃给药桑白皮水提取液研究它对糖尿病 。
8、大鼠糖脂代谢的影响， 发现对实验性糖尿病大鼠具有降血糖作用， 但对血脂无影响； 汪宁等 研究发现， 桑白皮水提取液在没有胰岛素作用的情况下， 促进HepG2肝细胞对葡萄糖的消 耗， 对低剂量胰岛素接到的HepG2细胞糖摄取有辅助增强的作用。 马松涛等用桑白皮提取物 灌胃给四氧嘧啶诱导的糖尿病大鼠， 给药一段时间后， 结果显示对糖尿病大鼠的神经病变 有明显的改善作用， 可增加神经髓鞘周围横断面的面积， 减轻水肿， 并可降低MDA含量， 增加 SOD活性， 缓解糖尿病大鼠周围神经早期的病变； 同时发现， 桑白皮提取物可增加坐骨神经 突触素含量， 改善或增加大鼠坐骨神经的感觉及运动传导速度， 缩短潜。
9、伏期； 另外， 桑白皮 提取物可提高钠钾泵酶的活性， 增加坐骨神经cGMP、 cAMP的含量， 对糖尿病神经病变具有一 定的防治作用。 0005 蚕沙富含叶绿素、 果胶、 类黄酮、 粗蛋白， 以及部分人体必需的微量元素等有效成 说 明 书 1/5 页 3 CN 106420932 A 3 分。 有关蚕沙化学成分的研究一直在不断的深入 中华本草 记载： 蚕沙含叶绿素衍生物， 包 括脱镁叶绿素a及b， 13-羟基脱镁叶绿素a及b， 10-羟基脱镁叶绿素a等。中药大辞典 归纳： 蚕沙含有机物83.7790.44， 灰分9.5616.23， 总氮量1.913.60， 植物醇0.25 0.29。 还含有。
10、叶绿素， 游离氨基酸， 不皂化成分 -谷甾醇、 胆甾醇、 麦角甾醇和廿四醇、 蛇 麻脂醇， -谷甾醇- -葡萄糖甙， 铜元素， 大量胡萝 卜素和维生素B以及植物生长激素-杂茁长 素。 颜新培等总结： 蚕沙含70粗蛋白、 粗脂肪、 粗纤维、 无氮浸出物、 灰分、 水等， 还含叶绿素、 类胡萝 卜素、 果胶、 叶蛋白等； 蚕沙中还含有三十烷醇， 维生素A、 B、 D， 茄呢醇， 蚕沙酮， -谷 甾-D-葡萄糖， 羽扁豆醇， 麦角甾醇， 谷甾醇， 胆甾醇， 二十四醇， 蛇麻脂醇， 游离氨基酸13种， 植物生长激素、 杂茁长素及铜等人体必需的微量元素。 魏克民等报道： 蚕沙中含有丰富的营 养物质， 现。
11、代研究表明， 风干后的春蚕沙中含有13.6的粗蛋白、 3.7的脂肪、 12.5的粗 纤维、 75无氮浸出物48.7， 灰分12.6， 钙3.2。 蚕沙中除含丰富的的叶绿素外， 还有类 胡萝 卜素、 果胶、 叶蛋白等成分以及磷、 钾、 硅、 镁等营养元素。 崔锡强等从60乙醇提取物的 醋酸乙酯部位中， 首次分离出scopoletin、 umbelliferone、 二氢尿嘧啶、 尿嘧啶、 blumenol- A、 loliolide、 苯甲酸、 9， 16-dioxo-10， 12， 14-octadecatrienoicacid。 周光雄等应用大孔 树脂、 离子交换树脂、 葡聚糖凝胶等多种柱层。
12、析手段分离纯化生物碱成分， 用质谱和核磁等 光谱方法确定化合物的结构， 首次分离出1-脱氧野尻霉素、 fagomine和3-epifagomine生物 碱成分。 崔锡强等应用色谱技术分离纯化技术， 首次从蚕沙95乙醇提取物中醋酸乙酯部 分， 分离出3S， 5R-dihydroxy-6R， 7-megstigmadien-9-one， 3S， 5R-dihydroxy-6S， 7- megstigmadien-9-one， (6R， 9R)-3-oxo- -ionol -D-glucopyranoside， (6R， 9S)-3-oxo- - ionol- -D-glucopyranoside，。
13、 blumenol C glucoside， byzantionoside B， alangionoside L等一系列倍半萜及其苷类化合物； 在脂溶性部分还分离得到了化合物叶黄素； 从水部分分 离得到水溶性成分化合物哌可啉酸， 甜菜碱， 丙氨酸， 谷氨酸， 苯丙氨酸， 亮氨酸， 异亮氨酸。 0006 自古以来， 中医就将桑叶作为治疗消渴症(即现代医学的糖尿病)的中药应用于临 床， 日本古书 吃茶养生记 也记载桑叶有改善 “饮水病” (即现代医学的糖尿病)的作用。 国 内外研究资料证实， 生物碱和多糖是桑叶中主要的降血糖成分。 0007 桑叶的降血糖作用是通过两个途径实现的： 一是通过生物碱D。
14、NJ(1-脱氧野尻霉 素)对二糖类分解酶活性产生抑制作用， 从而抑制小肠对双糖的吸收， 降低食后血糖的高峰 值； 二是通过桑叶生物碱fagomine及桑叶多糖促进 细胞分必胰岛素， 而胰岛素可以促进细 胞对糖的利用、 肝糖原合成以及改善糖代谢， 最终达到降血糖的效果。 0008 综上所述， 蚕沙、 桑白皮以及桑叶都具有降低血糖的作用， 但是由于它们的成分复 杂， 具体是由哪种成分通过怎样的机理来发挥降糖作用并不清楚。 然后在治疗糖尿病过程 中， 低血糖通常是治疗糖尿病的并发症， 低血糖对人体是有害的， 尤其是对老年病人， 低血 糖的危害更甚于高血糖。 低血糖的危害主要有： 1、 低血糖时， 体。
15、内的肾上腺素、 糖皮质激素、 胰高血糖素及生长激素等升糖激素增加， 导致反应性交血糖(苏木杰效应)， 造成血糖波动， 病情加重； 2、 长期反复严重的低血糖发作可导致中枢神经系统不可逆的损害， 引起病人性 格变异， 精神失常、 痴呆等； 3、 低血糖还可以刺激心血管系统， 促发心律失常、 心肌梗塞、 脑 卒中等； 4、 低血糖昏迷过久未被发现可造成死亡。 0009 另外， 不同的提取方法， 对于从蚕沙、 桑白皮以及桑叶中提取的物质种类有很大的 差异， 虽然不同的报道多有显示蚕沙、 桑白皮以及桑叶的提取物都有一定程度的降糖功效， 说 明 书 2/5 页 4 CN 106420932 A 4 但是。
16、对于三者混合后的提取物及提取方法均未有报道。 发明内容 0010 本发明人经过创造性地试验和坚持不懈地努力， 发现了一种新的提取物对于增加 胰岛素的敏感性及降低血糖有显著的效果。 本发明的目的在于提供一种新的增加胰岛素敏 感性的组合物， 所述组合物是由蚕沙1020、 桑白皮5055、 桑叶2540混合后提取 所得。 0011 本发明的蚕沙是指蚕粪， 除沙时混入的桑叶、 蜕皮或其它杂物已经被分离。 本发明 的桑白皮是桑科植物桑Morus alba L.的干燥根皮， 也可以是桑树根部的干燥物。 本发明的 桑叶同样来自桑科植物桑Morus alba L.的树叶， 采收后晒干备用。 0012 上述原料。
17、可从农家采购或者自备， 上述原料蚕沙、 桑白皮、 桑叶干燥后， 粉碎成干 燥粉末。 上述干燥粉末的混合比例为蚕沙1020、 桑白皮5055、 桑叶2540。 0013 一种增加胰岛素敏感性的组合物的提取方法， 包括以下步骤： 0014 粉碎步骤， 将蚕沙、 桑白皮、 桑叶分别干燥后， 粉碎成干燥粉末； 0015 混合步骤， 将上述蚕沙1020、 桑白皮5055、 桑叶2540的干燥粉末搅拌 混匀， 得到混合物； 0016 浸提步骤， 将上述混合物与提取溶液混合， 所述提取溶液是含水量4060的1， 3-丁二醇， 将混合液置于水浴中搅拌提取， 所述水浴温度为8095； 0017 过滤步骤， 将浸。
18、提后的混合液过滤得到滤液， 并使用NaOH将pH值调至10； 0018 浓缩步骤， 上述滤液减压浓缩至原浓度的2050； 0019 离子交换树脂处理步骤， 将上述浓缩液通过膜处理或离子交换树脂， 得到组合物 原液； 0020 干燥步骤， 将上述组合物混合液干燥， 得褐色粉末。 附图说明 0021 图1各组大鼠血清中总胆固醇TC的比较。 0022 图2各组大鼠血清中甘油三酯TG的比较。 0023 图3OGTT实验在0， 30， 60， 120min时的血糖情况。 0024 图4OGTT实验曲线下面积AUC的统计结果。 具体实施方式 0025 实施例1 0026 本发明的蚕沙、 桑白皮、 桑叶来自。
19、于浙江省北部地区的蚕农， 将从农户处收购的蚕 沙、 桑白皮、 桑叶用去离子水洗净， 置于30干燥箱中过夜， 得到干燥品后， 用研钵或者粉碎 机研碎至粉末或微小颗粒。 然后分别称取蚕沙200g、 桑白皮500g、 桑叶300g混合均匀， 加入 到装有5L提取溶液的大烧瓶中， 所述提取溶液是含水量50的1， 3-丁二醇。 0027 将水浴温度设定到85， 搅拌浸提48小时， 然后用滤纸过滤(whatman公司)， 得滤 液3.72L。 用1M NaOH溶液， 将滤液pH值调至10。 使用旋转蒸发仪， 常温下将滤液减压浓缩至 800ml。 将得到的浓缩液上HPD400A大孔树脂柱吸附， 树脂柱的填充。
20、量为5Kg， 径高比为1： 4， 说 明 书 3/5 页 5 CN 106420932 A 5 反复上样3次， 静止吸附60分钟。 0028 先用4倍柱体积的去离子水淋洗树脂柱； 再用8倍柱体积的20碱性乙醇(NaOH， pH 10)淋洗； 然后用3倍柱体积的20乙醇淋洗至中性； 用6倍柱体积60乙醇将树脂上吸附 的提取物洗脱。 0029 将洗脱也减压蒸馏回收乙醇， 然后进行真空干燥， 并将干燥后的固体粉碎过100目 筛， 得到102.1g提取物， 记作组合物A。 0030 实施例2 0031 按照实施例1的方法， 分别使用1,000g的蚕沙、 桑白皮、 桑叶进行提取， 最后分别得 到78.4。
21、g组合物B、 104.3g组合物C、 以及112.8g组合物D。 0032 实施例3组合物增加胰岛素敏感性的效果测定 0033 1.II型糖尿病模型制作 0034 将高脂饲料喂养的大鼠空腹12h， 以30mg/kg的剂量一次性腹腔注射1链脲佐菌 素(用pH为4.24.4的0.1mol/L柠檬酸钠缓冲液溶解， 使用前配制)， 标准饮食组同步于腹 腔注射等剂量的柠檬酸钠缓冲液。 72h后STZ注射的大鼠剪尾尖静脉取血用空腹血糖(FBG， mmol/L)进行评估， 一触式血糖仪测FBG， 以血糖值13.8mmol/L为大鼠制模成功的标准。 0035 2.组合物治疗 0036 第1220周治疗阶段对糖。
22、尿病治疗组实施本发明组合物A、 B、 C、 D治疗。 提取物的 灌胃剂量为10g/kgd。 为做好对照， 其余大鼠也采用灌胃方式给予等体积生理盐水。 0037 3.血糖测定 0038 各组动物在实验期间每周在同一时刻测FBG一次， 测FBG前将大鼠禁食不禁水12h， 次日鼠尾尖静脉取血， 用一触式血糖仪测定血糖浓度并做好相关记录。 0039 4.口服葡萄糖耐量试验 0040 于治疗阶段结束时进行口服糖耐量试验(OGTT)。 空腹12h大鼠尾尖静脉采血测空 腹血糖值记为0h的血糖值。 之后按2.0g/kg剂量用50糖溶液进行灌胃， 分别于30min、 60min、 120min取尾尖静脉血测血糖。
23、。 实验结束后绘制5个组大鼠OGTT曲线， 横坐标为时间 (min)， 纵坐标为血糖浓度(mmol/L)。 并计算曲线下面积(area under curve， AUC)来判断糖 耐量状态。 0041 AUC(h.mmol/L)1/40h+1/20.5h+3/41h+2h。 (公式1) 0042 实验过程 0043 30只雄性SD大鼠在动物房自由饮食饮水以适应新环境， 为期1周。 随机分成N(正常 组)、 M(糖尿病组)、 M+A(糖尿病治疗组， 投入本发明的提取物A)、 M+B(糖尿病治疗组， 投入本 发明的提取物B)、 M+C(糖尿病治疗组， 投入本发明的提取物C)、 M+D(糖尿病治疗组。
24、， 投入本 发明的提取物D)6个实验组， 每组5只。 N组全程普通饲料饲养， M(糖尿病组)、 M+A(糖尿病治 疗组)、 M+B(糖尿病治疗组)、 M+C(糖尿病治疗组)、 M+D(糖尿病治疗组)高脂阶段持续12周， 然后腹腔注射1STZ(30mg/kg)， 为消除变量影响以同样方式给N组大鼠注射等量的柠檬酸 缓冲液。 72h后STZ注射的大鼠剪尾尖静脉取血用空腹血糖(FBG， mmol/L)进行评估， 一触式 血糖仪测FBG， 以血糖值13.8mmol/L为大鼠制模成功的标准。 制模成功后治疗组进入治疗 阶段， 分别使用提取物A、 B、 C、 D组合物的水溶液(10g/kgd)进行灌胃， 。
25、并灌胃给药持续8 周。 第20周实验结束时进行OGTT试验； 然后处死大鼠， 对血浆进行相关的生化检测， 病理分 说 明 书 4/5 页 6 CN 106420932 A 6 析肝脏的结构形态情况， Western blot方法检测脂肪酸合成相关基因。 0044 实验结果 0045 1.提取物A对于降血脂TC(总胆固醇)、 TG(甘油三酯)水平具有更好的效果 0046 如图1和图2所示， 与糖尿病大鼠比， 本发明提取物A、 B、 C、 D治疗组的TC、 TG， 均有下 降， 但是本发明提取物A治疗组显著下降(P0.05)， 几乎达到正常小鼠水平， 因此， 与提取物 B、 C、 D相比， 本发明。
26、的提取物A对于降低血脂具有更好的效果。 0047 2.提取物A对于增加胰岛素敏感性显示更好的效果 0048 为了评估大鼠的在本发明提取物给药治疗后的糖耐量状况， 在实验结束时进行 OGTT试验， 如图3， OGTT实验在0， 30， 60， 120min时的血糖情况。 糖尿病组大鼠AUC显著高于正 常大鼠(P0.05)， 如图4所示， 与糖尿病组比较， 本发明提取物A、 B、 C、 D治疗组的AUC均显著 减低， 且与提取物B、 C、 D相比， 本发明的提取物A对于增加胰岛素敏感性具有更好的效果。 说 明 书 5/5 页 7 CN 106420932 A 7 图1 图2 说 明 书 附 图 1/2 页 8 CN 106420932 A 8 图3 图4 说 明 书 附 图 2/2 页 9 CN 106420932 A 9 。