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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201510237630.5 (22)申请日 2015.05.11 A61K 36/898(2006.01) A61K 8/97(2006.01) A61Q 19/02(2006.01) A61Q 19/08(2006.01) A61P 17/18(2006.01) A61P 17/00(2006.01) (71)申请人 伽蓝 （集团） 股份有限公司 地址 201403 上海市奉贤区丽丰路 12 号 (72)发明人 金家宏 (74)专利代理机构 上海弼兴律师事务所 31283 代理人 薛琦 余化鹏 (54) 发明名称 短管兔耳草提取物其制。
2、备方法和应用、 含其 的皮肤外用剂 (57) 摘要 本发明公开了短管兔耳草提取物其制备方法 和应用、 含其的皮肤外用剂。 本发明提供了短管兔 耳草提取物的制备方法， 方法 1 ： 将短管兔耳草粉 末与体积浓度为 50 80的乙醇水溶液形成的 混合物， 在 10 35下提取 0.5 5 小时， 固液 分离得滤液， 滤液脱除溶剂， 所述的短管兔耳草粉 末与所述的乙醇水溶液的质量体积比为1 ： 81 ： 15mg/mL。方法 2 ： 将方法 1 得到的短管兔耳草粗 提物， 上样到大孔树脂填充柱， 依次用溶剂、 溶 剂和溶剂洗脱， 分别收集洗脱液， 脱除溶剂， 得到溶剂洗脱部位A、 溶剂洗脱部位B和溶。
3、剂洗脱 部位 C。本发明的短管兔耳草提取物具有较好的 美白、 抗老化和抗氧化的功效， 有良好的市场化前 景。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书8页 CN 106266582 A 2017.01.04 CN 106266582 A 1/2 页 2 1.一种短管兔耳草提取物的制备方法， 其特征在于其采用方法 1 或方法 2 ： 所述的方法 1 包括如下步骤 ： 将短管兔耳草粉末与体积浓度为 50 80的乙醇水 溶液形成的混合物， 在 10 35下提取 0.5 小时 5 小时， 固液分离得滤液， 滤液脱除溶 剂， 即得短管兔耳。
4、草粗提物 ； 其中， 所述的短管兔耳草粉末与所述的乙醇水溶液的质量体积 比为 (1 ： 8)g/mL (1 ： 15)mg/mL ； 所述的体积浓度是指乙醇的体积与乙醇水溶液总体积的 百分比 ； 所述的方法2包括如下步骤 ： 将方法1得到的短管兔耳草粗提物， 上样到大孔树脂填充 柱， 依次用溶剂、 溶剂和溶剂洗脱， 分别收集洗脱液， 并脱除溶剂后， 相应地得到溶剂 洗脱部位 A、 溶剂洗脱部位 B 和溶剂洗脱部位 C， 所述的溶剂 I、 所述的溶剂 II 和所述的溶 剂 III 分别为体积浓度为 20 30的乙醇水溶液、 体积浓度为 40 50的乙醇水溶 液和体积浓度为 60 70的乙醇水溶液。
5、， 溶剂 I 对应溶剂洗脱部位 A， 溶剂 II 对应溶剂 洗脱部位 B， 溶剂 III 对应溶剂洗脱部位 C。 2.如权利要求 1 所述的短管兔耳草提取物的制备方法， 其特征在于 ： 方法 1 中， 所述的短管兔耳草粉末的粒度为 20 目 60 目 ； 和 / 或， 方法 1 中， 所述的提取为超声提取 ； 和 / 或， 方法 1 中， 所述的提取的温度为 20 25 ； 和 / 或， 方法 1 中， 所述的提取的时间为 0.5 小时 1 小时 ； 和 / 或， 方法 1 中， 所述的提取的次数为 1 2 次 ； 和 / 或， 方法1中， 所述的短管兔耳草粉末与所述的乙醇水溶液的质量体积比为。
6、(1:10)g/mL (1:15)g/mL ； 和 / 或， 方法 1 中， 所述的乙醇的体积浓度为 70 ； 和 / 或， 方法 1 中， 所述的固液分离的方法为过滤、 压滤或离心。 3.如权利要求 2 所述的短管兔耳草提取物的制备方法， 其特征在于 ： 方法 1 中， 所述的超声提取的功率为 500w 1000w ； 和 / 或， 方法1中， 所述的短管兔耳草粉末与所述的乙醇水溶液的质量体积比为(1:10)g/mL (1:12)g/mL。 4.如权利要求 1 所述的短管兔耳草提取物的制备方法， 其特征在于 ： 方法 2 中， 所述的大孔树脂填充柱为 D101、 AB-8 或 ADS-8 树。
7、脂填充柱 ； 和 / 或， 方法 2 中， 所述的溶剂、 为体积浓度为 30的乙醇 ； 和 / 或， 权 利 要 求 书 CN 106266582 A 2 2/2 页 3 方法 2 中， 所述溶剂为体积浓度为 50的乙醇 ； 和 / 或， 方法 2 中， 所述溶剂为体积浓度为 70的乙醇 ； 和 / 或， 方法 2 中， 所述的溶剂、 溶剂、 溶剂的用量分别为 500mL 800mL。 5.如权利要求14任一项所述的短管兔耳草提取物的制备方法制得的短管兔耳草提 取物。 6.如权利要求 5 所述的短管兔耳草提取物， 其特征在于 ： 所述的短管兔耳草提取物包括方法 1 制得的短管兔耳草粗提物、 方。
8、法 2 制得的溶剂洗 脱部位 A、 方法 2 制得的溶剂洗脱部位 B 和方法 2 制得的溶剂洗脱部位 C 中的一种或多种。 7.如权利要求 5 所述的短管兔耳草提取物在制备皮肤外用剂中的应用。 8.如权利要求 7 所述的应用， 其特征在于 ： 所述的短管兔耳草提取物在制备皮肤外用 剂时作为美白活性成分、 抗老化活性成分和抗氧化活性成分中的一种或多种。 9.如权利要求 7 所述的应用， 其特征在于 ： 所述的皮肤外用剂包括具备疾病治疗用途 的药物， 或者不具备疾病治疗用途的化妆品。 10.一种皮肤外用剂， 包括如权利要求 5 或 6 所述的短管兔耳草提取物。 权 利 要 求 书 CN 10626。
9、6582 A 3 1/8 页 4 短管兔耳草提取物其制备方法和应用、 含其的皮肤外用剂 技术领域 0001 本发明涉及短管兔耳草提取物其制备方法和应用、 含其的皮肤外用剂。 背景技术 0002 1956 年 Harman 提出了自由基衰老学说 Harman,D.Aging:A theory based on free radical and radiation chemistry.J.Gerontol.1956,11:289-300.， 认为过多的 自由基是造成生物老化的重要原因。根据这一理论， 体内过量的活性氧自由基与不饱和脂 肪酸作用产生丙二醛等物质， 丙二醛将与细胞膜上的蛋白质等作用生产。
10、褐色素， 沉淀于皮 肤便成为各种色斑。 过量的自由基还能使皮肤内的胶原纤维、 弹性纤维发生交联和变性、 变 脆、 失去弹性， 当皮肤水分不足时， 容易使弹性纤维断裂， 出现暗纹、 细纹、 皱纹等皮肤老化 现象。 此外， 环境中的离子辐射以及诸如空气污染与化学物质等的环境污染物， 也会使生物 体内不断的产生自由基。 例如环境中的紫外线会使皮肤真皮中的纤维母细胞及线粒体受到 刺激， 进而释放出超氧阴离子， 而过量的超氧阴离子则会转换成其它破坏性更强的自由基。 虽然人体内具有能够维持氧化与抗氧化之间平衡状态的抗氧化防御系统， 用以减缓活性氧 及自由基的产生， 但若是长期过度的曝晒在阳光下， 则人体内。
11、大量产生的自由基会导致皮 肤的抗氧化防御能力降低， 造成皮肤的伤害， 例如光老化、 表皮皱纹、 皮肤免疫力失调等。 抗 氧化剂是具有捕捉自由基能力的物质， 可以清除皮肤中的活性自由基， 减轻自由基引起的 皮肤氧化应激损伤， 从而改善由氧化应激等造成的皮肤老化。目前已知有维生素 E、 维生素 C 等生物体内的清除自由基型抗氧化剂， 另外也报道了植物来源的抗氧化剂如莲花、 梅果提 取物等 ( 专利文献 CN201110158540 含有莲花提取物和乌梅提取物作为有效成分而具有抗 氧化活性的皮肤外用剂组合物 )。 0003 关于皮肤黑色素的形成， 目前研究表明主要是由于黑素细胞内的生物化学反应引 起。
12、， 即酪氨酸在作为催化剂的酪氨酸酶的作用下， 生成多巴醌， 再通过酶的催化作用或非酶 的氧化作用形成黑色素。关于抑制上述黑色素生成的美白活性物， 通常以抑制酪氨酸酶活 性为主要靶点。来源于植物提取物的酪氨酸酶抑制剂作为潜在的美白活性物， 同时又具有 安全性和对皮肤低刺激性的预期， 目前已有各种开发的报道(专利文献CN201310411195白 蔹提取物美白功效的检测方法 ； CN201310382406 白木香果皮提取物在制备美白化妆品中 的应用 )。 0004 皮肤胶原约占干燥皮肤重量的 75， 是皮肤细胞外基质的重要组成成分， 起着皮 肤结构的支撑体功能， 并提供皮肤的抗拉和弹力等重要功能。
13、。正常皮肤中胶原的生成和分 解在生物调节作用下处于平衡状态， 随着年龄增长， 以及紫外线辐射等环境因素引起生物 调节功能减弱， 胶原的分解作用大于生成作用时， 皮肤中胶原含量的下降， 皮肤相应出现弹 力减少、 皱纹产生等皮肤老化现象。 而通过合适的植物提取物调节胶原蛋白的生成， 或者适 当增加可以产生的胶原蛋白的成纤维细胞的数量， 就可以期待会对皮肤老化的现象有所改 善， 目前已有报道红杉新芽、 越桔新芽等来自植物提取物的抑制皮肤老化成分具有类似的 改善皮肤老化机理 ( 专利文献 CN200980106591.8 含有植物的新芽提取物的用于抑制皮肤 说 明 书 CN 106266582 A 4。
14、 2/8 页 5 老化的组合物 )。 0005 短管兔耳草Lagotis brevituba Maxim是玄参科兔耳草属植物， 生于海拔3000 4850 米的高山草甸及倒石堆、 碎石带上。主要分布于青海、 西藏、 甘肃等省区。全草入药， 具退热、 降血压、 调经解毒之功效 ； 治疗全身发热、 肾炎、 肺病、 阴道流黄黑色液物、 湿热泻 痢、 高血压病、 动脉粥样硬化症、 月经不调、 治痨热咳嗽、 霍乱、 伤寒、 黄疸、 目赤、 综合性毒物 中毒及 “心热” 等疾病，中华人民共和国卫生部药品标准藏药 ( 第 1 册 ) 载入的兔耳草 ( 藏名洪连 ) 为玄参科植物短管兔耳草 Lagotis b。
15、revituba Maxim( 藏名红林 ) 或全缘兔 耳草 L.integra W.Smith( 藏名洪连 ) 的干燥全草。性味苦、 甘、 寒。具清热解毒， 行血调经 之功能。全身发热、 肾炎、 肺病、 高血压病、 动脉粥样硬化、 月经不调、 综合性毒物中毒及 “心 热” 症。 0006 史高峰等对短管兔耳草的化学成分进行了系统的分析和研究， 从中分离鉴定 了 5 个已知化合物， 分别为 - 谷甾醇 (-sitosterol)， 软脂酸单甘油脂 (palmitic monloglycerol ester)，琥 珀 酸 (succinicacid)，木 犀 草 素 (luteolin)，木 犀。
16、 草 素 7-O-D- 葡萄糖苷 (luteolin-7-O-D-glucoside)。现代药理学研究显示短管兔耳草 水提物对大鼠血清性关节肿有明显的抑制作用， 对大鼠头部急性充血性水肿 ( 急性炎症 ) 有显著的抑制作用。短管兔耳草对大鼠甲醛性关节炎 ( 亚急性炎症 ) 有明显地预防作用 ； 另有研究显示短管兔耳草的总提取物对 P388 抑制率实验和小白鼠抗癌实验， 发现短管兔 耳草具有一定的抗肿瘤作用。此外， 青海省药品检验药物研究所的姜平、 杨娜等在 1984 年 对大鼠进行了胃溃疡、 镇静和毒性实验， 将其分为短管兔耳草实验组、 盐水对照组和胃膜素 对照组。结果发现， 以溃疡面积和溃疡。
17、容积为指标， 短管兔耳草与盐水对照组比较， 有显著 差异， 说明短管兔耳草水提物对大鼠慢性胃溃疡的愈合有明显的促进作用， 且较胃膜素对 照组的疗效为优。通过镇静实验， 结果显示短管兔耳草水提物可显著延长戊巴比妥钠的睡 眠时间， 说明其对小鼠有较好的镇静作用。 0007 综合短管兔耳草近年来的研究进展， 在其化学成分、 提取分离、 药理活性方面的研 究还处于初步研究阶段。对药效作用部位及作用机理方面的研究还只是一片空白。鉴于短 管兔耳草在藏药中的广泛应用及其丰富的自然资源， 对短管兔耳草进一步的研究及有效合 理地开发利用是十分必要的。尤为重要的是， 目前为止， 未发现短管兔耳草在化妆品领域， 尤。
18、其是抗衰老和美白的用途和报道。寻找安全有效、 抗衰老和美白效果好的皮肤外用剂是 目前急需解决的技术问题。 发明内容 0008 本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术中化妆品抗衰老和美白效果差、 安全性低等缺陷而提供了短管兔耳草提取物其制备方法和应用、 含其的皮肤外用剂。本发 明的含短管兔耳草提取物的组合物自由基清除率高、 酪氨酸酶抑制作用显著、 弹性蛋白酶 抑制作用显著、 抗氧化和老化效果明显、 同时表现出优良的美白性， 并且天然、 安全， 可用作 皮肤外用剂的美白活性成分和抗衰老活性成分。 本发明的皮肤外用剂成分天然、 安全， 并具 有美白、 抗氧化和老化的功效， 具有良好的市场应用前景。
19、。 0009 本发明提供了一种短管兔耳草提取物的制备方法， 其采用方法 1 或方法 2 ： 0010 所述的方法1包括如下步骤 ： 将短管兔耳草粉末与体积浓度为5080的乙醇 说 明 书 CN 106266582 A 5 3/8 页 6 水溶液形成的混合物， 在 10 35下提取 0.5 小时 5 小时， 固液分离得滤液， 滤液脱除 溶剂， 即得短管兔耳草粗提物 ； 其中， 所述的短管兔耳草粉末与所述的乙醇水溶液的质量体 积比为 (1 ： 8)g/mL (1 ： 15)mg/mL ； 所述的体积浓度是指乙醇的体积与乙醇水溶液总体积 的百分比。 0011 所述的方法2包括如下步骤 ： 将方法1得。
20、到的短管兔耳草粗提物， 上样到大孔树脂 填充柱， 依次用溶剂、 溶剂和溶剂洗脱， 分别收集洗脱液， 并脱除溶剂后， 相应地得到 溶剂洗脱部位 A、 溶剂洗脱部位 B 和溶剂洗脱部位 C。所述的溶剂 I、 所述的溶剂 II 和所述 的溶剂 III 分别为体积浓度为 20 30的乙醇水溶液、 体积浓度为 40 50的乙醇 水溶液和体积浓度为 60 70的乙醇水溶液。溶剂 I 对应溶剂洗脱部位 A ； 溶剂 II 对 应溶剂洗脱部位 B ； 溶剂 III 对应溶剂洗脱部位 C。 0012 方 法 1 中， 所 述 的 短 管 兔 耳 草 (Lagotis brevituba Maxim 或 者 L.。
21、integra W.Smith) 为玄参科 (Scrophulariaceae) 兔耳草属 (Lagotis) 植物。 0013 方法 1 中， 所述的短管兔耳草粉末的粒度较佳地为 20 目 60 目。 0014 方法 1 中， 所述的提取为本领域中该类操作的常规方法， 较佳地为超声提取。所述 的超声提取的功率较佳地为 500w 1000w。 0015 方法 1 中， 所述的提取的温度较佳地为 20 25。 0016 方法 1 中， 所述的提取的时间较佳地为 0.5 小时 1 小时。 0017 方法 1 中， 所述的提取的次数较佳地为 1 2 次。 0018 方法 1 中， 所述的短管兔耳草粉。
22、末与所述的乙醇水溶液的质量体积比较佳地为 (1:10)g/mL (1:15)g/mL， 更佳地为 (1:10)g/mL (1:12)g/mL。 0019 方法 1 中， 所述的乙醇的体积浓度较佳地为 70。 0020 方法 1 中， 所述的固液分离的方法为本领域中该类操作的常规方法， 较佳地为过 滤、 压滤或离心。 0021 方法 1 中或方法 2 中， 所述的滤液脱除溶剂的方法为本领域中该类操作的常规方 法， 较佳地为减压旋蒸。所述的减压旋蒸的操作条件为本领域中该类操作的常规条件。 0022 方法 1 中所述的 “滤液脱除溶剂” ， 可以为脱除全部溶剂或者仅脱除乙醇。当方法 1 中所述的 “。
23、滤液脱除溶剂” 为脱除全部溶剂时， 方法 2 中所述的 “将方法 1 得到的短管兔 耳草粗提物， 上样到大孔树脂填充柱” 需要将方法 1 得到的短管兔耳草粗提物用水溶解后， 再上样到大孔树脂填充柱。当方法 1 中所述的 “滤液脱除溶剂” 为仅脱除乙醇时， 得到的短 管兔耳草粗提物中含有水， 方法 2 中所述的 “将方法 1 得到的短管兔耳草粗提物， 上样到大 孔树脂填充柱” 就可以直接将方法 1 得到的短管兔耳草粗提物， 上样到大孔树脂填充柱， 而 不需要将方法 1 得到的短管兔耳草粗提物用水溶解后， 再上样到大孔树脂填充柱。 0023 方法 2 中， 所述的大孔树脂填充柱为本领域常规的大孔树。
24、脂填充柱， 较佳地为 D101、 AB-8 或 ADS-8 树脂填充柱， 更佳地为 AB-8 树脂填充柱。 0024 方法 2 中， 所述的溶剂较佳地为体积浓度为 30的乙醇。所述的溶剂较佳地 为体积浓度为 50的乙醇。所述的溶剂较佳地为体积浓度为 70的乙醇。 0025 方法2中， 所述的溶剂、 溶剂、 溶剂的用量分别较佳地为500mL800mL。 所 述的溶剂、 溶剂或溶剂的用量可以相同或不同， 较佳地所述的溶剂、 溶剂或溶剂 的用量相同。 说 明 书 CN 106266582 A 6 4/8 页 7 0026 方法 2 中， 所述的脱除溶剂的方法为本领域中该类操作的常规方法， 较佳地为减。
25、 压旋蒸。所述的减压旋蒸的操作条件为本领域中该类操作的常规条件。 0027 本发明还提供了所述的制备方法制得的短管兔耳草提取物。 所述的短管兔耳草提 取物包括方法 1 制得的短管兔耳草粗提物、 方法 2 制得的溶剂洗脱部位 A、 方法 2 制得的溶 剂洗脱部位 B 和方法 2 制得的溶剂洗脱部位 C 中的一种或多种。所述的短管兔耳草提取物 较佳地为方法 2 制得的溶剂洗脱部位 C。 0028 本发明还提供了所述的短管兔耳草提取物在制备皮肤外用剂中的应用。 0029 本发明中， 所述的短管兔耳草提取物在制备皮肤外用剂时作为美白活性成分、 抗 老化活性成分和抗氧化活性成分中的一种或多种， 较佳地作。
26、为抗氧化活性成分。 0030 本发明中， 所述的皮肤外用剂包括本领域常规的具备疾病治疗用途的药物， 或者 不具备疾病治疗用途的化妆品。 0031 本发明还提供了一种包括所述的短管兔耳草提取物的皮肤外用剂。 0032 在不违背本领域常识的基础上， 上述各优选条件， 可任意组合， 即得本发明各较佳 实例。 0033 本发明所用试剂和原料均市售可得。 0034 本发明的积极进步效果在于 ： 本发明的短管兔耳草提取物具有较好的美白、 抗老 化和抗氧化的功效， 有良好的市场化前景。 具体实施方式 0035 下面通过实施例的方式进一步说明本发明， 但并不因此将本发明限制在所述的实 施例范围之中。 下列实施。
27、例中未注明具体条件的实验方法， 按照常规方法和条件， 或按照商 品说明书选择。 0036 实施例 1 以体积浓度为 50的乙醇水溶液为提取溶剂 ( 方法 1) 0037 短管兔耳草干燥粉末 20g( 短管兔耳草粉末的粒度为 20 目 )， 室温下 (25 ) 下以 体积浓度为50的乙醇水溶液200ml、 超声提取2次， 每次30min(功率500W)， 取滤液合并， 减压 (50 ) 回收溶剂至干， 取提取物适量， 加 DMSO( 二甲亚砜 ) 配制成 0.05mg/ml 的溶液 备用， 测定其自由基清除作用， 其自由基清除率为 15。 0038 实施例 2 以体积浓度为 60的乙醇水溶液为提。
28、取溶剂 ( 方法 1) 0039 短管兔耳草干燥粉末 20g( 短管兔耳草粉末的粒度为 30 目 )， 室温 (25 ) 下以体 积浓度为 60的乙醇水溶液 200ml、 超声提取 2 次， 每次 30min( 功率 500W)， 取滤液合并， 减压 (50 ) 回收溶剂至干， 取提取物适量， 加 DMSO( 二甲亚砜 ) 配制成 0.05mg/ml 溶液备 用， 测定其自由基清除作用， 其自由基清除率为 17。 0040 实施例 3 以体积浓度为 70的乙醇水溶液为提取溶剂 ( 方法 1) 0041 短管兔耳草干燥粉末 20g( 短管兔耳草粉末的粒度为 40 目 )， 室温 (25 ) 下以。
29、体 积浓度为 70的乙醇水溶液 200ml、 超声提取 2 次， 每次 30min( 功率 500W)， 取滤液合并， 减压 (50 ) 回收溶剂至干， 取提取物适量， 加 DMSO( 二甲亚砜 ) 配制成 0.05mg/ml 溶液备 用， 测定其自由基清除作用， 其自由基清除率为 48。 0042 实施例 4 以体积浓度为 80的乙醇水溶液为提取溶剂 ( 方法 1) 0043 短管兔耳草干燥粉末 20g( 短管兔耳草粉末的粒度为 50 目 )， 室温 (25 ) 下以体 说 明 书 CN 106266582 A 7 5/8 页 8 积浓度为 80乙醇 200ml、 超声提取 2 次， 每次 。
30、30min(500W)， 取滤液合并， 减压 (50 ) 回 收溶剂至干， 取提取物适量， 加 DMSO( 二甲亚砜 ) 配制成 0.05mg/ml 溶液备用， 测定其自由 基清除作用， 其自由基清除率为 23。 0044 实施例 5 短管兔耳草与所述的乙醇水溶液的质量体积比为 (1:8)g/mL 进行提取 0045 短管兔耳草干燥粉末 20g( 短管兔耳草粉末的粒度为 60 目 )， 室温 (25 ) 下以体 积浓度为 70的乙醇水溶液 160ml、 超声提取 2 次， 每次 30min( 功率 500W)， 取滤液合并， 减压 (50 ) 回收溶剂至干， 取提取物适量， 加 DMSO( 二。
31、甲亚砜 ) 配制成 0.05mg/ml 溶液备 用， 测定其自由基清除作用， 其自由基清除率为 28。 0046 实施例 6 短管兔耳草与所述的乙醇水溶液的质量体积比为 (1:10)g/mL 进行提取 0047 短管兔耳草干燥粉末 20g( 短管兔耳草粉末的粒度为 60 目 )， 室温 (25 ) 下以体 积浓度为 70的乙醇水溶液 200ml 冷浸、 超声提取 2 次， 每次 30min( 功率 500W)， 取滤液合 并， 减压(50)回收溶剂至干， 取提取物适量， 加DMSO(二甲亚砜)配制成0.05mg/ml溶液 备用， 测定其自由基清除作用， 其自由基清除率为 48。 0048 实施。
32、例 7 短管兔耳草与所述的乙醇水溶液的质量体积比为 (1:12)g/mL 进行提取 0049 短管兔耳草干燥粉末 20g( 短管兔耳草粉末的粒度为 60 目 )， 室温 (25 ) 下以 体积浓度为 70乙醇水溶液 240ml、 超声提取 2 次， 每次 30min(500W)， 取滤液合并， 减压 (50 ) 回收溶剂至干， 取提取物适量， 加 DMSO( 二甲亚砜 ) 配制成 0.05mg/ml 溶液备用， 测 定其自由基清除作用， 其自由基清除率为 48。 0050 实施例 8 短管兔耳草与所述的乙醇水溶液的质量体积比为 (1:15)g/mL 进行提取 0051 短管兔耳草干燥粉末 20。
33、g( 短管兔耳草粉末的粒度为 60 目 )， 室温 (25 ) 下以体 积浓度为 70的乙醇水溶液 300ml、 超声提取 2 次， 每次 30min( 功率 500W)， 取滤液合并， 减压 (50 ) 回收溶剂至干， 取提取物适量， 加 DMSO( 二甲亚砜 ) 配制成 0.05mg/ml 溶液备 用， 测定其自由基清除作用， 其自由基清除率为 39。 0052 实施例 1-8 的结果表明 ： 选取以体积浓度为 70的乙醇溶液为提取溶剂， 短管兔 耳草与乙醇水溶液的质量体积比为 1:10g/mL 提取效果最佳。 0053 实施例 9 0054 取短管兔耳草干燥粉末 50g( 短管兔耳草粉末。
34、的粒度为 60 目 )， 室温 (25 ) 下 以体积浓度为 70的乙醇水溶液 500ml、 超声提取 2 次， 每次 30min( 功率 500W)， 滤液合并 ( 约 900ml)， 减压 (50 ) 回收溶剂至无醇味 ( 即仅除去乙醇 )， 过 AB-8 树脂， 依次以 500ml 体积浓度为 30的乙醇水溶液， 500ml 体积浓度为 50的乙醇水溶液和 500ml 体积浓度为 70的乙醇水溶液洗脱， 分别收集各洗脱液(各约400ml)， 蒸干， 分别得到洗脱部位A(对应 体积浓度为30的乙醇水溶液的洗脱剂， 1.85g)、 溶剂洗脱部位B(对应体积浓度为50的 乙醇水溶液的洗脱剂， 。
35、1.05g) 和溶剂洗脱部位 C( 对应体积浓度为 70的乙醇水溶液的洗 脱剂， 0.78g)。 0055 效果实施例 1 0056 本效果实施例考察的是短管兔耳草提取物的抗氧化活性。按照实施例 1-9 制备的 短管兔耳草提取物， 测定其清除 1， 1- 二苯基 -2- 三硝基苯肼 (DPPH) 自由基能力。 0057 测定步骤为 ： 将短管兔耳草提取物分别用去离子水配制成水溶液， 移取 2mL 于 10mL 具塞试管中， 加入 2mL DPPH 乙醇溶液 (210-4mol/L)， 充分混匀， 室温静置， 30min 后 说 明 书 CN 106266582 A 8 6/8 页 9 用分光光。
36、度计测定517nm波长的吸光度A517； 同时测定2mL提取物溶液与2mL乙醇混合后的 吸光度 A0， 2mL 水与 2mL DPPH 乙醇溶液混合后的吸光度 C 以及 2mL 水与 2mL 乙醇溶液混合 后的吸光度C0。 平行测定三次， 取平均值， 根据以下公式计算自由基清除率， 清除率越大， 说 明提取物的抗氧化能力越强。 0058 自由基清除率 ( ) 1-(A517-A0)/(C-C0)100。 0059 表 1 DPPH 法自由基清除活性的测定结果 0060 0061 0062 由表 1 可见， 短管兔耳草提取物具有很强清除自由基的能力， 经大孔吸附树脂分 离后得到的短管兔耳草体积浓。
37、度为 70的乙醇水溶液洗脱部位清除自由基的活性最强。 0063 效果实施例 2 0064 本效果实施例考察的是短管兔耳草提取物对于酪氨酸酶的抑制活性。 按照实施例 说 明 书 CN 106266582 A 9 7/8 页 10 9制备的短管兔耳草提取物， 溶于去离子水， 配制成水溶液， 用于测定酪氨酸酶抑制活性。 测 定步骤为 ： 磷酸盐缓冲溶液(pH6.8， 30mM)70L、 1.66mM酪氨酸溶液80L、 样品溶液80L 混合均匀， 在 37恒温水槽中温育 5 分钟， 加入酪氨酸酶溶液 (125U/mL)10L， 在 37恒 温 10min 后， 用酶标仪测定 475nm 波长的吸光度 。
38、A475。用去离子水替换样品水溶液， 作为参 比溶液同样测定吸光度， 结果见表 2。 0065 酪氨酸酶活性抑制率计算公式为 ： 抑制率 ( ) (A0-(A475-B)/A0100， 其中 A0是参比溶液的吸光度， A 475是样品溶液的吸光度， B 是样品空白水溶液的吸光度。 0066 表 2 酪氨酸酶抑制活性的测定结果 0067 0068 0069 由表 2 可知， 在本发明中使用的各短管兔耳草提取物都具有酪氨酸酶活性抑制作 用。其中， 经大孔吸附树脂分离后得到的短管兔耳草体积浓度为 70的乙醇水溶液洗脱部 位抑制酪氨酸酶作用较强， 可以将其配合在外用剂中， 作为防止肌肤色素沉着的美白活。
39、性 物使用。 0070 效果实施例 3 0071 本效果实施例考察的是短管兔耳草提取物的抗老化活性。按照实施例 9 制备的短 管兔耳草提取物， 溶于去离子水， 配制成水溶液， 用于测定弹性蛋白酶抑制活性。测定方法 按照文献(Am.J.Pharmacol.Toxicol.,2009,4,127-129)方法进行， 测定步骤为 ： 在96孔板 中加入 10L 样品溶液和 130L 含有 1.015mM 反应底物 Succ-Ala-Ala-Ala-p- 硝基酰替 苯胺的 0.1M Tris-HCl 缓冲溶液 (pH8.0)， 在 25下温育 5 分钟， 加入 15L 弹性蛋白酶溶 液 (0.5U/m。
40、L)， 继续在 25下温育 30min， 然后用酶标仪测定 410nm 波长的吸光度 A410。用 去离子水替换样品水溶液， 作为参比溶液同样测定吸光度， 结果见表 3。 0072 弹性蛋白酶活性抑制率计算公式为 ： 抑制率 ( ) (A0-(A410-B)/A0100， 其 中 A0是参比溶液的吸光度， A 410是样品溶液的吸光度， B 是样品空白溶液的吸光度。 0073 表 3 弹性蛋白酶活性抑制的测定结果 说 明 书 CN 106266582 A 10 8/8 页 11 0074 0075 由表 3 可知， 在本发明中使用的短管兔耳草提取物均具有抑制弹性蛋白酶作用， 其中， 经大孔吸附树脂分离后得到的短管兔耳草体积浓度为 70的乙醇水溶液洗脱部位抑 制弹性蛋白酶作用最强， 可以将其配合在外用剂中， 作为防止肌肤老化、 维持年轻健康的肌 肤状态的抗老化剂使用。 说 明 书 CN 106266582 A 11 。