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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610670246.9 (22)申请日 2016.08.14 (71)申请人 吴芊葭 地址 325600 浙江省温州市乐清市虹桥镇 杏二村 (72)发明人 吴芊葭 (51)Int.Cl. A61K 31/56(2006.01) A61K 31/546(2006.01) A61P 17/14(2006.01) C07J 63/00(2006.01) (54)发明名称 一种头孢呋辛酯的药物组合物及其医药用 途 (57)摘要 本发明公开了一种头孢呋辛酯的药物组合 物及其医药用途，。
2、 本发明提供的头孢呋辛酯的药 物组合物中含有头孢呋辛酯和一种结构新颖的 天然产物化合物()， 头孢呋辛酯和该天然产物 单独作用时， 对脱发具有治疗作用； 二者联合作 用时， 对脱发的治疗效果进一步提高， 可以开发 成治疗脱发的药物。 本发明与现有技术相比具有 突出的实质性特点和显著的进步。 权利要求书1页 说明书6页 CN 106309451 A 2017.01.11 CN 106309451 A 1.一种头孢呋辛酯的药物组合物， 其特征在于： 包括头孢呋辛酯、 化合物()和药学上 可以接受的载体， 制备成需要的剂型； 所述化合物()具有如下结构式： 2.根据权利要求1所述的头孢呋辛酯的药物组。
3、合物， 其特征在于： 药学上可以接受的载 体包括稀释剂、 赋形剂、 填充剂、 粘合剂、 湿润剂、 崩解剂、 吸收促进剂、 表面活性剂、 吸附载 体或润滑剂。 3.根据权利要求1所述的头孢呋辛酯的药物组合物， 其特征在于： 所述剂型包括片剂、 胶囊剂、 口服液、 口含剂、 颗粒剂、 冲剂、 丸剂、 散剂、 膏剂、 丹剂、 混悬剂、 粉剂、 溶液剂、 注射 剂、 栓剂、 喷雾剂、 滴剂或贴剂。 4.根据权利要求1所述的头孢呋辛酯的药物组合物， 其特征在于： 化合物()是从防风 中分离出来的天然化合物， 它包含以下分离步骤： (a)将防风粉碎， 用7585乙醇热回流 提取， 合并提取液， 浓缩至无醇。
4、味， 依次用石油醚、 乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取， 分别得 到石油醚萃取物、 乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物； (b)步骤(a)中正丁醇取物用大孔树脂 除杂， 先用25乙醇洗脱8个柱体积， 再用70乙醇洗脱12个柱体积， 收集70洗脱液， 减压 浓缩得70乙醇洗脱浓缩物； (c)步骤(b)中70乙醇洗脱浓缩物用正相硅胶分离， 依次用 体积比为85:1、 45:1、 25:1和15:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到4个组分； (d)步骤(c)中组 分4用正相硅胶进一步分离， 依次用体积比为20:1、 15:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得 到3个组分； (e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键。
5、合的反相硅胶分离， 用体积百分浓度为 72的甲醇水溶液等度洗脱， 收集1016个柱体积洗脱液， 洗脱液减压浓缩得到化合物 ()。 5.根据权利要求4所述的化合物()的制备方法， 其特征在于： 所述大孔树脂为D101型 大孔吸附树脂。 6.权利要求14任一所述的头孢呋辛酯的药物组合物在制备治疗脱发的药物中的应 用。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 106309451 A 2 一种头孢呋辛酯的药物组合物及其医药用途 技术领域 0001 本发明属于生物医药领域， 涉及头孢呋辛酯的新用途， 具体涉及头孢呋辛酯的药 物组合物及其在脱发中的应用。 背景技术 0002 头孢呋辛酯为头孢呋辛的乙酰乙。
6、酯。 在体内水解后释出头孢呋辛而发挥其抗菌活 性， 头孢呋辛酯之作用机制、 抗菌谱和抗菌作用皆与头孢呋辛同。 与其他口服头孢菌素相 比， 头孢呋辛酯对革兰阳性球菌包括肺炎双球菌、 A组(溶血性)链球菌和金葡菌作用并不 弱， 而对革兰阴性菌如淋球菌、 流感杆菌、 卡他摩拉菌和大肠杆菌科等的作用则优于头孢克 洛(cefaclor)。 头孢呋辛酯为第二代头孢菌素类抗生素。 口服经胃肠道吸收后， 在酯酶作用 下迅速水解为头孢呋辛而发挥抗菌作用。 对革兰阳性球菌的活性与第一代头孢菌素相似或 略差， 但对葡萄球菌和革兰阴性杆菌产生的 内酰胺酶显得相当稳定。 除耐甲氧西林葡萄球 菌、 肠球菌属和李斯特菌属外。
7、， 其他阳性球菌(包括厌氧球菌)对头孢呋辛酯均敏感。 头孢呋 辛酯对金黄色葡萄球菌的抗菌活性较头孢唑啉差， 12mg/L的头孢呋辛酯可分别抑制对青 霉素敏感和耐药的全部金黄色葡萄球菌。 0003 迄今为止， 尚未见头孢呋辛酯及其药物组合物与脱发的相关性报道。 发明内容 0004 本发明的目的在于提供一种头孢呋辛酯的药物组合物， 该药物组合物中含有头孢 呋辛酯和一种结构新颖的天然产物， 头孢呋辛酯和该天然产物可以协同治疗脱发。 0005 本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的： 0006 一种头孢呋辛酯的药物组合物， 包括头孢呋辛酯、 化合物()和药学上可以接受的 载体， 制备成需要的剂。
8、型； 所述化合物()具有如下结构式： 0007 0008 进一步地， 药学上可以接受的载体包括稀释剂、 赋形剂、 填充剂、 粘合剂、 湿润剂、 崩解剂、 吸收促进剂、 表面活性剂、 吸附载体或润滑剂。 进一步地， 所述剂型包括片剂、 胶囊 剂、 口服液、 口含剂、 颗粒剂、 冲剂、 丸剂、 散剂、 膏剂、 丹剂、 混悬剂、 粉剂、 溶液剂、 注射剂、 栓 说 明 书 1/6 页 3 CN 106309451 A 3 剂、 喷雾剂、 滴剂或贴剂。 0009 进一步地， 所述剂型包括片剂、 胶囊剂、 口服液、 口含剂、 颗粒剂、 冲剂、 丸剂、 散剂、 膏剂、 丹剂、 混悬剂、 粉剂、 溶液剂、 。
9、注射剂、 栓剂、 喷雾剂、 滴剂或贴剂。 0010 进一步地， 化合物()是从防风中分离出来的天然化合物， 它包含以下分离步骤： (a)将防风粉碎， 用7585乙醇热回流提取， 合并提取液， 浓缩至无醇味， 依次用石油醚、 乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取， 分别得到石油醚萃取物、 乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取 物； (b)步骤(a)中正丁醇取物用大孔树脂除杂， 先用25乙醇洗脱8个柱体积， 再用70乙 醇洗脱12个柱体积， 收集70洗脱液， 减压浓缩得70乙醇洗脱浓缩物； (c)步骤(b)中70 乙醇洗脱浓缩物用正相硅胶分离， 依次用体积比为85:1、 45:1、 25:1和15:1的二氯甲烷-甲。
10、 醇梯度洗脱得到4个组分； (d)步骤(c)中组分4用正相硅胶进一步分离， 依次用体积比为20: 1、 15:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分； (e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷 键合的反相硅胶分离， 用体积百分浓度为72的甲醇水溶液等度洗脱， 收集1016个柱体 积洗脱液， 洗脱液减压浓缩得到化合物()。 0011 进一步地， 化合物()的制备方法中， 所述大孔树脂为D101型大孔吸附树脂。 0012 上述头孢呋辛酯的药物组合物在制备治疗脱发的药物中的应用。 0013 本发明的优点： 0014 本发明提供的头孢呋辛酯的药物组合物中含有头孢呋辛酯和一种结构新颖的天 然产物，。
11、 头孢呋辛酯和该天然产物单独作用时， 对脱发具有治疗作用； 二者联合作用时， 对 脱发的治疗效果进一步提高， 可以开发成治疗脱发的药物。 本发明与现有技术相比具有突 出的实质性特点和显著的进步。 具体实施方式 0015 下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容， 但并不以此限定本发明保护范 围。 尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明， 本领域的普通技术人员应当理解， 可以对 本发明的技术方案进行修改或者等同替换， 而不脱离本发明技术方案的实质和范围。 0016 实施例1： 化合物()分离制备及结构确证 0017 分离方法： (a)将防风(2kg)粉碎， 用80乙醇热回流提取(15L3次)，。
12、 合并提取 液， 浓缩至无醇味(3L)， 依次用石油醚(3L3次)、 乙酸乙酯(3L3次)和水饱和的正丁醇 (3L3次)萃取， 分别得到石油醚萃取物、 乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物； (b)步骤(a)中 乙酸乙酯萃取物用D101型大孔树脂除杂， 先用25乙醇洗脱8个柱体积， 再用70乙醇洗脱 12个柱体积， 收集70洗脱液， 减压浓缩得70乙醇洗脱浓缩物； (c)步骤(b)中70乙醇洗 脱浓缩物用正相硅胶分离， 依次用体积比为85:1(10个柱体积)、 45:1(8个柱体积)、 25:1(10 个柱体积)和15:1(8个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到4个组分； (d)步骤(c)中组分 4。
13、用正相硅胶进一步分离， 依次用体积比为20:1(10个柱体积)、 15:1(8个柱体积)和1:1(6个 柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分； (e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合 的反相硅胶分离， 用体积百分浓度为72的甲醇水溶液等度洗脱， 收集1016个柱体积洗 脱液， 洗脱液减压浓缩得到化合物()(HPLC归一化纯度大于98)。 0018 结构确证： HR-ESI-MS显示M+H+为m/z 469.3238， 结合核磁特征可得分子式为 C30H44O4， 不饱和度为9。 核磁共振氢谱数据 H(ppm， CDCl3， 600MHz)： H-1(1.49， m)， H-1(2.。
14、87， 说 明 书 2/6 页 4 CN 106309451 A 4 ddd， J13.3， 7.0， 4.2Hz)， H-2(2.41， ddd， J15.4， 6.8， 4.2Hz)， H-2(2.65， ddd， J15.4， 11.2， 7.0Hz)， H-5(1.37， d， J11.2Hz)， H-6(1.68， m)， H-6(1.93， m)， H-7(1.73， m)， H-7 (1.87， m)， H-9(1.60， d， J9.4Hz)， H-11(4.17， d， J9.1Hz)， H-15(5.43， d， J10.3Hz)， H- 16(5.52， d， J10.3。
15、Hz)， H-18(2.46， d， J8.4Hz)， H-19(1.41， m)， H-20(1.10， m)， H-21 (1.28， m)， H-21(1.48， m)， H-22(1.36， m)， H-22(1.51， m)， H-23(1.32， s)， H-24(9.82， s)， H- 25(1.06， s)， H-26(1.17， s)， H-27(1.24， s)， H-28(0.87， s)， H-29(0.90， d， J6.3Hz)， H-30 (0.93， d， J6.1Hz)， OH-11(3.13， s)， OH-12(4.73， brs)； 核磁共振碳谱数据 。
16、C(ppm， CDCl3， 125MHz)： 39.2(CH2， 1-C)， 22.3(CH2， 2-C)， 207.6(C， 3-C)， 34.5(C， 4-C)， 63.2(CH， 5-C)， 20.4 (CH2， 6-C)， 40.9(CH2， 7-C)， 57.8(C， 8-C)， 51.6(CH， 9-C)， 38.2(C， 10-C)， 71.9(CH， 11-C)， 146.7(C， 12-C)， 119.2(C， 13-C)， 36.3(C， 14-C)， 128.9(CH， 15-C)， 139.5(CH， 16-C)， 41.4 (C， 17-C)， 47.3(CH， 18。
17、-C)， 40.1(CH， 19-C)， 40.7(CH， 20-C)， 30.7(CH2， 21-C)， 39.2(CH2， 22- C)， 22.3(CH3， 23-C)， 201.1(CH， 24-C)， 15.7(CH3， 25-C)， 19.4(CH3， 26-C)， 20.9(CH3， 27-C)， 19.1(CH3， 28-C)， 17.2(CH3， 29-C)， 21.3(CH3， 30-C)。 红外波谱表明该化合物含有羟基 (3478cm-1)， 羰基(1760cm-1)， 双键(1663cm-1)和醛基(1641cm-1)。 13C-NMR、 DEPT和HSQC谱中 显示有。
18、30个碳信号， 包括七个甲基， 六个亚甲基， 九个次甲基(一个连氧碳和两个烯烃碳， 一 个醛基)， 以及八个季碳(一个酮基， 一个含氧烯属季碳， 一个烯属季碳)， 以上功能结构再结 合不饱和数表明该化合物为五环三萜结构。 1H-NMR谱结合HSQC谱显示的五个叔甲基质子信 号 H 1.32(3H， s)， 1.06(3H， s)， 1.17(3H， s)， 1.24(3H， s)和0.87(3H， s)， 两个仲甲基质子信 号 H 0.90(3H， d， J6.3Hz)， 0.93(3H， d， J6.1Hz)以及1H-NMR数据表明该化合物为乌苏烷 型三萜类化合物。 HMBC谱中H-5和H3。
19、-23与C-24的相关性表明C-4位连有一个醛基， NOESY谱 中H-24与H3-25的相关信号暗示醛基处在 位。 从红外谱中可知结构中含有羟基， 而从1H-NMR 数据可知含有两个羟基。 HMBC谱中H-9和H-18与C-12， H-18和H3-27与C-13， OH-12与C-12相 关信号以及它们的碳化学位移表明该化合物存在烯醇式结构， 羟基连接在C-12位与C-12和 C-13形成的双键构成烯醇式结构， 此外根据HMBC谱中OH-11与C-11的相关信号以及化学位 移确认另一个-OH连在C-11位。 另C-15与C-16也形成双键结构， C-3位形成酮基。 HMBC谱中 H3-23和。
20、H-24与C-3的相关性以及它们的碳化学位移进一步确证C-3位形成酮基。 综合氢谱、 碳谱、 HMBC谱和NOESY谱， 以及文献关于相关类型核磁数据， 可基本确定该化合物如下所示， 立体构型进一步通过ECD试验确定， 理论值与实验值基本一致。 0019 该化合物化学式及碳原子编号如下： 说 明 书 3/6 页 5 CN 106309451 A 5 0020 0021 实施例2： 药理作用 0022 脱发是一种最常见皮肤疾病。 长期以来， 人们一直致力于寻找和研发治疗脱发的 药物， 如糖皮质激素、 米诺地尔等。 然而到目前为止， 尚没有一种药物能完全治愈脱发， 且存 在较大的不良反应。 因此，。
21、 开发疗效确切、 无不良反应的防治脱发的药物具有重要的社会意 义和经济意义。 本实施例采用环磷酰胺(Cyclophosphamide， CTX)建立小鼠脱毛模型， 观察 药物对改善脱毛小鼠毛发生长的作用。 0023 1、 材料与方法 0024 1.1动物 0025 SPF级， 雄性C57BL/6小鼠， 体质量1820g， 上海斯莱克实验动物有限公司。 饲养环 境： 室温控制在2426， 光线每12h明暗交替， 自由进食， 隔日更换垫料。 0026 1.2试剂与样品 0027 头孢呋辛酯购自中国药品生物制品检定所。 化合物()自制， 制备方法见实施例1。 环磷酰胺(江苏恒瑞医药股份有限公司)。 。
22、CBA检测试剂盒(美国， BD公司)、 CD4检测试剂盒 (上海颖心实验室设备有限公司)、 CD8检测试剂盒(上海颖心实验室设备有限公司)。 0028 1.3仪器 0029 JEM-1010型电镜(日本， 日本电子公司)、 C6型流式细胞仪(美国， BD公司)、 MK3型酶 标仪(美国， Thermo公司)。 0030 1.4小鼠分组及模型制备 0031 C57BL/6小鼠用麻醉机麻醉。 麻醉后， 将松香和石蜡按1 1的比例混合加热融化， 并 均匀涂抹于项背部， 凝固变硬后揭去， 诱导生长期毛发， 每只小鼠脱毛面积约为2.0cm 2.0cm。 注意不要烫伤小鼠皮肤。 脱毛后9天(小鼠背部皮肤诱。
23、导生长期毛囊产生)， 根据随机 数字表， 将小鼠分为5组， 每组20只， 分别是空白对照组、 模型对照组、 头孢呋辛酯组 (280mgkg-1)、 化合物()组(280mgkg-1)、 头孢呋辛酯与化合物()组合物组 【140mgkg -1头孢呋辛酯+140mgkg-1化合物()】 。 所有小鼠脱毛区皮下注射CTX150mg/kg后， 模型组 任其自然生长， 空白对照组给予生理盐水(100mg/kg)灌胃治疗， 其他组药物灌胃治疗， 持续 8周。 说 明 书 4/6 页 6 CN 106309451 A 6 0032 1.5组织取材 0033 分别在给药后1、 2、 4、 8周， 每组随机选取。
24、小鼠各5只， 行眼眶采血， 每只12mL。 用 于ELISA检测： 每组取2个血样， 加入EDTA抗凝， 3000r/min离心30min取上清， 于20保存 备用。 用于流式细胞术检测： 每组取3个血样， 分离血清， 于-70保存备用。 所有动物取血后 立即处死， 取其脱毛区域皮肤组织。 经10福尔马林固定， 常规石蜡包埋， 石蜡切片， 切片厚 45 m， -80下保存备用。 0034 1.6 ELISA检测外周血CD4+、 CD8+表达水平 0035 样本室温下平衡20min。 设置标准品孔、 样本孔和空白孔。 空白孔什么都不加， 标准 品孔各加不同浓度的标准品50 L。 待测样本先加样本。
25、稀释液40 L， 再加待测样本10 L， 随后 标准品孔和样本孔(空白孔不加)加入辣根过氧化物酶标记的检测抗体100 L， 用封板膜封 住反应孔， 37恒温箱孵育60min。 弃去液体， 吸水纸上拍干， 每孔加洗涤液， 静置1min， 甩去 洗涤液， 吸水纸上拍干， 重复5次。 所有孔加入底物A、 B各50 L， 37避光孵育15min。 加终止 液50 L， 15min内， 在450nm波长处测定各孔OD值。 统计CD4和CD8的OD值， 将CD4/CD8均值作为 结果进行统计分析。 0036 1.7统计学方法 0037 结果以均数标准差(xs)表示。 采用SPSS17.0统计软件分析数据，。
26、 组间比较应 用单因素方差分析。 0038 2、 实验结果 0039 2.1体质量变化和毛发生长情况 0040 小鼠经CTX诱导脱毛至实验结束， 各组小鼠体质量无明显差异(P0.05)。 脱毛小 鼠经头孢呋辛酯、 化合物()、 头孢呋辛酯与化合物()组合物给药后12周， 各组小鼠脱毛 区局部皮肤由粉色逐渐转变成灰黑色， 小鼠脱毛区皮肤灰黑色区域明显比模型组和生理盐 水组要大； 给药至48周， 各组小鼠脱毛区呈黑色， 且有毛发逐渐长出、 伸长。 给药组毛发相 对于模型组和生理盐水组， 毛发更为致密。 0041 2.2对脱毛小鼠外周血CD4+/CD8+比值表达水平的影响 0042 头孢呋辛酯组、 。
27、化合物()组、 头孢呋辛酯组与化合物()组合物组外周血CD4+/ CD8+比值随着时间的延长， 呈下降趋势。 1、 2、 3、 4周， 与模型对照组比， 头孢呋辛酯组与化合 物()组合物组外周血CD4+/CD8+比值显著下降(P0.01)； 与模型对照组比， 头孢呋辛酯组、 化合物()组外周血CD4+/CD8+比值下降(P0.05)。 试验结果见表1。 0043 表1对脱毛小鼠外周血CD4+/CD8+比值表达水平的影响 0044 组别1周2周3周4周 模型对照组5.480.065.370.054.990.094.830.11 头孢呋辛酯组5.150.054.760.064.400.174.12。
28、0.08 化合物()组4.870.024.340.134.160.063.650.27 头孢呋辛酯与化合物()组合物组3.940.043.670.023.290.252.940.08 0045 脱毛模型最常用实验动物为C57BL/6小鼠， 由于其为有色种属， 皮肤颜色随毛囊的 发育而表现不同的颜色， 是研究毛囊发育和再生一种很好的实验动物。 0046 目前关于脱发的病理生理机制尚未明确， 可能的原因主要与局部感染、 神经毒物、 说 明 书 5/6 页 7 CN 106309451 A 7 精神抑郁、 内分泌因素等因素相关。 近年来随着遗传、 基因、 分子水平的不断发展， 国内外诸 多学者认为脱。
29、发主要是一种由T细胞免疫介导的自身免疫性炎症疾病， 由于毛囊异常暴露 于潜在免疫活性的免疫系统， 再通过毛囊的抗原物质激活强大的免疫系统， 诱发释放大量 炎症， 继而引起脱发。 CD4+和CD8+T细胞在脱发患者毛囊内及周围的浸润是引起毛发脱落的 关键， CD8+T细胞一直被认为对毛囊发挥直接的细胞毒作用， 而CD4+T细胞起辅助细胞作用， 在脱发的发病过程中两者是共同发挥作用的。 0047 头孢呋辛酯、 化合物()、 头孢呋辛酯组与化合物()组合物维持治疗对脱毛小鼠 具有明显疗效， 显著改善了小鼠脱毛区的毛发生长情况， 通过下调外周血CD4+/CD8+比值来 发挥作用， 为临床脱发的药物治疗提供了新的治疗方案。 其中， 头孢呋辛酯和化合物()联 合作用时， 对毛发生长的改善作用效果显著， 优于头孢呋辛酯或化合物()单独的作用效 果， 可以开发成防治脱发的药物。 0048 上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容， 但并不以此限定本发明的保护 范围。 本领域的普通技术人员应当理解， 可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换， 而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。 说 明 书 6/6 页 8 CN 106309451 A 8 。