一种高糖激活的间充质干细胞注射液及其用于糖尿病药物的应用.pdf

摘要
申请专利号：	CN201610980888.9	申请日：	20161108
公开号：	CN106361771A	公开日：	20170201
当前法律状态：		有效性：	审查中
法律详情：
IPC分类号：	A61K35/28,A61K9/08,A61K47/42,A61K47/26,A61P3/10,C12N5/0775	主分类号：	A61K35/28,A61K9/08,A61K47/42,A61K47/26,A61P3/10,C12N5/0775
申请人：	北京恒峰铭成生物科技有限公司
发明人：	郝好杰,李梓源
地址：	100096 北京市昌平区回龙观镇科学园路28号院1号楼三层301
优先权：	CN201610980888A
专利代理机构：	北京市商泰律师事务所	代理人：	毛燕生
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内容摘要

本发明提供了一种高糖激活的间充质干细胞制备方法，一种高糖激活的间充质干细胞注射液及其在制备糖尿病药物方面的应用。所述高糖激活的间充质干细胞的制备方法为将分离提取的脐带、骨髓或脂肪间充质干细胞培养至融合达40～50％时，加入终浓度20～50mmol/L的葡萄糖溶液，培养48±2小时，所述间充质干细胞融合达75～80％时，消化、中和、洗涤并收集高糖激活的间充质干细胞。所述高糖激活的间充质干细胞注射液包括高糖激活的间充质干细胞、人血白蛋白、复方维生素、甘露醇、葡萄糖和生理盐水。所述高糖激活的间充质干细胞注射液可用于治疗2型糖尿病。

权利要求书

1.一种高糖激活的间充质干细胞的制备方法：其包括的步骤为：a)将分离提取的间充质干细胞在无血清培养基中培养至融合达40～50％的单层细胞；b)在步骤a)所述的单层细胞中加入终浓度20～50mmol/L的葡萄糖溶液；c)培养所述单层细胞融合达75～80％时，移去培养上清液，用胰蛋白酶-EDTA37℃消化1min，所述间充质干细胞收缩脱离瓶壁，加入所述移去的培养上清液，中和所述胰蛋白酶-EDTA，再使用移液管轻轻吹打，将细胞悬液移入50mL无菌离心管；d)加入无菌生理盐水，1000rpm离心并使用所述生理盐水洗涤三次，获得高糖激活的间充质干细胞。 2.根据权利要求1所述的制备方法，所述步骤b)中加入终浓度为20、30、40或50mmol/L的葡萄糖溶液。 3.根据权利要求1所述的制备方法，所述步骤c)中所述单层细胞融合达75～80％，所用培养时间为48±2小时。 4.一种高糖激活的间充质干细胞注射液，其包括以下组分：数量为5×10～2×10个/mL的高糖激活的间充质干细胞、质量体积比为1～5％的人血白蛋白、质量体积比为1～5％的复方维生素、质量体积比为1～8％的甘露醇、质量体积比为0.5～2.5％的葡萄糖和余量的生理盐水。 5.根据权利要求4所述的高糖激活的间充质干细胞注射剂，所述高糖激活的间充质干细胞为在无血清培养基中培养至融合达40～50％的单层细胞时加入终浓度为20～50mmol/L的葡萄糖溶液，连续培养48±2小时的间充质干细胞。 6.根据权利要求5所述的高糖激活的间充质干细胞注射剂，所述高糖激活的间充质干细胞为在无血清培养基中培养至融合达40～50％的单层细胞时加入终浓度20、30、40或50mmol/L的葡萄糖溶液，连续培养48±2小时的间充质干细胞。 7.根据4-6任一权利要求所述的高糖激活的间充质干细胞注射液，所述间充质干细胞选自人脐带、人骨髓、人脂肪组织或其组合，所述干细胞活力保持在95％以上。 8.根据4-7任一权利要求所述的高糖激活的间充质干细胞注射液在制备治疗糖尿病药物中的应用。 9.根据权利要求8所述的高糖激活的间充质干细胞注射液在制备治疗糖尿病药物中的应用，其特征在于，所述糖尿病为2型糖尿病。 10.根据权利要求8所述的高糖激活的间充质干细胞注射液在制备治疗糖尿病药物中的应用，所述干细胞注射液采用单次或多次输注的方案，且在所述间充质干细胞注射液在2小时内使用完毕。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，尤其涉及一种高糖激活的间充质干细胞的制备，一种高糖激活的间充质干细胞注射液及其用于糖尿病药物的应用。

背景技术

随着现代生活方式的改变，糖尿病的发病率越来越高，新近中国的一项调查研究发现，中国的糖尿病发病率近10％，即发病人口已经接近1亿，其中，95％是2型糖尿病(T2D)。T2D的发病机制是肥胖导致的慢性炎症而致的胰岛素抵抗，造成高血糖、以及持续的高血糖并进而导致的糖代谢与脂代谢紊乱，从而对胰岛beta细胞造成进行性损伤。因此，T2D的治疗包括两个方面的措施：一方面是使用降糖药物与胰岛素增敏剂改善高血糖状态，另一方面是使用外源的胰岛素以补充胰岛功能下降而引起的胰岛素分泌的不足。然而，目前的治疗方案尽管很多，仍然无法完全实现稳定控制血糖，引起胰岛功能不断的损毁，最后导致心脑血管、神经等系统并发症的出现。因此，寻找更好的治疗方法志在必行。

间充质干细胞(MSCs)是干细胞家族的重要成员，因其具有多向分化潜能、自我更新能力，以及分泌多种因子参与损伤的组织与器官的修复与再生而被广泛应用于多种疾病的治疗。MSCs在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为胰岛、神经、血管内皮、骨、软骨、肌肉、肝脏、心肌等多种组织细胞，除此之外，MSCs还具有低免疫原性和独特的免疫调节作用，能逃避免疫识别、抑制免疫应答，这就为同种异体使用提供基础。先前的研究证实，MSCs在特定条件下可以诱导分化为胰岛beta细胞，这为治疗糖尿病带来希望。

越来越多的研究证实MSCs通过分泌的细胞因子可发挥免疫调节与降低炎症的作用。由于MSCs是原始的修复细胞，生理状态下处于静止状态，当机体的稳态发生改变，它以非对称分裂的模式复制子代细胞处于修复再生以恢复机体稳态，即MSCs发挥作用的触发因素取决于其周围环境，环境因素负反馈触发MSCs的反应机制，产生修复与再生。T2D起源于肥胖导致体内慢性炎症的发生，长期的慢性炎症诱发的细胞对胰岛素的吸收存在障碍，也就是胰岛素抵抗，抵抗的持续，严重影响了细胞对糖的吸收，出现高血糖。前期的研究证实MSCs输注明显改善了T2D大鼠外周靶组织对胰岛素的抵抗，促进了细胞对葡萄糖的吸收。

然而，目前的MSCs，无论来源于脐带，还是自体骨髓或脂肪组织，均不是特异修复T2D的，这在很大程度上限制了MSCs的治疗效果。前期的文献报道，无论临床试验还是动物实验，用MSCs的输注治疗T2D均无法使高血糖恢复至正常水平，且经过一定的时间后血糖又有不同程度的升高。

基于上述问题，本发明进行研究，对MSCs进行处理，得到一种高糖负反馈调节激活了的间充质干细胞注射液，用于输注治疗T2D。

发明内容

针对通用型的间充质干细胞(MSCs)输注液治疗2型糖尿病(T2D)存在效率不高的问题，本发明提供了一种高糖激活的间充质干细胞制备方法，一种高糖激活的间充质干细胞注射液，其制备方法和在用于糖尿病药物中应用。

为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现：

一种高糖激活的间充质干细胞的制备方法：其包括的步骤为：a)将分离提取的间充质干细胞在无血清培养基中培养至融合达40～50％的单层细胞；b)在步骤a)的所述单层细胞中加入终浓度20～50mmol/L的葡萄糖溶液；c)培养所述单层细胞融合达75～80％时，移去培养上清液，用胰蛋白酶-EDTA 37℃消化1min，所述间充质干细胞收缩脱离瓶壁，加入所述移去的培养上清液，中和所述胰蛋白酶-EDTA，再使用移液管轻轻吹打，将细胞悬液移入50mL无菌离心管；d)加入无菌生理盐水，1000rpm离心并使用所述生理盐水洗涤三次，获得高糖激活的间充质干细胞。

进一步的，所述步骤b)中加入终浓度为20、30、40或50mmol/L的葡萄糖溶液。

进一步的，所述步骤c)中所述单层细胞融合达75～80％，所用培养时间为48±2小时。

进一步的，所述步骤d)中，加入50mL生理盐水，测定的高糖激活的间充质干细胞的浓度为5×105～2×106。

所述间充质干细胞选自人脐带、人骨髓、人脂肪组织或其组合，所述干细胞活力保持在95％以上。

一种高糖激活的间充质干细胞注射液，其包括以下组分：数量为5×105～2×106个/mL的高糖激活的间充质干细胞、质量体积比为1～5％的人血白蛋白、质量体积比为1～5％的复方维生素、质量体积比为1～8％的甘露醇、质量体积比为0.5～2.5％的葡萄糖和余量的生理盐水。

对上述技术方案的进一步改进，所述高糖激活的间充质干细胞注射剂中所述高糖激活的间充质干细胞为在无血清培养基中培养至融合达40～50％的单层细胞时加入终浓度为20～50mmol/L的葡萄糖溶液，连续培养48±2小时的间充质干细胞。

进一步的，所述高糖激活的间充质干细胞为在无血清培养基中培养至融合达40～50％的单层细胞时加入终浓度20、30、40或50mmol/L的葡萄糖溶液，连续培养48±2小时的间充质干细胞。

所述间充质干细胞选自人脐带、人骨髓、人脂肪组织或其组合，所述干细胞活力保持在95％以上。

一种高糖激活的间充质干细胞注射液的制备方法，其包括a)预先制备人血白蛋白、甘露醇注射液、复方维生素注射液和葡萄糖注射液，并4℃预冷备用；b)按照质量体积比配制人血白蛋白、甘露醇注射液、复方维生素注射液和葡萄糖注射液；c)将高糖激活的间充质干细胞重悬于步骤b)所述的注射液中，并加入余量的生理盐水。

上述的高糖激活的间充质干细胞注射液在制备治疗糖尿病药物中的应用，其特征在于，所述糖尿病为2型糖尿病。所述干细胞注射液采用单次或多次输注的方案，且在所述间充质干细胞注射液在2小时内使用完毕。

本发明的有益效果：

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：本发明采用人脐带、骨髓、脂肪组织的间充质干细胞，采用高糖浓度进行培养预处理，激活干细胞负反馈调节机制，明显增强了间充质干细胞发挥抗T2D的效应，改善了胰岛素抵抗，并促进胰岛beta细胞功能恢复。本发明制备的激活的间充质干细胞，经过简单的预处理，干细胞特性未见变化，本制备体系易于质量控制，易于产业化。本发明采用激活的间充质干细胞注射液优化治疗方案，采用多次输注治疗的策略，显著降低了T2D的胰岛素抵抗，并修复损伤的胰岛beta细胞，恢复糖尿病患者的胰岛功能。通过本发明提供了技术方案，明显提高了MSCs输注治疗T2D的效率，使得T2D的高血糖及胰岛素抵抗恢复到接近正常水平，使糖尿病患者达到摆脱胰岛素注射。

附图说明：

图1.正常大鼠和实施例5试验治疗组大鼠血糖浓度变化图。横坐标前面的0、3、7表示链脲佐菌素(STZ)处理MSC的时间，后面的7/14/21/28/35指MSC治疗后的时间；Normal指正常大鼠，T2D指2型糖尿病大鼠并采用空白治疗组，T2D+MSCs指2型糖尿病大鼠并采用未处理脐带间充质干细胞治疗组，T2D+激活MSCs指2型糖尿病大鼠并采用高糖激活的脐带间充质干细胞治疗组。

图2.正常大鼠和实施例5试验治疗组大鼠胰岛素抵抗指数(IR指数)比较图。

图3.T2D大鼠和间充质干细胞治疗组大鼠胰岛病理切片比较图。

图4.正常大鼠和实施例6试验治疗组大鼠血糖浓度变化图。横坐标前面的0、3、7表示STZ处理MSC的时间，后面的7/14/21/28/35指MSC治疗后的时间；Normal指正常大鼠，T2D指2型糖尿病大鼠并采用空白治疗组，T2D+MSCs指2型糖尿病大鼠并采用未处理脂肪间充质干细胞治疗组，T2D+激活MSCs指2型糖尿病大鼠并采用高糖激活的脂肪间充质干细胞治疗组。

图5.正常大鼠和实施例6试验治疗组大鼠胰岛素抵抗指数(IR指数)比较图。

具体实施方式

下面以具体实施方式对发明作进一步详细说明

本发明参照特定的实施例进行了描述，但是，很显然仍可以做出各种修改和变换而不违背本发明的精神和范围。因此，本发明的说明书和附图应该认为是说明性的而非限制性的。

实施例1.间充质干细胞的制备

一、脐带间充质干细胞的制备

在超净工作台中进行操作，取新鲜足月健康胎儿脐带，用含2倍100U/mL青霉素和链霉素的生理盐水冲洗去除血渍，将华尔通氏胶剥离，剪成1立方毫米以下块状，均匀涂布，缓慢加入10mL无血清培养基，置37℃、体积分数为5％的二氧化碳、饱和湿度培养箱中培养。将原代细胞培养7天后，更换无血清培养液，培养至细胞达到70％的融合，移去无血清培养液，添加浓度分别为0.25％和0.1％的胰蛋白酶-乙二胺四乙酸钠(EDTA)消化1min，脐带MSC收缩脱离瓶壁，此时加入先前移去的培养上清液，中和胰蛋白酶-EDTA溶液，并使用移液管轻轻吹打，将脐带MSC悬液移入50mL离心管。1000rpm离心8min，去除上清液；重新加入无血清完全培养基将MSC重悬，并计数。按照1传1.5接种10cm培养皿。MSC培养融合70％左右时参照上述方法传代培养。

选择第四代培养的MSC，在对数生长期，且细胞融合程度不超过80％时按照传代的要求消化、中和、洗涤、收集细胞，采用细胞冻存液(90％胎牛血清和10％二甲亚砜(DMSO))重悬MSC，充分混匀，每管1mL分装于冻存管密封。将冻存管置于装有异丙醇的冻存盒中，于-80℃冰箱过夜，次日移入液氮罐保存。

MSC复苏的步骤为：取出MSC冻存管，立即浸入37℃温水中溶解；取适量无血清培养基混悬细胞并离心，弃去上清液；细胞重悬于无血清培养基中，并接种于培养皿中，于37℃、体积分数为5％的二氧化碳、饱和湿度培养箱中培养。

二、骨髓间充质干细胞的制备

采用常规方法于髂前上棘穿刺点，用骨穿针抽取50mL骨髓液，注入50mL的无菌离心管中；用等量含20u/mL肝素的PBS液稀释，并沿管壁加入等体积的比重为1.073g/ml的淋巴细胞分离液；2000rmp离心30min，吸取单个核细胞层；无菌生理盐水离心洗涤2次，每次1000rpm离心5min，弃去上清液，取沉淀；将上述得到的骨髓MSC，用无血清培养基混悬，计数细胞，按5×106个/mL接种于的培养瓶中，置37℃体积分数为5％的二氧化碳、饱和湿度的培养箱中培养。培养3天后，更换无血清培养液，弃去未贴壁细胞，以后每3天1次更换培养液；7～9天后，骨髓MSC融合达50％～60％时，进行第一次传代。移去无血清培养液，采用浓度分别为0.25％和0.1％的胰蛋白酶-EDTA37℃消化1min，骨髓MSC收缩脱离瓶壁，加入先前移去的培养上清液，中和胰蛋白酶-EDTA，并使用移液管轻轻吹打，将骨髓间充质细胞悬液移入50mL无菌离心管中。1000rpm离心8min，弃去上清液；重新加入无血清完全培养基重悬，计数，按照1传1-1.5接种10cm培养皿。骨髓MSC培养融合70％左右时如上述方法传代培养。

三、脂肪间充质干细胞的制备

按照常规方法分离腹部白色脂肪组织，剔除可见微血管及肌肉组织，无菌PBS洗涤三遍，然后用无菌剪刀将脂肪组织剪碎至1立方毫米以下的糊状，添加无菌消化液(含有0.1％胶原酶Ⅰ型和0.05％胰蛋白酶的无血清DMEM培养基)，37℃水浴中匀速搅拌45-50min，至组织块消化干净；200目筛网过滤收集滤液，然后使用含有10％胎牛血清(FBS)的低糖DMEM培养基等量中和，1500rpm离心10min，弃去上清液；以1×106个/mL的细胞密度，用无血清培养基重悬脂肪MSC，并接种于培养瓶中，37℃、体积分数为5％二氧化碳、饱和湿度培养箱中培养，当脂肪MSC生长至接近80％融合时，使用0.25％胰蛋白酶溶液消化MSC细胞，以1：3的接种比例接种到新的培养瓶中进行传代培养。脂肪MSC融合至不超过80％，1000rpm离心8min，弃去上清液，重新加入无血清完全培养基重悬MSC，计数，按照1传1-1.5接种10cm培养皿。脂肪MSC培养融合70％左右时如上述方法传代培养。

实施例2.高糖激活的间充质干细胞的制备

高糖激活的间充质干细胞为加入一定浓度的葡萄糖溶液，培养一定时间后，测量培养的间充质干细胞数量，如果间充质干细胞的浓度能够达到5×105～2×106个/mL，表明葡萄糖溶液已成功激活间充质干细胞。

一、高糖激活的脐带间充质干细胞的制备

(1)

将实施例1中制备的脐带MSC在第四代细胞培养至40-50％单层细胞时，加入葡萄糖溶液，葡萄糖终浓度为20mmol/L，连续培养48小时；单层细胞融合达75％～80％时，移去培养上清液，用浓度分别为0.25％和0.1％的胰蛋白酶-EDTA 37℃消化1min，脐带MSC收缩脱离瓶壁，加入先前移去的培养上清液，中和胰蛋白酶-EDTA，并使用移液管轻轻吹打，将脐带MSC悬液移入50mL无菌离心管；加入等量的无菌生理盐水，离心，并用无菌生理盐水离心洗涤三次。第一次使用无菌生理盐水洗涤时，取脐带MSC样品进行计数，并测定活细胞比例，测定的MSC数量约为7×105个/mL，表明终浓度为20mmol/L的葡萄糖溶液能够成功激活脐带MSC，获得高糖激活的脐带MSC。

(2)

将实施例1中制备的脐带MSC在第四代细胞培养至40-50％单层细胞时，加入葡萄糖溶液，葡萄糖终浓度为30mmol/L，连续培养49小时；单层细胞融合达75％～80％时，移去培养上清液，并采用与上述(1)中相同的方法消化、中和、洗涤和收集激活的干细胞。第一次使用无菌生理盐水洗涤时，测出MSC数量约为9×105个/mL，表明终浓度为30mmol/L的葡萄糖能够成功激活脐带MSC，获得高糖激活的脐带MSC。

(3)

将实施例1中制备的脐带MSC在第四代细胞培养至40-50％单层细胞时，加入葡萄糖溶液，葡萄糖终浓度为40mmol/L，连续培养47小时；单层细胞融合达75％～80％时，移去培养上清液，并采用与上述(1)中相同的方法消化、中和、洗涤和收集激活的干细胞。第一次使用无菌生理盐水洗涤时，测出MSC数量约为8×105个/mL，表明终浓度为40mmol/L的葡萄糖能够成功激活脐带MSC，获得高糖激活的脐带MSC。

(4)

将实施例1中制备的脐带MSC在第四代细胞培养至40-50％单层细胞时，加入葡萄糖溶液，葡萄糖终浓度为50mmol/L，连续培养46小时；单层细胞融合达75％～80％时，移去培养上清液，并采用与上述(1)中相同的方法消化、中和、洗涤和收集激活的干细胞。第一次使用无菌生理盐水洗涤时，测出MSC数量约为1×106个/mL，表明终浓度为50mmol/L的葡萄糖能够成功激活脐带MSC，获得高糖激活的脐带MSC。

二、高糖激活的脂肪间充质干细胞的制备

将实施例1中制备的脂肪MSC在第四代细胞培养至40-50％单层细胞时，加入葡萄糖溶液，葡萄糖终浓度为30mmol/L，连续培养50小时；单层细胞融合达75％～80％时，移去培养上清液，用浓度为0.25％-胰蛋白酶37℃消化1min，脂肪MSC收缩脱离瓶壁，加入先前移去的培养上清液，中和胰蛋白酶，并使用移液管轻轻吹打，将MSC悬液移入50mL无菌离心管；加入等量的无菌生理盐水，离心，并用无菌生理盐水离心洗涤三次。第一次使用无菌生理盐水洗涤时，取MSC样品进行计数，并测定活细胞比例，测出MSC数量约为8×105个/mL，表明终浓度为30mmol/L的葡萄糖能够成功激活脂肪MSC。

三、高糖激活的骨髓间充质干细胞的制备

将实施例1中制备的骨髓MSC在第四代细胞培养至40-50％单层细胞时，加入葡萄糖溶液，葡萄糖终浓度为40mmol/L，连续培养47小时；单层细胞融合达75％～80％时，移去培养上清液，用浓度为0.25％-0.1％的胰蛋白酶-EDTA 37℃消化1min，骨髓MSC收缩脱离瓶壁，加入先前移去的培养上清液，中和胰蛋白酶-EDTA，并使用移液管轻轻吹打，将MSC悬液移入50mL无菌离心管；加入等量的无菌生理盐水，离心，并用无菌生理盐水离心洗涤三次。第一次使用无菌生理盐水洗涤时，取骨髓MSC样品进行计数，并测定活细胞比例，测出MSC数量约为8×105个/mL，表明终浓度为40mmol/L的葡萄糖能够成功激活骨髓MSC。

实施例3.高糖激活的间充质干细胞注射液的制备

一种高糖激活的间充质干细胞注射液，其包括以下组分：数量为5×105～2×106个/mL的高糖激活的间充质干细胞，质量体积比为1～5％人血白蛋白，质量体积比为1～8％甘露醇注射液，质量体积比为1～5％复方维生素注射液，质量体积比为1～5％的50％葡萄糖注射液和余量为生理盐水。

如配制100mL高糖激活的间充干细胞注射液，该注射液包括人血白蛋白原液5mL(质量体积比终浓度为1％)、甘露醇注射液2mL、复方维生素注射液3mL、50％葡萄糖注射液5mL、生理盐水85mL、的高糖激活的MSC。除高糖激活的MSC外，注射液其余成分需提前配制，并4℃预冷备用。MSC最终重悬注射液中，制成单细胞悬液，每毫升注射液中高糖激活的MSC的数量为5×105～2×106个。该制备好的高糖激活的MSC在2～10℃条件中，2小时内细胞保持为单细胞悬液状态，且细胞活力(台盼蓝染色计活力)保持在95％以上。本发明所述质量体积比均代表质量(g)与体积(ml)的比例。

人血白蛋白、复方维生素、甘露醇、葡萄糖均为临床注射液成分，可为细胞提供营养、利于细胞的新陈代谢、维持良好的干细胞体外微环境。

本发明的高糖激活的MSC注射液非常利于激活的MSC在体外混悬状态下微环境的稳定，利于干细胞维持活性，且临床输注安全。高糖激活的MSC在此混悬液中可短时间保持较高的活力，最大程度维持干细胞的特性，使得输注到体内的细胞能发挥更大的治疗潜能。

实施例4.SD大鼠2型糖尿病模型的建立

采用高脂肪、高糖饮食连续喂养大鼠30～40天，而后辅以40mg/kg注射链脲菌素。用血糖仪测定大鼠鼠尾血糖浓度，选取连续2次血糖浓度高于16.7mmol/L的大鼠作为糖尿病模型。

实施例5.高糖激活的脐带间充质干细胞注射液用于治疗糖尿病SD大鼠的实验

一、高糖激活的脐带间充质干细胞注射液移植治疗2型糖尿病大鼠

采用完全随机法将已成模的糖尿病大鼠分为3组，每组6只大鼠：(1)糖尿病空白治疗组，使用1mL无细胞注射液进行动物尾静脉注射，无细胞注射液包含质量体积比为1～5％人血白蛋白，质量体积比为1～8％甘露醇注射液，质量体积比为1～5％复方维生素注射液，质量体积比为1～5％的50％葡萄糖注射液和余量为生理盐水；(2)未处理脐带MSC治疗组，使用1mL注射液进行动物尾静脉注射，该注射液包含无细胞注射液和浓度为5×105～2×106个/mL的脐带MSC，脐带MSC参照实施例1的方法制备，直接收获后不做处理；(3)高糖激活的脐带MSC治疗组，使用1mL注射液进行动物尾静脉注射，该注射液包含无细胞注射液和浓度为5×105～2×106个/mL的高糖激活的MSC。本试验采用单次注射的方式。3组动物模型均于治疗前及治疗后测定空腹血糖、体总指数，于治疗后2周、4周检测完毕后处死，取胰岛进行石蜡包埋后HE染色观察胰岛再生状况。

二、试验结果

(1)高糖激活的脐带MSC注射液明显改善了T2D大鼠的高血糖状况。

在未处理的脐带MSC的治疗组，T2D大鼠的血糖浓度从注射后的48小时开始明显下调，2周时降低到14.7mmol/L，随后逐渐上升，3周时又超过20.00mmol/L。高糖激活脐带间充质干细胞治疗组，T2D大鼠的血糖浓度在注射后48小时开始明显下调，血糖浓度维持在较低水平，11.0～12.0mmol/L之间，且持续至少2周时间，至24天时血糖浓度开始呈增高趋势，至4周时接近16.0mmol/L。与两组脐带MSC治疗组相比，空白治疗对照组中T2D大鼠的血糖浓度持续维持在较高水平(见图1)。

(2)高糖激活的脐带MSC注射液明显改善了T2D大鼠的胰岛素抵抗指数

给药4周后，实验大鼠于处死前空腹12h，禁食不禁水，测完空腹血糖和体重后，乙醚麻醉大鼠，静脉采血，并采用放射免疫分析法测定空腹胰岛素、胰岛素C肽，计算稳态胰岛素评价(HOMA-IR)指数。HOMA-IR指数＝空腹血糖(mmol/L)×空腹胰岛素(mU/L)/22.5。如图2所示，空白治疗组的大鼠胰岛素抵抗在第7天和第21天的时候是未处理MSC治疗组和高糖激活的MSC治疗组的大鼠胰岛素抵抗的2倍和3倍，达到了显著地差异，且未处理MSC治疗组和高糖激活的MSC治疗组大鼠胰岛素抵抗也达到了显著的差异，结果表明高糖激活的脐带MSC治疗组和未处理的脐带MSC治疗组，均较好的改善了T2D大鼠的胰岛素抵抗，而高糖激活脐带MSC治疗组改善效果更明显。

(3)高糖激活的脐带MSC注射液明显促进了T2D大鼠的胰岛的再生

采用冰冻切片、免疫荧光染色方法检测葡萄糖转运蛋白2(Glut2)与胰岛素在胰岛的表达。结果表明(图3)，空白治疗组，即未接受MSC移植的T2D大鼠的胰腺内，仅发现少数的beta(Insulin+)细胞，大部分胰岛细胞被破坏；经过脐带MSC治疗组，beta细胞的数目增多；而高糖激活的脐带MSC治疗组，beta细胞的数目明显增多，接近正常水平。

这些研究结果表明，T2D大鼠体内输注本发明的高糖激活的脐带MSC注射液，可以明显降低T2D大鼠的高血糖状况，降低胰岛素抵抗指数，同时，基于改善胰岛素抵抗的作用方式，使得T2D大鼠的血糖下调作用持续较长的时间。未处理的脐带MSC输注液能够使低血糖状态维持大约2周时间，高糖激活的脐带MSC注射液的作用时间更长，比未处理的脐带MSC长10多天，并且改善血糖的效应更强。此外，激活的脐带MSC注射液在降低高血糖浓度的同时，明显促进了胰岛beta细胞的再生，使胰岛beta细胞数目与功能接近正常水平。

实施例6.高糖激活的脂肪间充质干细胞注射液用于治疗糖尿病SD大鼠的实验

一、高糖激活的脂肪间充质干细胞注射液移植治疗2型糖尿病大鼠

与实施例5相同，采用完全随机法将已成模的糖尿病大鼠分为3组，每组6只大鼠：(1)糖尿病空白治疗组，使用1mL无细胞注射液进行动物尾静脉注射；(2)未处理脂肪MSC治疗组，使用1mL注射液进行动物尾静脉注射，该注射液包含无细胞注射液和浓度5×105～2×106个/mL的脂肪MSC；(3)高糖激活的脂肪MSC治疗组，使用1mL注射液进行动物尾静脉注射，该注射液包含无细胞注射液和浓度为5×105～2×106个/mL的高糖激活的MSC。3组动物模型均于治疗前及治疗后测定空腹血糖、体总指数，于治疗后2周、4周检测完毕后处死，取胰岛进行石蜡包埋后HE染色观察胰岛再生状况。

二、试验结果

(1)高糖激活的脂肪MSC注射液明显改善了T2D大鼠的高血糖。

在未处理的脂肪MSC治疗组，T2D大鼠的血糖浓度从注射后的48小时开始明显下调，2周时降低到13.4mmol/L，随后逐渐上升，3周时又超过19.00mmol/L。高糖激活脂肪MSC治疗组，T2D大鼠血糖浓度在治疗后48小时开始明显下调，血糖浓度维持在较低水平10.5～11.5mmol/L，且持续至少2周，至24天时血糖浓度开始呈增高趋势，至4周时接近17.0mmol/L。与两组治疗组相比，空白对照组的T2D大鼠的血糖浓度持续维持在较高水平(见图4)。

(2)高糖激活的脂肪MSC注射液明显改善了T2D大鼠的胰岛素抵抗指数

给药4周后，实验大鼠于处死前空腹12h，禁食不禁水，测完空腹血糖和体重后，乙醚麻醉大鼠，静脉采血，并采用放射免疫分析法测定空腹胰岛素、胰岛素C肽，计算稳态胰岛素评价(HOMA-IR)指数。图5的结果表明，高糖激活的脂肪MSC治疗组和未处理MSC的治疗组，均较好的改善了T2D大鼠的胰岛素抵抗，而高糖激活的脂肪MSC治疗组改善效果更明显。

(3)高糖激活的脂肪MSC注射液明显促进了T2D大鼠的胰岛的再生

采用冰冻切片、免疫荧光染色方法检测葡萄糖转运蛋白2(Glut2)与胰岛素在胰岛的表达。结果表明，在未接受细胞移植的T2D大鼠的胰腺内，仅发现少数的beta(Insulin+)细胞，大部分胰岛细胞被破坏；在经过脂肪MSC治疗组，beta细胞的数目增多；而高糖激活的脂肪MSC治疗组，beta细胞的数目明显增多，接近正常水平。

研究结果证实，体内输注本发明的激活脂肪MSC注射液，可以明显改善T2D大鼠的高血糖，这种降低血糖的作用通过改善胰岛素抵抗而发挥作用。同时，基于改善胰岛素抵抗的作用方式，使得T2D大鼠的血糖下调作用能持续较长的时间，脂肪MSC输注能够使低血糖状态维持大约2周时间。激活的脂肪MSC注射液的作用时间更长，比未处理的脂肪MSC长10多天，并且改善血糖的效应更强。此外，激活的脂肪MSC注射液在降低高血糖浓度的同时，明显促进了胰岛beta细胞的再生，使胰岛beta细胞数目与功能接近正常水平。

资源描述

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610980888.9 (22)申请日 2016.11.08 (71)申请人北京恒峰铭成生物科技有限公司地址 100096 北京市昌平区回龙观镇科学园路28号院1号楼三层301 (72)发明人郝好杰李梓源 (74)专利代理机构北京市商泰律师事务所 11255 代理人毛燕生 (51)Int.Cl. A61K 35/28(2015.01) A61K 9/08(2006.01) A61K 47/42(2017.01) A61K 47/26(2006.01) A61P。

2、 3/10(2006.01) C12N 5/0775(2010.01) (54)发明名称一种高糖激活的间充质干细胞注射液及其用于糖尿病药物的应用 (57)摘要本发明提供了一种高糖激活的间充质干细胞制备方法，一种高糖激活的间充质干细胞注射液及其在制备糖尿病药物方面的应用。所述高糖激活的间充质干细胞的制备方法为将分离提取的脐带、骨髓或脂肪间充质干细胞培养至融合达 4050时，加入终浓度2050mmol/L的葡萄糖溶液，培养482小时，所述间充质干细胞融合达 7580时，消化、中和、洗涤并收集高糖激活的间充质干细胞。所述高糖激活的间充质干细胞注射液包括高糖激活。

3、的间充质干细胞、人血白蛋白、复方维生素、甘露醇、葡萄糖和生理盐水。所述高糖激活的间充质干细胞注射液可用于治疗2 型糖尿病。权利要求书1页说明书8页附图2页 CN 106361771 A 2017.02.01 CN 106361771 A 1.一种高糖激活的间充质干细胞的制备方法：其包括的步骤为： a)将分离提取的间充质干细胞在无血清培养基中培养至融合达4050的单层细胞； b)在步骤a)所述的单层细胞中加入终浓度2050mmol/L的葡萄糖溶液； c)培养所述单层细胞融合达7580时，移去培养上清液，用胰蛋白酶-EDTA 37消化1min，所述间充质干细胞收缩。

4、脱离瓶壁，加入所述移去的培养上清液，中和所述胰蛋白酶-EDTA，再使用移液管轻轻吹打，将细胞悬液移入 50mL无菌离心管； d)加入无菌生理盐水， 1000rpm离心并使用所述生理盐水洗涤三次，获得高糖激活的间充质干细胞。 2.根据权利要求1所述的制备方法，所述步骤b)中加入终浓度为20、 30、 40或50mmol/L 的葡萄糖溶液。 3.根据权利要求1所述的制备方法，所述步骤c)中所述单层细胞融合达7580，所用培养时间为482小时。 4.一种高糖激活的间充质干细胞注射液，其包括以下组分：数量为51052106个/ mL的高糖激活的间充质干细胞、质量体积比为15。

5、的人血白蛋白、质量体积比为15 的复方维生素、质量体积比为18的甘露醇、质量体积比为0.52.5的葡萄糖和余量的生理盐水。 5.根据权利要求4所述的高糖激活的间充质干细胞注射剂，所述高糖激活的间充质干细胞为在无血清培养基中培养至融合达4050的单层细胞时加入终浓度为2050mmol/ L的葡萄糖溶液，连续培养482小时的间充质干细胞。 6.根据权利要求5所述的高糖激活的间充质干细胞注射剂，所述高糖激活的间充质干细胞为在无血清培养基中培养至融合达4050的单层细胞时加入终浓度20、 30、 40或 50mmol/L的葡萄糖溶液，连续培养482小时的间充质干细胞。 7.根据4-。

6、6任一权利要求所述的高糖激活的间充质干细胞注射液，所述间充质干细胞选自人脐带、人骨髓、人脂肪组织或其组合，所述干细胞活力保持在95以上。 8.根据4-7任一权利要求所述的高糖激活的间充质干细胞注射液在制备治疗糖尿病药物中的应用。 9.根据权利要求8所述的高糖激活的间充质干细胞注射液在制备治疗糖尿病药物中的应用，其特征在于，所述糖尿病为2型糖尿病。 10.根据权利要求8所述的高糖激活的间充质干细胞注射液在制备治疗糖尿病药物中的应用，所述干细胞注射液采用单次或多次输注的方案，且在所述间充质干细胞注射液在2 小时内使用完毕。权利要求书 1/1 页 2 CN 1063。

7、61771 A 2 一种高糖激活的间充质干细胞注射液及其用于糖尿病药物的应用技术领域 0001 本发明属于生物医药领域，尤其涉及一种高糖激活的间充质干细胞的制备，一种高糖激活的间充质干细胞注射液及其用于糖尿病药物的应用。背景技术 0002 随着现代生活方式的改变，糖尿病的发病率越来越高，新近中国的一项调查研究发现，中国的糖尿病发病率近10，即发病人口已经接近1亿，其中， 95是2型糖尿病 (T2D)。 T2D的发病机制是肥胖导致的慢性炎症而致的胰岛素抵抗，造成高血糖、以及持续的高血糖并进而导致的糖代谢与脂代谢紊乱，从而对胰岛beta细胞造成进行性损伤。因此，。

8、T2D的治疗包括两个方面的措施：一方面是使用降糖药物与胰岛素增敏剂改善高血糖状态，另一方面是使用外源的胰岛素以补充胰岛功能下降而引起的胰岛素分泌的不足。然而，目前的治疗方案尽管很多，仍然无法完全实现稳定控制血糖，引起胰岛功能不断的损毁，最后导致心脑血管、神经等系统并发症的出现。因此，寻找更好的治疗方法志在必行。 0003 间充质干细胞(MSCs)是干细胞家族的重要成员，因其具有多向分化潜能、自我更新能力，以及分泌多种因子参与损伤的组织与器官的修复与再生而被广泛应用于多种疾病的治疗。 MSCs在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为胰岛、神经、血管内皮、骨。

9、、软骨、肌肉、肝脏、心肌等多种组织细胞，除此之外， MSCs还具有低免疫原性和独特的免疫调节作用，能逃避免疫识别、抑制免疫应答，这就为同种异体使用提供基础。先前的研究证实， MSCs在特定条件下可以诱导分化为胰岛beta细胞，这为治疗糖尿病带来希望。 0004 越来越多的研究证实MSCs通过分泌的细胞因子可发挥免疫调节与降低炎症的作用。由于MSCs是原始的修复细胞，生理状态下处于静止状态，当机体的稳态发生改变，它以非对称分裂的模式复制子代细胞处于修复再生以恢复机体稳态，即MSCs发挥作用的触发因素取决于其周围环境，环境因素负反馈触发MSCs的反应机制，。

10、产生修复与再生。 T2D起源于肥胖导致体内慢性炎症的发生，长期的慢性炎症诱发的细胞对胰岛素的吸收存在障碍，也就是胰岛素抵抗，抵抗的持续，严重影响了细胞对糖的吸收，出现高血糖。前期的研究证实 MSCs输注明显改善了T2D大鼠外周靶组织对胰岛素的抵抗，促进了细胞对葡萄糖的吸收。 0005 然而，目前的MSCs，无论来源于脐带，还是自体骨髓或脂肪组织，均不是特异修复 T2D的，这在很大程度上限制了MSCs的治疗效果。前期的文献报道，无论临床试验还是动物实验，用MSCs的输注治疗T2D均无法使高血糖恢复至正常水平，且经过一定的时间后血糖又有不同程度的升高。 0。

11、006 基于上述问题，本发明进行研究，对MSCs进行处理，得到一种高糖负反馈调节激活了的间充质干细胞注射液，用于输注治疗T2D。发明内容 0007 针对通用型的间充质干细胞(MSCs)输注液治疗2型糖尿病(T2D)存在效率不高的说明书 1/8 页 3 CN 106361771 A 3 问题，本发明提供了一种高糖激活的间充质干细胞制备方法，一种高糖激活的间充质干细胞注射液，其制备方法和在用于糖尿病药物中应用。 0008 为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现： 0009 一种高糖激活的间充质干细胞的制备方法：其包括的步骤为： a)将分离提取的间充质干细。

12、胞在无血清培养基中培养至融合达4050的单层细胞； b)在步骤a)的所述单层细胞中加入终浓度2050mmol/L的葡萄糖溶液； c)培养所述单层细胞融合达7580时，移去培养上清液，用胰蛋白酶-EDTA 37消化1min，所述间充质干细胞收缩脱离瓶壁，加入所述移去的培养上清液，中和所述胰蛋白酶-EDTA，再使用移液管轻轻吹打，将细胞悬液移入50mL无菌离心管； d)加入无菌生理盐水， 1000rpm离心并使用所述生理盐水洗涤三次，获得高糖激活的间充质干细胞。 0010 进一步的，所述步骤b)中加入终浓度为20、 30、 40或50mmol/L的葡萄糖溶液。 0011 。

13、进一步的，所述步骤c)中所述单层细胞融合达7580，所用培养时间为482小时。 0012 进一步的，所述步骤d)中，加入50mL生理盐水，测定的高糖激活的间充质干细胞的浓度为51052106。 0013 所述间充质干细胞选自人脐带、人骨髓、人脂肪组织或其组合，所述干细胞活力保持在95以上。 0014 一种高糖激活的间充质干细胞注射液，其包括以下组分：数量为51052106 个/mL的高糖激活的间充质干细胞、质量体积比为15的人血白蛋白、质量体积比为1 5的复方维生素、质量体积比为18的甘露醇、质量体积比为0.52.5的葡萄糖和余量的生理盐水。 0015 对上。

14、述技术方案的进一步改进，所述高糖激活的间充质干细胞注射剂中所述高糖激活的间充质干细胞为在无血清培养基中培养至融合达4050的单层细胞时加入终浓度为2050mmol/L的葡萄糖溶液，连续培养482小时的间充质干细胞。 0016 进一步的，所述高糖激活的间充质干细胞为在无血清培养基中培养至融合达40 50的单层细胞时加入终浓度20、 30、 40或50mmol/L的葡萄糖溶液，连续培养482小时的间充质干细胞。 0017 所述间充质干细胞选自人脐带、人骨髓、人脂肪组织或其组合，所述干细胞活力保持在95以上。 0018 一种高糖激活的间充质干细胞注射液的制备方法，其包括a)预。

15、先制备人血白蛋白、甘露醇注射液、复方维生素注射液和葡萄糖注射液，并4预冷备用； b)按照质量体积比配制人血白蛋白、甘露醇注射液、复方维生素注射液和葡萄糖注射液； c)将高糖激活的间充质干细胞重悬于步骤b)所述的注射液中，并加入余量的生理盐水。 0019 上述的高糖激活的间充质干细胞注射液在制备治疗糖尿病药物中的应用，其特征在于，所述糖尿病为2型糖尿病。所述干细胞注射液采用单次或多次输注的方案，且在所述间充质干细胞注射液在2小时内使用完毕。 0020 本发明的有益效果： 0021 与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：本发明采用人脐带、骨髓、脂肪组织的。

16、间充质干细胞，采用高糖浓度进行培养预处理，激活干细胞负反馈调节机制，明显增强说明书 2/8 页 4 CN 106361771 A 4 了间充质干细胞发挥抗T2D的效应，改善了胰岛素抵抗，并促进胰岛beta细胞功能恢复。本发明制备的激活的间充质干细胞，经过简单的预处理，干细胞特性未见变化，本制备体系易于质量控制，易于产业化。本发明采用激活的间充质干细胞注射液优化治疗方案，采用多次输注治疗的策略，显著降低了T2D的胰岛素抵抗，并修复损伤的胰岛beta细胞，恢复糖尿病患者的胰岛功能。通过本发明提供了技术方案，明显提高了MSCs输注治疗T2D的效率，使。

17、得 T2D的高血糖及胰岛素抵抗恢复到接近正常水平，使糖尿病患者达到摆脱胰岛素注射。附图说明： 0022 图1.正常大鼠和实施例5试验治疗组大鼠血糖浓度变化图。横坐标前面的0、 3、 7表示链脲佐菌素(STZ)处理MSC的时间，后面的7/14/21/28/35指MSC治疗后的时间； Normal指正常大鼠， T2D指2型糖尿病大鼠并采用空白治疗组， T2D+MSCs指2型糖尿病大鼠并采用未处理脐带间充质干细胞治疗组， T2D+激活MSCs指2型糖尿病大鼠并采用高糖激活的脐带间充质干细胞治疗组。 0023 图2.正常大鼠和实施例5试验治疗组大鼠胰岛素抵抗指数(IR指数)比较图。 0。

18、024 图3.T2D大鼠和间充质干细胞治疗组大鼠胰岛病理切片比较图。 0025 图4.正常大鼠和实施例6试验治疗组大鼠血糖浓度变化图。横坐标前面的0、 3、 7表示STZ处理MSC的时间，后面的7/14/21/28/35指MSC治疗后的时间； Normal指正常大鼠， T2D 指2型糖尿病大鼠并采用空白治疗组， T2D+MSCs指2型糖尿病大鼠并采用未处理脂肪间充质干细胞治疗组， T2D+激活MSCs指2型糖尿病大鼠并采用高糖激活的脂肪间充质干细胞治疗组。 0026 图5.正常大鼠和实施例6试验治疗组大鼠胰岛素抵抗指数(IR指数)比较图。具体实施方式 0027 下面以具体实施方式对。

19、发明作进一步详细说明 0028 本发明参照特定的实施例进行了描述，但是，很显然仍可以做出各种修改和变换而不违背本发明的精神和范围。因此，本发明的说明书和附图应该认为是说明性的而非限制性的。 0029 实施例1.间充质干细胞的制备 0030 一、脐带间充质干细胞的制备 0031 在超净工作台中进行操作，取新鲜足月健康胎儿脐带，用含2倍100U/mL青霉素和链霉素的生理盐水冲洗去除血渍，将华尔通氏胶剥离，剪成1立方毫米以下块状，均匀涂布，缓慢加入10mL无血清培养基，置37、体积分数为5的二氧化碳、饱和湿度培养箱中培养。将原代细胞培养7天后，更换无血清培养液，。

20、培养至细胞达到70的融合，移去无血清培养液，添加浓度分别为0.25和0.1的胰蛋白酶-乙二胺四乙酸钠(EDTA)消化1min，脐带MSC 收缩脱离瓶壁，此时加入先前移去的培养上清液，中和胰蛋白酶-EDTA溶液，并使用移液管轻轻吹打，将脐带MSC悬液移入50mL离心管。 1000rpm离心8min，去除上清液；重新加入无血清完全培养基将MSC重悬，并计数。按照1传1.5接种10cm培养皿。 MSC培养融合70左右时参照上述方法传代培养。 0032 选择第四代培养的MSC，在对数生长期，且细胞融合程度不超过80时按照传代的说明书 3/8 页 5 CN 10。

21、6361771 A 5 要求消化、中和、洗涤、收集细胞，采用细胞冻存液(90胎牛血清和10二甲亚砜(DMSO) 重悬MSC，充分混匀，每管1mL分装于冻存管密封。将冻存管置于装有异丙醇的冻存盒中，于- 80冰箱过夜，次日移入液氮罐保存。 0033 MSC复苏的步骤为：取出MSC冻存管，立即浸入37温水中溶解；取适量无血清培养基混悬细胞并离心，弃去上清液；细胞重悬于无血清培养基中，并接种于培养皿中，于37、体积分数为5的二氧化碳、饱和湿度培养箱中培养。 0034 二、骨髓间充质干细胞的制备 0035 采用常规方法于髂前上棘穿刺点，用骨穿针抽取50mL骨髓。

22、液，注入50mL的无菌离心管中；用等量含20u/mL肝素的PBS液稀释，并沿管壁加入等体积的比重为1.073g/ml的淋巴细胞分离液； 2000rmp离心30min，吸取单个核细胞层；无菌生理盐水离心洗涤2次，每次 1000rpm离心5min，弃去上清液，取沉淀；将上述得到的骨髓MSC，用无血清培养基混悬，计数细胞，按5106个/mL接种于的培养瓶中，置37体积分数为5的二氧化碳、饱和湿度的培养箱中培养。培养3天后，更换无血清培养液，弃去未贴壁细胞，以后每3天1次更换培养液； 7 9天后，骨髓MSC融合达5060时，进行第一次传代。移去无血清培。

23、养液，采用浓度分别为0.25和0.1的胰蛋白酶-EDTA37消化1min，骨髓MSC收缩脱离瓶壁，加入先前移去的培养上清液，中和胰蛋白酶-EDTA，并使用移液管轻轻吹打，将骨髓间充质细胞悬液移入 50mL无菌离心管中。 1000rpm离心8min，弃去上清液；重新加入无血清完全培养基重悬，计数，按照1传1-1.5接种10cm培养皿。骨髓MSC培养融合70左右时如上述方法传代培养。 0036 三、脂肪间充质干细胞的制备 0037 按照常规方法分离腹部白色脂肪组织，剔除可见微血管及肌肉组织，无菌PBS洗涤三遍，然后用无菌剪刀将脂肪组织剪碎至1立方毫米以下的糊状。

24、，添加无菌消化液(含有 0.1胶原酶型和0.05胰蛋白酶的无血清DMEM培养基)， 37水浴中匀速搅拌45-50min，至组织块消化干净； 200目筛网过滤收集滤液，然后使用含有10胎牛血清(FBS)的低糖 DMEM培养基等量中和， 1500rpm离心10min，弃去上清液；以1106个/mL的细胞密度，用无血清培养基重悬脂肪MSC，并接种于培养瓶中， 37、体积分数为5二氧化碳、饱和湿度培养箱中培养，当脂肪MSC生长至接近80融合时，使用0.25胰蛋白酶溶液消化MSC细胞，以1： 3的接种比例接种到新的培养瓶中进行传代培养。脂肪MSC融合至不超过80， 100。

25、0rpm离心 8min，弃去上清液，重新加入无血清完全培养基重悬MSC，计数，按照1传1-1.5接种10cm培养皿。脂肪MSC培养融合70左右时如上述方法传代培养。 0038 实施例2.高糖激活的间充质干细胞的制备 0039 高糖激活的间充质干细胞为加入一定浓度的葡萄糖溶液，培养一定时间后，测量培养的间充质干细胞数量，如果间充质干细胞的浓度能够达到51052106个/mL，表明葡萄糖溶液已成功激活间充质干细胞。 0040 一、高糖激活的脐带间充质干细胞的制备 0041 (1) 0042 将实施例1中制备的脐带MSC在第四代细胞培养至40-50单层细胞时，加入葡萄糖。

26、溶液，葡萄糖终浓度为20mmol/L，连续培养48小时；单层细胞融合达7580时，移去培养上清液，用浓度分别为0.25和0.1的胰蛋白酶-EDTA 37消化1min，脐带MSC收缩脱离瓶壁，加入先前移去的培养上清液，中和胰蛋白酶-EDTA，并使用移液管轻轻吹打，将脐说明书 4/8 页 6 CN 106361771 A 6 带MSC悬液移入50mL无菌离心管；加入等量的无菌生理盐水，离心，并用无菌生理盐水离心洗涤三次。第一次使用无菌生理盐水洗涤时，取脐带MSC样品进行计数，并测定活细胞比例，测定的MSC数量约为7105个/mL，表明终浓度为20mm。

27、ol/L的葡萄糖溶液能够成功激活脐带 MSC，获得高糖激活的脐带MSC。 0043 (2) 0044 将实施例1中制备的脐带MSC在第四代细胞培养至40-50单层细胞时，加入葡萄糖溶液，葡萄糖终浓度为30mmol/L，连续培养49小时；单层细胞融合达7580时，移去培养上清液，并采用与上述(1)中相同的方法消化、中和、洗涤和收集激活的干细胞。第一次使用无菌生理盐水洗涤时，测出MSC数量约为9105个/mL，表明终浓度为30mmol/L的葡萄糖能够成功激活脐带MSC，获得高糖激活的脐带MSC。 0045 (3) 0046 将实施例1中制备的脐带MSC在第四代细胞。

28、培养至40-50单层细胞时，加入葡萄糖溶液，葡萄糖终浓度为40mmol/L，连续培养47小时；单层细胞融合达7580时，移去培养上清液，并采用与上述(1)中相同的方法消化、中和、洗涤和收集激活的干细胞。第一次使用无菌生理盐水洗涤时，测出MSC数量约为8105个/mL，表明终浓度为40mmol/L的葡萄糖能够成功激活脐带MSC，获得高糖激活的脐带MSC。 0047 (4) 0048 将实施例1中制备的脐带MSC在第四代细胞培养至40-50单层细胞时，加入葡萄糖溶液，葡萄糖终浓度为50mmol/L，连续培养46小时；单层细胞融合达7580时，移去培养上。

29、清液，并采用与上述(1)中相同的方法消化、中和、洗涤和收集激活的干细胞。第一次使用无菌生理盐水洗涤时，测出MSC数量约为1106个/mL，表明终浓度为50mmol/L的葡萄糖能够成功激活脐带MSC，获得高糖激活的脐带MSC。 0049 二、高糖激活的脂肪间充质干细胞的制备 0050 将实施例1中制备的脂肪MSC在第四代细胞培养至40-50单层细胞时，加入葡萄糖溶液，葡萄糖终浓度为30mmol/L，连续培养50小时；单层细胞融合达7580时，移去培养上清液，用浓度为0.25-胰蛋白酶37消化1min，脂肪MSC收缩脱离瓶壁，加入先前移去的培养上清液，中。

30、和胰蛋白酶，并使用移液管轻轻吹打，将MSC悬液移入50mL无菌离心管；加入等量的无菌生理盐水，离心，并用无菌生理盐水离心洗涤三次。第一次使用无菌生理盐水洗涤时，取MSC样品进行计数，并测定活细胞比例，测出MSC数量约为8105个/mL，表明终浓度为30mmol/L的葡萄糖能够成功激活脂肪MSC。 0051 三、高糖激活的骨髓间充质干细胞的制备 0052 将实施例1中制备的骨髓MSC在第四代细胞培养至40-50单层细胞时，加入葡萄糖溶液，葡萄糖终浓度为40mmol/L，连续培养47小时；单层细胞融合达7580时，移去培养上清液，用浓度为0.25-0.1的。

31、胰蛋白酶-EDTA 37消化1min，骨髓MSC收缩脱离瓶壁，加入先前移去的培养上清液，中和胰蛋白酶-EDTA，并使用移液管轻轻吹打，将MSC悬液移入50mL无菌离心管；加入等量的无菌生理盐水，离心，并用无菌生理盐水离心洗涤三次。第一次使用无菌生理盐水洗涤时，取骨髓MSC样品进行计数，并测定活细胞比例，测出MSC数量约为8105个/mL，表明终浓度为40mmol/L的葡萄糖能够成功激活骨髓MSC。 0053 实施例3.高糖激活的间充质干细胞注射液的制备说明书 5/8 页 7 CN 106361771 A 7 0054 一种高糖激活的间充质干细胞注射液，其。

32、包括以下组分：数量为51052106 个/mL的高糖激活的间充质干细胞，质量体积比为15人血白蛋白，质量体积比为18 甘露醇注射液，质量体积比为15复方维生素注射液，质量体积比为15的50葡萄糖注射液和余量为生理盐水。 0055 如配制100mL高糖激活的间充干细胞注射液，该注射液包括人血白蛋白原液5mL (质量体积比终浓度为1)、甘露醇注射液2mL、复方维生素注射液3mL、 50葡萄糖注射液 5mL、生理盐水85mL、的高糖激活的MSC。除高糖激活的MSC外，注射液其余成分需提前配制，并4预冷备用。 MSC最终重悬注射液中，制成单细胞悬液，每毫升注射液中高糖激。

33、活的MSC 的数量为51052106个。该制备好的高糖激活的MSC在210条件中， 2小时内细胞保持为单细胞悬液状态，且细胞活力(台盼蓝染色计活力)保持在95以上。本发明所述质量体积比均代表质量(g)与体积(ml)的比例。 0056 人血白蛋白、复方维生素、甘露醇、葡萄糖均为临床注射液成分，可为细胞提供营养、利于细胞的新陈代谢、维持良好的干细胞体外微环境。 0057 本发明的高糖激活的MSC注射液非常利于激活的MSC在体外混悬状态下微环境的稳定，利于干细胞维持活性，且临床输注安全。高糖激活的MSC在此混悬液中可短时间保持较高的活力，最大程度维持干细胞的特性，。

34、使得输注到体内的细胞能发挥更大的治疗潜能。 0058 实施例4.SD大鼠2型糖尿病模型的建立 0059 采用高脂肪、高糖饮食连续喂养大鼠3040天，而后辅以40mg/kg注射链脲菌素。用血糖仪测定大鼠鼠尾血糖浓度，选取连续2次血糖浓度高于16.7mmol/L的大鼠作为糖尿病模型。 0060 实施例5.高糖激活的脐带间充质干细胞注射液用于治疗糖尿病SD大鼠的实验 0061 一、高糖激活的脐带间充质干细胞注射液移植治疗2型糖尿病大鼠 0062 采用完全随机法将已成模的糖尿病大鼠分为3组，每组6只大鼠： (1)糖尿病空白治疗组，使用1mL无细胞注射液进行动物尾静脉注射，无细胞注。

35、射液包含质量体积比为15 人血白蛋白，质量体积比为18甘露醇注射液，质量体积比为15复方维生素注射液，质量体积比为15的50葡萄糖注射液和余量为生理盐水； (2)未处理脐带MSC治疗组，使用1mL注射液进行动物尾静脉注射，该注射液包含无细胞注射液和浓度为51052106 个/mL的脐带MSC，脐带MSC参照实施例1的方法制备，直接收获后不做处理； (3)高糖激活的脐带MSC治疗组，使用1mL注射液进行动物尾静脉注射，该注射液包含无细胞注射液和浓度为51052106个/mL的高糖激活的MSC。本试验采用单次注射的方式。 3组动物模型均于治疗前及治疗后测定空腹血糖、体总。

36、指数，于治疗后2周、 4周检测完毕后处死，取胰岛进行石蜡包埋后HE染色观察胰岛再生状况。 0063 二、试验结果 0064 (1)高糖激活的脐带MSC注射液明显改善了T2D大鼠的高血糖状况。 0065 在未处理的脐带MSC的治疗组， T2D大鼠的血糖浓度从注射后的48小时开始明显下调， 2周时降低到14.7mmol/L，随后逐渐上升， 3周时又超过20.00mmol/L。高糖激活脐带间充质干细胞治疗组， T2D大鼠的血糖浓度在注射后48小时开始明显下调，血糖浓度维持在较低水平， 11.012.0mmol/L之间，且持续至少2周时间，至24天时血糖浓度开始呈增高趋势，至。

37、 4周时接近16.0mmol/L。与两组脐带MSC治疗组相比，空白治疗对照组中T2D大鼠的血糖浓度说明书 6/8 页 8 CN 106361771 A 8 持续维持在较高水平(见图1)。 0066 (2)高糖激活的脐带MSC注射液明显改善了T2D大鼠的胰岛素抵抗指数 0067 给药4周后，实验大鼠于处死前空腹12h，禁食不禁水，测完空腹血糖和体重后，乙醚麻醉大鼠，静脉采血，并采用放射免疫分析法测定空腹胰岛素、胰岛素C肽，计算稳态胰岛素评价(HOMA-IR)指数。 HOMA-IR指数空腹血糖(mmol/L)空腹胰岛素(mU/L)/22.5。如图 2所示，空白治疗。

38、组的大鼠胰岛素抵抗在第7天和第21天的时候是未处理MSC治疗组和高糖激活的MSC治疗组的大鼠胰岛素抵抗的2倍和3倍，达到了显著地差异，且未处理MSC治疗组和高糖激活的MSC治疗组大鼠胰岛素抵抗也达到了显著的差异，结果表明高糖激活的脐带 MSC治疗组和未处理的脐带MSC治疗组，均较好的改善了T2D大鼠的胰岛素抵抗，而高糖激活脐带MSC治疗组改善效果更明显。 0068 (3)高糖激活的脐带MSC注射液明显促进了T2D大鼠的胰岛的再生 0069 采用冰冻切片、免疫荧光染色方法检测葡萄糖转运蛋白2(Glut2)与胰岛素在胰岛的表达。结果表明(图3)，空白治疗组，即未接受MSC。

39、移植的T2D大鼠的胰腺内，仅发现少数的 beta(Insulin+)细胞，大部分胰岛细胞被破坏；经过脐带MSC治疗组， beta细胞的数目增多；而高糖激活的脐带MSC治疗组， beta细胞的数目明显增多，接近正常水平。 0070 这些研究结果表明， T2D大鼠体内输注本发明的高糖激活的脐带MSC注射液，可以明显降低T2D大鼠的高血糖状况，降低胰岛素抵抗指数，同时，基于改善胰岛素抵抗的作用方式，使得T2D大鼠的血糖下调作用持续较长的时间。未处理的脐带MSC输注液能够使低血糖状态维持大约2周时间，高糖激活的脐带MSC注射液的作用时间更长，比未处理的脐带MSC 长10。

40、多天，并且改善血糖的效应更强。此外，激活的脐带MSC注射液在降低高血糖浓度的同时，明显促进了胰岛beta细胞的再生，使胰岛beta细胞数目与功能接近正常水平。 0071 实施例6.高糖激活的脂肪间充质干细胞注射液用于治疗糖尿病SD大鼠的实验 0072 一、高糖激活的脂肪间充质干细胞注射液移植治疗2型糖尿病大鼠 0073 与实施例5相同，采用完全随机法将已成模的糖尿病大鼠分为3组，每组6只大鼠： (1)糖尿病空白治疗组，使用1mL无细胞注射液进行动物尾静脉注射； (2)未处理脂肪MSC治疗组，使用1mL注射液进行动物尾静脉注射，该注射液包含无细胞注射液和浓度51052 。

41、106个/mL的脂肪MSC； (3)高糖激活的脂肪MSC治疗组，使用1mL注射液进行动物尾静脉注射，该注射液包含无细胞注射液和浓度为51052106个/mL的高糖激活的MSC。 3组动物模型均于治疗前及治疗后测定空腹血糖、体总指数，于治疗后2周、 4周检测完毕后处死，取胰岛进行石蜡包埋后HE染色观察胰岛再生状况。 0074 二、试验结果 0075 (1)高糖激活的脂肪MSC注射液明显改善了T2D大鼠的高血糖。 0076 在未处理的脂肪MSC治疗组， T2D大鼠的血糖浓度从注射后的48小时开始明显下调， 2周时降低到13.4mmol/L，随后逐渐上升， 3周时又超过19.0。

42、0mmol/L。高糖激活脂肪MSC 治疗组， T2D大鼠血糖浓度在治疗后48小时开始明显下调，血糖浓度维持在较低水平10.5 11.5mmol/L，且持续至少2周，至24天时血糖浓度开始呈增高趋势，至4周时接近17.0mmol/ L。与两组治疗组相比，空白对照组的T2D大鼠的血糖浓度持续维持在较高水平(见图4)。 0077 (2)高糖激活的脂肪MSC注射液明显改善了T2D大鼠的胰岛素抵抗指数 0078 给药4周后，实验大鼠于处死前空腹12h，禁食不禁水，测完空腹血糖和体重后，乙说明书 7/8 页 9 CN 106361771 A 9 醚麻醉大鼠，静脉采血，并采用。

43、放射免疫分析法测定空腹胰岛素、胰岛素C肽，计算稳态胰岛素评价(HOMA-IR)指数。图5的结果表明，高糖激活的脂肪MSC治疗组和未处理MSC的治疗组，均较好的改善了T2D大鼠的胰岛素抵抗，而高糖激活的脂肪MSC治疗组改善效果更明显。 0079 (3)高糖激活的脂肪MSC注射液明显促进了T2D大鼠的胰岛的再生 0080 采用冰冻切片、免疫荧光染色方法检测葡萄糖转运蛋白2(Glut2)与胰岛素在胰岛的表达。结果表明，在未接受细胞移植的T2D大鼠的胰腺内，仅发现少数的beta(Insulin+) 细胞，大部分胰岛细胞被破坏；在经过脂肪MSC治疗组， beta细胞的数目增多。

44、；而高糖激活的脂肪MSC治疗组， beta细胞的数目明显增多，接近正常水平。 0081 研究结果证实，体内输注本发明的激活脂肪MSC注射液，可以明显改善T2D大鼠的高血糖，这种降低血糖的作用通过改善胰岛素抵抗而发挥作用。同时，基于改善胰岛素抵抗的作用方式，使得T2D大鼠的血糖下调作用能持续较长的时间，脂肪MSC输注能够使低血糖状态维持大约2周时间。激活的脂肪MSC注射液的作用时间更长，比未处理的脂肪MSC长10多天，并且改善血糖的效应更强。此外，激活的脂肪MSC注射液在降低高血糖浓度的同时，明显促进了胰岛beta细胞的再生，使胰岛beta细胞数目与功能接近正常水平。说明书 8/8 页 10 CN 106361771 A 10 图1 图2 图3 说明书附图 1/2 页 11 CN 106361771 A 11 图4 图5 说明书附图 2/2 页 12 CN 106361771 A 12 。

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