《一种蓝莓叶提取物提取方法及其应用.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种蓝莓叶提取物提取方法及其应用.pdf（9页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610841659.9 (22)申请日 2016.09.22 (71)申请人 三峡大学 地址 443002 湖北省宜昌市大学路8号 申请人 宜昌扬子果园生态农业有限公司 (72)发明人 喻玲玲 罗伟 吴红艳 刘森 胥道明 谭潇 (74)专利代理机构 宜昌市三峡专利事务所 42103 代理人 蒋悦 (51)Int.Cl. A61K 36/45(2006.01) A61P 39/06(2006.01) A61Q 19/08(2006.01) A61P 17/00(2006.01。
2、) A61P 35/00(2006.01) A61Q 19/02(2006.01) (54)发明名称 一种蓝莓叶提取物， 提取方法及其应用 (57)摘要 本发明提供一种蓝莓叶提取物， 该提取物包 括0.2%醋酸-乙醇提取物、 95%乙醇提取物、 水提 取物， 具体制备方法是将蓝莓鲜叶于鼓风干燥箱 50烘干、 粉碎后， 于锥形瓶中， 按料液比加入为 0.2%醋酸-乙醇的混合溶液、 95%乙醇、 或水后， 50 水浴加热提取1 h， 重复2次， 过滤， 合并滤液并 浓缩干燥得到相应的提取物； 将该提取物用DMSO 配制成0.1gmL-1供试液， 即为0.2%醋酸-乙醇 提取物、 95%乙醇提取物、。
3、 水提取物。 本发明合成 工艺简单， 蓝莓叶提取的化合物中对L929细胞均 没有毒性， 对DPPH具有显著的清楚作用， 且能显 著抑制络氨酸酶活性。 权利要求书1页 说明书4页 附图3页 CN 106420890 A 2017.02.22 CN 106420890 A 1.一种蓝莓叶提取物， 其特征在于， 该提取物包括如下5种主要化合物， 具体为3,3, 4 ,6,7-五羟基黄酮-5-O-木糖、 5-羟基-4 -甲氧基黄酮-3,7-二鼠李糖、 3,3 ,4 -三羟基黄 酮-7-O-鼠李糖 （1-6） -O-葡萄糖、 3,3 ,4 ,6,7-五羟基黄酮-5-O-鼠李糖 （1-6） -O-木糖、 。
4、4 , 5-二羟基-2 ,7-二甲氧基-8-异戊烯基黄酮。 2.一种蓝莓叶提取物， 其特征在于， 该提取物包括如下10种主要化合物， 具体为绿原 酸、 3,3 ,4 ,6,7-五羟基黄酮-5-O-木糖、 5-羟基-4 -甲氧基黄酮-3,7-二鼠李糖、 芦丁、 异 槲皮素、 3,3 ,4 -三羟基黄酮-7-O-鼠李糖 （1-6） -O-葡萄糖、 3,3 ,4 ,6,7-五羟基黄酮-5- O-鼠李糖 （1-6） -O-木糖、 槲皮素-3-O-阿拉伯糖苷、 槲皮素-3-O-鼠李糖苷、 4 ,5-二羟基- 2 ,7-二甲氧基-8-异戊烯基黄酮。 3.权利要求1或2所述的蓝莓叶提取物为0.2%醋酸-乙醇。
5、提取物， 其特征在于， 为0.2%醋 酸-乙醇提取物的提取方法如下： （1） 取蓝莓鲜叶于鼓风干燥箱50烘干至恒重， 粉碎得蓝莓叶备用； （2） 取粉碎的蓝莓叶于锥形瓶中， 按料液比1:10加入为0.2%醋酸-乙醇的混合溶液， 50 水浴加热提取1 h， 重复2次， 过滤， 合并滤液并浓缩干燥得到为0.2%醋酸-乙醇提取物； （3） 将为0.2%醋酸-乙醇提取物用DMSO配制成0.1gmL-1供试液， 即为0.2%醋酸-乙醇提 取物。 4.权利要求3所述的蓝莓叶提取物为0.2%醋酸-乙醇提取物， 其特征在于， 0.2%醋酸-乙 醇的混合溶液是指100mL乙醇溶液中含有0.2mL的醋酸溶液的混合。
6、溶液。 5.权利要求1或2所述的蓝莓叶提取物为95%的乙醇提取物， 其特征在于， 体积浓度为 95%的乙醇提取物的提取方法如下： （1） 取蓝莓鲜叶于鼓风干燥箱50烘干至恒重， 粉碎得蓝莓叶备用； （2） 取蓝莓叶于锥形瓶中， 按料液比1： 10加入体积浓度为95%乙醇； 500W超声提取0.5 h， 重复2次， 过滤， 合并滤液并浓缩干燥得到体积浓度为95%的乙醇提取物； （3） 将体积浓度为95%的乙醇提取物用DMSO配制成0.1gmL-1供试液， 即为95%乙醇提取 物。 6.权利要求1或2所述的蓝莓叶提取物为水提取物， 其特征在于， 水提取物的提取方法 如下： （1） 取蓝莓鲜叶于鼓风。
7、干燥箱50烘干至恒重， 粉碎得蓝莓叶备用； （2） 取蓝莓叶于锥形瓶中， 按料液比1： 10加入水， 500W超声提取0.5 h， 重复2次， 过滤， 合并滤液并浓缩干燥得到水提取物； （3） 将水提取物用DMSO配制成0.1gmL-1供试液， 即为水提取物。 7.蓝莓叶的95%乙醇提取物、 蓝莓叶的水提取物、 蓝莓叶的0.2%醋酸-乙醇提取物在制 备抗氧化活性的药物上的应用。 8.蓝莓叶的95%乙醇提取物、 蓝莓叶的水提取物、 蓝莓叶的0.2%醋酸-乙醇提取物在制 备抑制络氨酸酶活性的药物上的应用。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 106420890 A 2 一种蓝莓叶提取物， 提。
8、取方法及其应用 技术领域 0001 本发明涉及一种蓝莓叶提取物及其提取方法， 该蓝莓叶提取物具有抗氧化活性 剂、 抑制络氨酸酶的活性。 背景技术 0002 蓝莓(Blueberry)， 属杜鹃花科(Ericaceae)越橘属(Vaccinium.spp)多年生落叶 或常绿灌木。 除果实风味独特营养丰富外， 蓝莓叶也可入药。 蓝莓叶性温、 味苦， 有利尿、 解 毒之功效， 研究发现蓝莓叶中存在大量黄酮类物质。 黄酮类化合物分子中含有多电子的羟 基部分， 使其具有良好的抗氧化性能。 最近日本研究人员又报道蓝莓叶中存在一种黄酮类 物质即原花青素， 是一种高活性、 无毒副作用天然物质， 具有较强清除自。
9、由基、 抗氧化能力。 0003 拥有白皙亮丽的皮肤， 是现今社会大多数人对的追求。 人们希望通过物理或化学 方法达到美白的效果， 但随着美白化妆品中曲酸的泛滥使用出现的一系列问题， 美白产品 的安全性引起了广大研究者的重视。 而从天然植物中提取美白剂成为寻求新型美白剂的重 要方向之一。 发明内容 0004 本发明旨在从蓝莓叶中提取抗氧化物质， 就可更好地实现蓝莓叶的存在价值。 本 发明公开了一种提取蓝莓叶中的抗氧化物质的提取工艺， 寻求新型、 高效低毒的天然抗氧 化剂的制备方法， 提高蓝莓种植的经济效益。 0005 酪氨酸酶广泛存在于生物体内， 具有许多重要的生理功能。 在人体中， 酪氨酸酶是。
10、 黑色素生物合成途径中的主要限速酶。 因此， 本发明的另一目的在于提供一种蓝莓叶中具 有抑制酪氨酸酶的活性成分的物质， 对于蓝莓叶的深度开发利用具有重要意义。 具体如下： 0006 一种蓝莓叶提取物， 该提取物包括如下5种主要化合物， 具体为3,3 ,4 ,6,7-五羟 基黄酮-5-O-木糖、 5-羟基-4 -甲氧基黄酮-3,7-二鼠李糖、 3,3 ,4 -三羟基黄酮-7-O-鼠李 糖(1-6)-O-葡萄糖、 3,3 ,4 ,6,7-五羟基黄酮-5-O-鼠李糖(1-6)-O-木糖、 4 ,5-二羟基- 2 ,7-二甲氧基-8-异戊烯基黄酮。 0007 一种蓝莓叶提取物， 该提取物在上述主要化合。
11、物的基础上还包括如下10种主要化 合物， 具体为绿原酸、 3,3 ,4 ,6,7-五羟基黄酮-5-O-木糖、 5-羟基-4 -甲氧基黄酮-3,7-二 鼠李糖、 芦丁、 异槲皮素、 3,3 ,4 -三羟基黄酮-7-O-鼠李糖(1-6)-O-葡萄糖、 3,3 ,4 ,6,7- 五羟基黄酮-5-O-鼠李糖(1-6)-O-木糖、 槲皮素-3-O-阿拉伯糖苷、 槲皮素-3-O-鼠李糖苷、 4 ,5-二羟基-2 ,7-二甲氧基-8-异戊烯基黄酮。 0008 所述的蓝莓叶提取物为0.2醋酸-乙醇提取物， 0.2醋酸-乙醇提取物的提取方 法如下： 0009 (1)取蓝莓鲜叶于鼓风干燥箱50烘干至恒重， 粉碎得。
12、蓝莓叶备用； 0010 (2)取粉碎的蓝莓叶于锥形瓶中， 按料液比1:10加入为0.2醋酸-乙醇的混合溶 液， 50水浴加热提取1h， 重复2次， 过滤， 合并滤液并浓缩干燥得到为0.2醋酸-乙醇提取 说 明 书 1/4 页 3 CN 106420890 A 3 物； 0011 (3)将0.2醋酸-乙醇提取物用DMSO配制成0.1gmL-1供试液， 即为0.2醋酸-乙 醇提取物。 0012 0.2醋酸-乙醇的混合溶液是指100mL乙醇溶液中含有0.2mL的醋酸溶液的混合 溶液。 0013 所述的蓝莓叶提取物为95的乙醇提取物， 体积浓度为95的乙醇提取物的提取 方法如下： 0014 (1)取蓝。
13、莓鲜叶于鼓风干燥箱50烘干至恒重， 粉碎得蓝莓叶备用； 0015 (2)取蓝莓叶于锥形瓶中， 按料液比1： 10加入体积浓度为95乙醇； 500W超声提取 0.5h， 重复2次， 过滤， 合并滤液并浓缩干燥得到体积浓度为95的乙醇提取物； 0016 (3)将体积浓度为95的乙醇提取物用DMSO配制成0.1gmL-1供试液， 即为95乙 醇提取物。 0017 所述的蓝莓叶提取物还可以为水提取物， 水提取物的提取方法如下： 0018 (1)取蓝莓鲜叶于鼓风干燥箱50烘干至恒重， 粉碎得蓝莓叶备用； 0019 (2)取蓝莓叶于锥形瓶中， 按料液比1： 10加入水， 500W超声提取0.5h， 重复2。
14、次， 过 滤， 合并滤液并浓缩干燥得到水提取物； 0020 (3)将水提取物用DMSO配制成0.1gmL-1供试液， 即为水提取物。 0021 本发明将蓝莓叶的95乙醇提取物、 蓝莓叶的水提取物、 蓝莓叶的0.2醋酸-乙 醇提取物在制备抗氧化活性的药物上的应用。 0022 本发明进一步将蓝莓叶的95乙醇提取物、 蓝莓叶的水提取物、 蓝莓叶的0.2醋 酸-乙醇提取物在制备抑制络氨酸酶活性的药物上的应用。 0023 本发明提取工艺简单， 在蓝莓叶的95乙醇提取物、 蓝莓叶的水提取物、 蓝莓叶的 0.2醋酸-乙醇提取物中首次发现了化合物3,3 ,4 ,6,7-五羟基黄酮-5-O-木糖、 5-羟基- 。
15、4 -甲氧基黄酮-3,7-二鼠李糖、 3,3 ,4 -三羟基黄酮-7-O-鼠李糖(1-6)-O-葡萄糖、 3,3 , 4 ,6,7-五羟基黄酮-5-O-鼠李糖(1-6)-O-木糖、 4 ,5-二羟基-2 ,7-二甲氧基-8-异戊烯基 黄酮， 蓝莓叶提取的化合物中对L929细胞均没有毒性， 对DPPH具有显著的清楚作用， 且能显 著抑制络氨酸酶活性。 附图说明 0024 图1为不同蓝莓样品对L929细胞的细胞毒性检测， 其中， 1为蓝莓叶的0.2醋酸- 乙醇提取物， 2为蓝莓叶的95乙醇提取物， 3为蓝莓叶的水提取物。 0025 图2为不同蓝莓样品对DPPH自由基清除能力， 其中， 1为蓝莓叶的。
16、0.2醋酸-乙醇 提取物， 2为蓝莓叶的95乙醇提取物， 3为蓝莓叶的水提取物。 0026 图3为不同蓝莓样品的抑制络氨酸酶活性， 其中， 1为蓝莓叶的0.2醋酸-乙醇提 取物， 2为蓝莓叶的95乙醇提取物， 3为蓝莓叶的水提取物。 0027 图4为蓝莓叶的0.2醋酸-乙醇提取物的液相色谱图。 0028 图5为蓝莓叶的0.2醋酸-乙醇提取物的质谱图。 0029 图6为蓝莓叶的95乙醇提取物的液相色谱图。 0030 图7为蓝莓叶的水提取物的液相色谱图。 说 明 书 2/4 页 4 CN 106420890 A 4 具体实施方式 0031 实施例1 0032 1、 样品的制备 0033 蓝莓鲜叶1。
17、.3Kg于鼓风干燥箱50烘干至恒重， 粉碎得580g蓝莓叶备用。 2、 提取 0034 0.2醋酸-乙醇提取物的提取： 0035 取粉碎的蓝莓叶1g于锥形瓶中， 按料液比1:10加入体积浓度为0.2醋酸-乙醇， 50水浴加热提取1h， 重复2次， 过滤， 合并滤液并浓缩干燥得到体积浓度为0.2醋酸-乙 醇提取物； 0036 将体积浓度为0.2醋酸-乙醇提取物用DMSO配制成0.1gmL-1供试液， 0037 即为0.2醋酸-乙醇提取物(样品1)。 0038 95乙醇提取物： 0039 取蓝莓叶1g于锥形瓶中， 按料液比1： 10加入体积浓度为95乙醇； 500W超声提取 0.5h， 重复2次，。
18、 过滤， 合并滤液并浓缩干燥得到体积浓度为95的乙醇提取物； 0040 将体积浓度为95的乙醇提取物用DMSO配制成0.1gmL-1供试液， 即为95乙醇 提取物(样品2)。 0041 水提取物： 0042 取蓝莓叶1g于锥形瓶中， 按料液比1： 10加入水， 500W超声提取0.5h， 重复2次， 过 滤， 合并滤液并浓缩干燥得到水提取物； 0043 将水提取物用DMSO配制成0.1gmL-1供试液， 即为水提取物(样品3)。 0044 本实验考察了不同的提取溶剂(0.2醋酸-乙醇、 95乙醇、 水)和不同的提取方 法(加热回流提取和超声提取)， 结果发现提取溶剂和提取方法对蓝莓叶的提取率影。
19、响不 大， 3个样品的提取率分别为19.3、 19.9和26.1。 0045 针对上述活性的应用， 本申请进行了细胞毒活性、 抗氧化活性、 抑制络氨酸酶活性 实验， 具体如下： 0046 细胞毒活性 0047 细胞毒活性 0048 取对数生长期的成纤维L929细胞， 以2103个/ml细胞浓度接种于96孔板中， 每孔 100 l， 培养24h后加分别加蓝莓提取物100 l， 根据预试结果共设10、 1、 0.1mgml-13个浓 度， 每个浓度均设3个复孔， 继续培养72h。 用翻板法弃上清液， 每孔加0.5mgml-1的MTT溶液 100 l， 培养4h后每孔加DMSO 100 l， 振荡1。
20、0min， 使结晶物充分溶解， 用酶标仪测其在492nm 下的吸光度。 0049 细胞生长抑制率()1-(实验组OD-空白组OD均值)/(对照组OD均值-空白组OD 均值)100。 0050 上述中分别检测了24小时、 48小时和72小时蓝莓样品1、 2、 3对L929细胞的毒性， 结 果发现在本实验的药物浓度下蓝莓样品对L929细胞均没有毒性(结果见图1)。 0051 抗氧化活性 0052 用无水乙醇定容VC， 配成1.58mg/mL的标准溶液， 并用乙醇稀释成系列标准溶液。 取100 L待测液(0.01mgml-1)/标准溶液， 加2mL 0.2mmol/L的DPPH乙醇溶液， 充分混合，。
21、 室 说 明 书 3/4 页 5 CN 106420890 A 5 温避光静置20min， 于517nm处测其吸光度(A实 验)。 对照组用60 L的无水乙醇代替DPPH溶液 (A对 照)， 空白组用60 L无水乙醇代替样品(A空 白)， 各组平行测定3次， 按下式计算清除率。 0053 DPPH清除率/1(A实 验A对 照)/A空 白100 0054 对蓝莓样品清除DPPH自由基的能力进行研究， 结果表明， 蓝莓叶对DPPH自由基具 有显著的清除作用(结构见图2)。 0055 抑制酪氨酸酶活性 0056 将底物L-DOPA溶解在磷酸缓冲液(25mM， pH 6.8)中达到0.1mgmL-1浓。
22、度。 向96孔 板中分别加入40 L上述底物溶液， 80 L磷酸缓冲液(25mM， pH 6.8)。 样品孔加入40 L待测样 品， 空白孔加入40 L的磷酸缓冲溶液(pH 6.8)， 阳性对照孔中加入40 L曲酸溶液。 混匀， 加 入40 L酪氨酸酶的磷酸缓冲溶液(500UmL-1， 25mM， pH 6.8)。 在25下温孵10min， 然后在 490nm下测定每孔的吸光度。 根据在490nm下的吸光度计算化合物对酪氨酸酶的抑制率 ()： 0057 抑制率()(Atestsample-Ablank)/Acontrol)100 0058 上式中， Acontrol表示模型组(底物中加入了酪氨。
23、酸酶， 而没有加待测样品)在490nm 下的吸光度； Ablank表示空白组(底物中加入了待测样品， 而没有加酪氨酸酶)在490nm下的吸 光度； Atestsample表示样品组(底物中加入了待测样品和酪氨酸酶)在490nm下的吸光度。 0059 上述3种蓝莓叶提取物均能显著抑制酪氨酸酶活性， 分别为56.61、 73.31和 75.82， 结果见图3。 0060 LC及LC-MS分析蓝莓提取物主要化学成分分析 0061 将以上活性比较好的三个样品利用高效液相色谱(LC)分析其化学成分分析， 其液 相色谱条件为： 色谱柱Waters BEH C18(4.6mm250mm， 2 m)； 检测器。
24、PDA。 流动相乙腈(A) 水(B)， 线性梯度洗脱:0min5min， 55A； 5min10min， 520A； 10min20min， 2060A。 流速0.6mL/min； 柱温40； 检测波长375nm； 进样量5 L。 结果发现三个样品的 主要化学成分一样。 0062 为了进一步鉴定这些化学成分， 利用液质联用色谱LC-MS对样品1进行化学成分鉴 定。 液相色谱条件同上， 采用电喷雾离子源(ESI)， 负离子MRM模式测定， 离子源喷雾电压 4.5kV， 干燥气温度350， 碰撞气压力60kPa， 雾化气压力40kPa。 0063 通过质谱给出的分子量， 液相色谱提供的紫外吸收特征。
25、， 对本实验中蓝莓叶的 0.2醋酸-乙醇提取物的主要10个化学成分进行了初步指认， 均为黄酮及其苷类。 各峰的 分子量依次为： 354， 478， 592， 610， 464， 594， 624， 434， 448， 382道尔顿， 分别为绿原酸(1)、 3, 3 ,4,6,7-五羟基黄酮-5-O-木糖(2)、 5-羟基-4 -甲氧基黄酮-3,7-二鼠李糖(3)、 芦丁 (4)、 异槲皮素(5)、 3,3 ,4 -三羟基黄酮-7-O-鼠李糖(1-6)-O-葡萄糖(6)、 3,3 ,4 ,6,7-五 羟基黄酮-5-O-鼠李糖(1-6)-O-木糖(7)、 槲皮素-3-O-阿拉伯糖苷(8)、 槲皮素-3-O-鼠李糖 苷(9)、 4 ,5-二羟基-2 ,7-二甲氧基-8-异戊烯基黄酮(10)。 其中化合物2， 3， 6， 7， 10均为首 次在蓝莓中发现。 说 明 书 4/4 页 6 CN 106420890 A 6 图1 图2 说 明 书 附 图 1/3 页 7 CN 106420890 A 7 图3 图4 图5 说 明 书 附 图 2/3 页 8 CN 106420890 A 8 图6 图7 说 明 书 附 图 3/3 页 9 CN 106420890 A 9 。