技术领域
本发明涉及细胞制剂技术领域，特别涉及一种软骨干细胞制剂及其制备方法和应用。
背景技术
关节软骨是一种黏弹性物质，不同活动部位表现不同的负荷-承载特性。关节软骨的这一重要特性及其减少关节表面摩擦的作用是软骨超微结构组成和化学构成的基本功能体现，关节软骨由稀疏的细胞排列而成，无血管、淋巴和神经供应。关节软骨在关节活动中起重要作用，其结构非常精细、科学，以适应不同的功能需要。创伤或运动损伤常导致关节软骨的急性损伤，引起关节疼痛、肿胀及功能障碍，严重影响患者的生活质量。
目前，关节软骨损伤的治疗方法主要包括：
1、关节清理和冲洗：关节镜下清理和冲洗对无局部症状的关节炎没有显著的长期疗效，只有在仔细筛选手术适应证，关节镜清理后才能获得一定疗效。
2、骨软骨骨折固定：首先用抛刀、锉或刮匙将无活性的坏死片段予以去除，对临床上不稳定的骨软骨病片段，X射线片上如果带有足够大的软骨下骨，可以给予固定。固定材料：无头的金属空心钉及生物可吸收材料。
3.、骨髓刺激技术：
(1)关节打磨成形术：打磨成形术是一种传统的关节镜下手术，利用抛刀和磨钻取出1～2mm的硬化骨质，打入到血管丰富的软骨下骨板，这样可以促进纤维凝块的形成，以后成为纤维软骨。
(2)显微骨折：微骨折技术修复关节软骨缺损是骨科临床和实验研究的热点之一，其是由软骨下钻孔术演变而来，同属于骨髓刺激技术。
4、软骨移植技术
综上所述，正常关节软骨的复杂性和组织上的高度特异性决定了关节软骨一旦损伤或失去后很难修复。目前还可通过工程支架来实现软骨修复，但方法存在组织相容性，并且很难控制支架的降解速度。
随着生物技术的发展，干细胞在治疗各种疾病模型中的研究愈来愈多，由于它具有自我更新并可分化成多种类型的细胞，有着广泛的应用前景，因此也被作为治疗关节软骨损伤的主要研究对象。但直接通过干细胞注射治疗关节软骨损伤存在细胞存活率偏低、细胞增殖困难的缺点。因此，急需提供一种可有效治疗关节软骨损伤的药物制剂。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种软骨干细胞制剂及其制备方法和应用。该软骨干细胞制剂可有效修复关节软骨损伤。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种软骨干细胞制剂，包括软骨干细胞和富血小板血浆(PRP)。
PRP释放多种高浓度的生长因子，其比例与体内正常比例相符，具有最佳的协同作用。既有单一因子的生物学效应，又有各种生长因子之间的相互作用。PRP中的血小板有促进凝血的作用，可刺激软骨组织再生，促进伤口愈合。本发明软骨干细胞制剂中PRP可明显减少注射间充质干细胞的死亡，并促进软骨干细胞的增殖及基质分泌，而不会影响到蛋白聚糖和胶原的类型。研究结果显示本发明软骨干细胞制剂可有效修复膝关节软骨损伤。
作为优选，软骨干细胞在软骨干细胞制剂中的浓度为(1～6)×107细胞/mL。
在本发明提供的实施例中，软骨干细胞在软骨干细胞制剂中的浓度为1×107细胞/mL。
在本发明提供的另一实施例中，软骨干细胞在软骨干细胞制剂中的浓度为3×107细胞/mL。
在本发明提供的另一实施例中，软骨干细胞在软骨干细胞制剂中的浓度为6×107细胞/mL。
作为优选，软骨干细胞制剂的pH值为6.5～7.5。
作为优选，软骨干细胞制剂的渗透压为280～320毫渗当量/升。
作为优选，软骨干细胞为自体软骨干细胞。
作为优选，富血小板血浆为自体富血小板血浆。
本发明还提供了该软骨干细胞制剂在制备修复关节损伤的药物中的应用。
在本发明提供的实施例中，关节为膝关节。
作为优选，药物的施用部位为关节腔内。
本发明还提供了该软骨干细胞制剂的制备方法，包括将软骨干细胞重悬于富血小板血浆中，得到软骨干细胞制剂。
在本发明提供的实施例中，软骨干细胞的制备方法为：将软骨组织剪碎，采用胰蛋白酶进行消化，然后采用II型胶原酶进行消化，得到单个细胞；单个细胞经原代培养、传代培养后，得到软骨干细胞。
作为优选，采用胰蛋白酶进行消化的温度为37℃，时间为1～2h。
作为优选，采用II型胶原酶进行消化的温度为37℃，时间为17～20h。
在本发明提供的实施例中，富血小板血浆的制备方法为：将外周血400g离心10min，分为3层；取上层和中层液体400g离心5min，分为3层；取上层和中层液体1200g离心5min，得到富血小板血浆。
本发明提供了一种软骨干细胞制剂及其制备方法和应用。该软骨干细胞制剂包括软骨干细胞和富血小板血浆。本发明具有的有益效果为：
1、本发明提供的软骨干细胞制剂可有效修复关节软骨损伤，效果好于透明质酸钠联合骨髓间充质干细胞的治疗效果；
2、作为优选，本发明采用的软骨干细胞或PRP完全是自身的，无毒、无免疫原性，对患者损伤小，不存在免疫排斥问题和传播疾病的危险；
3、作为优选，药物的施用部位为关节腔内，关节软骨修复都在关节腔内，可以防止软骨干细胞和血小板的流失，使其在局部长时间分泌生长因子，保持较高的生长因子浓度有利于软骨细胞归巢。
具体实施方式
本发明公开了一种软骨干细胞制剂及其制备方法和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的软骨干细胞制剂及其制备方法和应用中所用生物材料、试剂和仪器均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1软骨干细胞的分离及培养
①无菌条件下分离非受力部位关节软骨，剥离包裹软骨组织的筋膜和软骨膜，放入盛有PBS缓冲液的培养皿中。
②将分离得到的软骨组织剪碎成0.3-0.5mm的组织块，移入T25培养瓶，用含双抗的PBS缓冲液冲洗软骨3次。
③加入软骨体积19-15倍的0.25％胰蛋白酶，37℃消化1-2小时后终止消化。
④加入0.02％II型胶原酶，37℃消化17-20小时。
⑤在倒置显微镜下观察，当游离出单个细胞后，加入DMEM/F12完全培养基将II型胶原酶稀释终止消化。
⑥将细胞团吹打成单个细胞后用200目滤网过滤，收集滤液，1500rpm/min离心5min。
⑦弃上清，加入DS培养液重悬，0.2％台盼蓝染色，活细胞率大于90％，把细胞悬液稀释成(2～3)×105细胞/ml，接种于培养瓶放入CO2培养箱中培养。
⑧原代培养：将消化所得的细胞悬液以(2～3)×105细胞/ml接种于T25培养瓶中，每瓶加入5ml细胞悬液。把培养瓶置于CO2培养箱中培养(37℃，饱和湿度，5％CO2，95％空气)。48h后视细胞贴壁情况更换培养液，以后每两天更换培养液1次。
⑨传代培养：当倒置显微镜观察软骨细胞汇合度达90％，倾去培养液，加入0.25％胰蛋白酶2ml，室温下静止5～10min，在倒置显微镜下若观察到细胞皱缩变圆，个别细胞开始浮游，此时应迅速加入新鲜培养液终止消化，吹打细胞使其分散形成单个软骨细胞悬液，1500rpm/min离心5min，按照前述方法分瓶培养或冻存以备用。
实施例2 PRP的制备
①无菌采集获取自体外周全血10ml；
②转入15ml离心管，400g离心10min，此时分为3层，上层乏血小板血浆，中层富血小板，下层血细胞；
③转移上层和全部中层到新的15ml离心管，400g离心5min，此时分为3层，上层乏血小板血浆，中层富血小板，下层有少量血细胞；
④将上层和中层转移入新的15ml离心管，尽量不要吸到血细胞，1200g离心5min，留取需要体积的血浆，并重悬底部血小板，即得PRP。
实施例3注射制剂的制备
将实施例1获得的软骨干细胞经实施例2获得的PRP重悬为1×107细胞/ml，用于注射到患处。该细胞制剂的pH为7.2；渗透压范围为303毫渗当量/升之间。
实施例4注射制剂的制备
将实施例1获得的软骨干细胞经实施例2获得的PRP重悬为3×107细胞/ml，用于注射到患处。该细胞制剂的pH为7.3；渗透压为290毫渗当量/升。
实施例5注射制剂的制备
将实施例1获得的软骨干细胞经实施例2获得的PRP重悬为6×107细胞/ml，用于注射到患处。该细胞制剂的pH为7.4；渗透压为315毫渗当量/升之间。
实施例6膝关节软骨损伤治疗研究
采用本发明实施例3～5制得的注射制剂进行膝关节软骨损伤的治疗研究。具体试验方法如下：
取健康大白仔猪25头，随机分为5组：
实验组1：采用实施例3注射制剂进行治疗；
实验组2：采用实施例4注射制剂进行治疗；
实验组3：采用实施例5注射制剂进行治疗；
阳性对照组：骨髓间充质干细胞+透明质酸钠组
阴性对照组：生理盐水组。
通过双膝关节人为制造直径为5mm的圆斑损伤，建立膝关节软骨损伤模型。造模后，实验组关节上腔注射本发明0.5ml，阳性对照组关节上腔注射1％透明质酸钠+骨髓间充质干细胞0.5ml，阴性对照组关节上腔注射生理盐水0.5ml，一周1次，连续8周完成治疗。治疗结束后处死动物，进行病理学观察，根据Mankin骨关节病组织学分类方法，对软骨进行评分，记录积分。
阳性对照组干细胞制剂制备方法：采用1％透明质酸重悬骨髓间充质干细胞，细胞浓度为1×107细胞/ml，pH为7.35，渗透压为295毫渗当量/升。
阴性对照生理盐水的pH为6.9，渗透压为312毫渗当量/升。
各组猪膝关节软骨病理积分见下表：
表1猪膝关节软骨病理积分表
动物组别 病理积分 实验组1 5.16±0.37 实验组2 4.72±0.56 实验组3 3.34±0.78 阳性对照组 7.12±0.61 阴性对照组 12.58±0.97
由上表可以看出，实验组和阳性对照组均可显著改善猪膝关节软骨损伤，且实验组较阳性对照组亦有显著性差异，说明本发明注射制剂较透明质酸钠联合骨髓间充质干细胞治疗效果显著。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。