技术领域
本发明涉及医药技术领域，更具体地说，涉及HMG-CoA还原酶抑制剂(他汀类化合物)修复神经损伤的新用途。
背景技术
外周神经损伤是常见的的临床严重创伤，引起神经缺损、靶肌肉萎缩和运动功能障碍，是目前临床急需解决的难题。一般来说，短距离的外周神经损伤通过神经断端吻合即可达到治疗的效果，而长距离的神经缺损的治疗是以自体神经移植为“金标准”。然而，自体神经移植有一定的限制，包括来源、供区神经支配功能缺失、二次手术造成创伤感染等。因此，能够替代自体神经移植的人工复合材料是临床所急需。
有研究发现利用壳聚糖、海藻酸、硅胶管等中空导管可促进神经缺损的修复。然而，神经再生不仅需要依靠外部导管的引导作用，还需要内部填充支架作为神经再生的支架和定向引导。因此内部填充神经营养因子作为一种有效的疗法来促进神经的修复，但是往往外部添加的神经营养因子存在费用昂贵、半衰期短、降解速率快、难以维持靶器官药物浓度等缺点，如果能够通过复合小分子化合物和人工导管诱导内源性神经营养因子分泌来促进神经修复将具有广阔的临床应用前景和研究价值。
针对以上问题，本领域期待一种新型材料复合药物能持续刺激分泌内源性神经营养因子从而达到促进神经再生的作用。
他汀类药物作为降脂药，目前在临床广泛应用，并作为心脑血管疾病预防的一线药物，安全有效，很多国家甚至将其列为OTC药物。已有国内外文献报道他汀类药物具有一定的神经保护作用，机制不明，可能与其抗炎、改善血运循环有关。有文献报道，利用辛伐他汀灌胃治疗外周神经损伤取得一定的疗效，但他汀类化合物作为降脂药，其靶器官是肝脏，口服后不到5％能够进入血液循环，局部浓度更低。
他汀的神经保护作用已有文献报道，但也有文献报道，服用他汀类药物出现记忆和认知障碍在临床上其实并不少见，只是大部分医生都忽视了这些现象，毕竟它看起来不像高血糖、肌病和肝酶异常那么容易发现，后果也没有那么严重。通常症状较轻，且停药后可逆。美国亚利桑那大学对1040种药物进行测试，发现他汀类药物会在神经突内造成结节形成,造成神经毒性(A cell-based fascin bioassay identifies compounds with potential anti-metastasis or cognition-enhancing functions.Dis Model Mech.2013；6(1):217–35.)。对神经再生和神经修复替代材料方面的应用却未见报道，目前尚无报道局部应用他汀类药物修复神经缺损、治疗神经损伤、促进修复。
发明内容
本发明发明人令人惊奇地发现了在桥接神经缺损壳聚糖中空导管内局部利用泊洛沙姆水凝胶为载体的他汀类化合物可促进内源性营养因子分泌及轴突生长，促进神经再生，治疗神经损伤。
本发明的一个目的是提供他汀类化合物或其水凝胶或含有所述水凝胶的复合材料修复人或哺乳动物神经损伤的用途。
一方面，本发明提供了他汀类化合物或其水凝胶或含有所述水凝胶的复合材料用于修复人或动物神经损伤的新用途。
换句话来说，本发明提供了用于修复人或动物神经损伤的他汀类化合物或其水凝胶或含有所述水凝胶的复合材料；本发明也提供了修复人或动物神经损伤的方法，包括使用他汀类化合物或其水凝胶或含有所述水凝胶的复合材料。
在本发明的实施方案中，本发明提供了他汀类或其水凝胶或含有所述水凝胶的复合材料用于修复人或哺乳动物神经损伤的新用途，其中，所述的神经损伤包括但不限于坐骨神经等外周神经损伤。鉴于他汀类化合物促进内源性神经营养因子的分泌，同样也可适用于大脑、脊髓等中枢神经损伤的再生修复。
本发明提供了一种他汀类化合物或其药学上可接受的盐在制备修复哺乳动物或人类神经损伤的药物中的用途。
在本发明的一种实施方案中，本发明也提供了他汀类水凝胶或其复合材料用于修复神经损伤的用途，这里，所述的他汀类水凝胶包括药学上有效量的他汀类化合物或其药学上可接受的盐、水和药学上可接受的水凝胶辅料。所述的他汀类水凝胶复合材料包括上述的水凝胶和导管。所述导管为中空导管，起到引导作用。
上述导管的材料可以选自壳聚糖、硅胶、胶原、海藻酸盐、明胶或聚 乳酸，它们可以通过市场上购买获得；也可以选自脱细胞支架和静脉、肌肉或羊膜等自体组织，它们可以由技术人员实验时自己制备。
在本发明的一种具体实施方案中，其中，所述的神经损伤是周围神经损伤。
在本发明的一种具体实施方案中，其中，所述药物为局部施用的药物剂型。
在本发明的一种具体实施方案中，其中，所述的药物为缓释剂型。
在本发明的一种具体实施方案中，其中，所述的缓释剂型的载体为水凝胶，优选为温敏性水凝胶。
在本发明的一种具体实施方案中，其中，所述的他汀类水凝胶与导管优选壳聚糖导管一起使用。
在本发明的一种实施方案中，他汀类、他汀类水凝胶或他汀类水凝胶复合材料中的他汀类化合物包括，但不限于，辛伐他汀、阿托伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀、瑞舒伐他汀、匹伐他汀、柏伐他汀、西立伐他汀、克伐他汀、达伐他汀、美伐他汀、或替伐他汀等HMG-CoA还原酶抑制剂。他汀类化合物也可以是药学上可接受盐的形式，例如，包括但不限于他汀类化合物的盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐、甲磺酸盐、三氟醋酸盐或乙酸盐、钠盐、钾盐、钙盐或镁盐。
优选地，所述的他汀类化合物选自辛伐他汀、阿托伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀、瑞舒伐他汀和/或匹伐他汀；而且优选地，它们的药 学上可接受盐选自盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐、甲磺酸盐、钠盐、钾盐、钙盐或镁盐。
更优选地，所述的他汀类化合物或其药学上可接受的盐选自辛伐他汀、阿托伐他汀钙或阿托伐他汀钠、氟伐他汀钠、普伐他汀钠、瑞舒伐他汀钙和/或匹伐他汀钙。
本发明的另一个目的是提供一种他汀类化合物或其药学上可接受的盐的水凝胶。
另一方面，本发明提供了一种他汀类化合物或其药学上可接受的盐的水凝胶，其用于修复哺乳动物或人类神经损伤，包括他汀类化合物或其药学上可接受的盐、水和水凝胶辅料，其中所述水凝胶辅料选自泊洛沙姆、壳聚糖、聚乳酸、纤维素类、透明质酸、纤维蛋白胶等其它可降解吸收的材料；优选泊洛沙姆。它们可以通过市购获得。
上述水凝胶辅料还可以选自海藻酸、聚L-赖氨酸、聚L-谷胺酸等。合成的亲水高分子例如聚丙烯酸，聚甲基丙烯酸，聚丙烯酰胺，聚N-聚代丙烯酰胺等可以使用。
本发明的另一个目的是提供上述水凝胶的制备方法。
另一方面，本发明提供了上述水凝胶的制备方法，包括将水凝胶辅料在低温下溶于水中形成均匀的溶液，直接添加治疗有效量的他汀类药物粉末，持续搅拌成均匀溶液；优选地，将所述水凝胶辅料的粉末溶于水中，在低温(例如4°)形成浓度为25％(W/V)的均匀溶液，低温下(例如4°)直接添加他汀类药物粉末，持续搅拌成均匀溶液，于4°保存。上述方法 中的原料可以通过市购获得。
本发明的另一个目的是提供一种他汀类水凝胶复合材料。
另一方面，本发明提供了一种他汀类水凝胶复合材料，包括上述的他汀类化合物或其药学上可接受的盐的水凝胶和导管。所述水凝胶的辅料可选自泊洛沙姆、壳聚糖、聚乳酸、纤维素类、透明质酸、纤维蛋白胶等其它可降解吸收的材料。优选地，所述他汀类水凝胶复合材料包括他汀类化合物或其药学上可接受的盐的泊洛沙姆水凝胶和壳聚糖导管。更优选地，所述的水凝胶存在于所述导管中。所述导管材料可以选自壳聚糖、硅胶、胶原、海藻酸盐、明胶或聚乳酸；也可以选自脱细胞支架和静脉、肌肉或羊膜等自体组织。它们可以通过上述方式获得。
在本发明的一种实施方案中，所述他汀类水凝胶复合材料优选为神经损伤处局部施用。本发明所述的他汀类水凝胶可以以注射剂的形式存在。
在本发明实施方案中，对哺乳动物或人类神经损伤处局部施用他汀类水凝胶或其复合材料，选用他汀类的剂量可以为0.1mg至10mg之间。对于临床医师而言，在本发明的教导下，其可根据临床治疗效果的需要，调整或者修改给药的次数和剂量。
本发明的另一个目的是提供一种他汀类水凝胶复合材料的制备方法。
另一方面，本发明也提供了他汀类水凝胶复合材料的制备方法，包括下面步骤：
(i)提供一种桥接神经部位的导管；
优选地，
将导管材料溶解于适当的溶剂中形成溶液，将玻璃毛细管或玻璃棒垂直插入所得材料溶液中使得玻璃毛细管或玻璃棒的外壁均匀涂敷所述材料溶液，然后垂直提出，再浸入NaOH溶液中，静置一段时间后取出，随后用蒸馏水洗净直至pH值呈中性；抽出玻璃毛细管或玻璃棒，即完成该材料中空导管的制备；
(ii)提供一种他汀类的水凝胶；优选地，包括将上述水凝胶辅料在低温下溶于水中形成均匀的溶液，直接添加治疗有效量的他汀类药物粉末，持续搅拌成均匀溶液；
(iii)将上述(ii)制备的他汀类水凝胶充分混匀，在保持低温状态下，加入上述步骤(i)所述的导管内，升高温度后即可形成他汀类水凝胶复合材料。
经实验证明，本发明的他汀类水凝胶复合材料神经损伤处局部应用可诱导内源性神经营养因子分泌及促进轴突生长，治疗神经损伤。
附图说明
图1表示的壳聚糖导管载辛伐他汀温敏型水凝胶的特性图。
图1A表示壳聚糖导管的尺寸为内径1.6mm，外径2.0mm，长度14mm；
图1B表示壳聚糖导管表面的扫描电镜图可看到有不规则的孔隙；
图1C表示辛伐他汀温敏型水凝胶在4℃为液态，升温至37℃时实现相转变为固态，体外降解实验表明其在14天内逐步降解完全；
图1D表示辛伐他汀水凝胶透射电镜下的有规则多孔特性；
图1E表示辛伐他汀温敏型水凝胶的流变特性，包括弹性模量(G’)、粘性模量(G”)、相转变温度。
图2表示的是辛伐他汀水凝胶应用前后效果图。
图2A表示手术操作图；
图2B表示不同含量辛伐他汀水凝胶应用10周后神经再生效果图，显示辛伐他汀复合材料可显著促进神经再生。
图3表示的是实验期间在第4,6,8,10周的步态分析图。
图3A、3B表示各治疗组的有代表性的脚印图；
图3C表示步态分析的统计图，图中可见辛伐他汀治疗组的步态明显恢复(与对照组比较，*p<0.05,**p<0.01)，且贯穿于整个实验周期。
图4表示的是治疗后10周的神经电生理检测结果。
图4A列出有代表性的CMAPs(腓肠肌混合肌肉运动诱发电位)；
图4B,4C分别列出CMAPs的波幅和神经传导速度的统计图，图中可见辛伐他汀治疗组的大鼠的CMAPs的波幅和神经传导速度恢复明显(与对照组比较，*p<0.05,**p<0.01)。
图5表示的是治疗后10周荧光金逆行示踪以示神经再生情况的结果。
图5A列出有代表性的在背根神经节表达荧光金的情况；
图5B为荧光金标记阳性神经元计数的统计图，图中可见辛伐他汀治疗组的大鼠背根神经节有更多的荧光金标记的神经元(与对照组比较，*p<0.05,**p<0.01)。
图6表示的是治疗后10周再生神经中段的组织学形态。
图6A,6B,6C分别为再生神经中段H&E染色，抗神经丝和抗S100免疫组化有代表性的形态图，图中可见辛伐他汀治疗组的再生神经表达更多的神经丝(NF)和S100；NF和S100分别用来代表轴突和施旺细胞。
图7表示的是治疗后10周再生神经中段的透射电镜形态。
图7A是甲苯胺蓝染色显示再生的轴突；
图7B,7C,7D分别为有髓神经纤维的轴突直径，髓鞘厚度和G-ratio的统计图，图中可见辛伐他汀治疗组的轴突直径、髓鞘厚度明显增大，G-ratio明显减小(与对照组比较，*p<0.05,**p<0.01)。
图8表示的是治疗10周后靶肌肉腓肠肌的神经再支配情况。
图8A，8D分别为腓肠肌相对湿重百分比及其统计图，图中可见辛伐他汀治疗组的腓肠肌相对湿重恢复明显增加(与对照组比较，*p<0.05,**p<0.01)；
图8B,8E分别为腓肠肌光镜下肌纤维面积百分比及其统计图，图中可见辛伐他汀治疗组腓肠肌的肌纤维面积百分比明显增加(与对照组比较，*p<0.05,**p<0.01)；
图8C为α-金环蛇毒素标记的运动终板的形态图。
图9表示的是治疗后10周的神经再生中段的神经营养因子的表达情况，分别为PTN(多效生长因子),HGF(肝细胞生长因子),VEGF(血管内皮生长因子),GDNF(胶质源性神经生长因子),BDNF(脑源性神经生长因子),CTNF(睫状神经节生长因子)和LIF(白血病抑制因子)，其中前四个在辛伐他汀治疗组表达明显升高，而后3个无显著性差异。
具体实施方式
下面通过实施例来进一步举例说明本发明的可实施性，但是无论如何不能解释为对本发明的限制。对于本领域的技术人员而言，根据现有技术的教导，在本发明实施方案的指导下，对其中的技术特征进行等同性修改 或替换是显而易见的，仍然属于本发明请求保护的范围内。
实施例1壳聚糖导管制备
将脱乙酰度为95％壳聚糖粉末溶解于8％的冰醋酸溶液中，将外径为1.6mm的玻璃毛细管垂直插入壳聚糖溶液中使得玻璃毛细管外壁均匀涂敷壳聚糖溶液，然后垂直提出，再浸入5％(w/v)的NaOH溶液中，静置30分钟，随后用蒸馏水洗净直至pH值呈中性。抽出玻璃毛细管，切成长度为14mm的节段，即完成壳聚糖导管的制备。
实施例2温敏型泊洛沙姆水凝胶制备
将泊洛沙姆407粉末溶于双蒸水中在低温形成浓度为25％的均匀溶液，低温下(4°)持续搅拌成均匀溶液。
实施例3辛伐他汀水凝胶复合材料制备
在保持冰浴状态下，分别在100ul泊洛沙姆407水凝胶溶液里加入辛伐他汀2.5mg、5mg，形成有辛伐他汀的泊洛沙姆407水凝胶溶液。使用时，将所述含有辛伐他汀的泊洛沙姆407水凝胶溶液充分混匀，注入桥接坐骨神经缺损壳聚糖中空导管内。由于壳聚糖中空导管体积为20ul，因此，最终填充中空管内的辛伐他汀剂量为0.5，1.0mg。升高温度后即可形成辛伐他汀水凝胶复合材料。
试验例1
壳聚糖导管载辛伐他汀水凝胶材料的特性检测
取制备好的壳聚糖导管于体式显微镜和扫描电镜下观察并采图，结果 见图1。
取制备好的辛伐他汀水凝胶进行体外降解实验。取2ml水凝胶放于4ml离心管中于待其转变为固态后添加2ml预热的PBS缓冲液，置于37℃孵箱中，缓冲液每24小时更换一次，直至水凝胶降解完全，结果见图1C。
取制备好的辛伐他汀水凝胶冻干，镀金，行透射电镜观察并采图，结果显示为多孔状结构，见图1D。
取制备好的辛伐他汀水凝胶置于流变仪行流变学检测，参数设定为频率1Hz，应力幅值0.1％，升温范围为4℃至45℃，测定弹性模量(G’)，粘性模量(G”)和相转变温度，结果见图1E。
从试验例2可以看出，依据本方法制备的中空管复合可注射辛伐他汀/泊洛沙姆水凝胶具有生物可降解，聚合过程中内部形成三维多孔样结构，有利于再生神经的生长进入。
试验例2
辛伐他汀水凝胶复合材料治疗坐骨神经缺损
按照标准操作程序，40只6-7周龄雄性SD大鼠随机分成4组，每组10只。
大鼠全身麻醉(10％水合氯醛腹腔内注射麻醉，3ml/kg)，在无菌条件下于左侧大腿做一切口暴露坐骨神经并游离，横断坐骨神经造成10mm间隔，间隔用壳聚糖导管缝合连接，其内不注射水凝胶或注射含不同剂量辛伐他汀的水凝胶(0mg，0.5mg，1mg)，青霉素局部涂抹，缝合肌肉皮肤， 分笼饲养。手术操作见图2A。
为比较局部施用辛伐他汀促进神经再生和修复的作用效果，分别采用单纯壳聚糖中空管作为对照，并选用没有负载辛伐他汀的泊洛沙姆水凝胶作为对照。单纯壳聚糖中空管、壳聚糖中空管内填充可注射泊洛沙姆水凝胶及壳聚糖中空管内填充可注射泊洛沙姆水凝胶负载辛伐他汀的制备参照实施例1，2，3。
期间定期进行步态测定，10周后取材进行再生神经和靶肌肉腓肠肌的检测。试验结果如图2B所示。单纯壳聚糖中空管对照组与壳聚糖中空管内填充可注射泊洛沙姆水凝胶对照组结果相同，共同表示为图2B中的导管组。
从试验例2可以看出，依据本方法制备的中空管复合可注射辛伐他汀/泊洛沙姆水凝胶手术操作简便实用。图2B显示辛伐他汀复合材料可显著促进神经再生。
试验例3
步态分析
术后4,6,8,10周进行步态测定，在大鼠脚底涂抹碘伏，让其在制好的通道中行走，记录下脚印图，根据公式
SFI＝-38.3×(EPL-NPL)/NPL+109.5×(ETS-NTS)/NTS+13.3×(EITS-NITS)/NITS-8.8
(其中EPL和NPL分别为术侧和正常侧的第三趾尖至足跟的距离；ETS和NTS分别为术侧和正常侧的第一足趾至第五足趾的距离；EITS和NITS分别 为术侧和正常侧的第二足趾至第四足趾的距离)
计算出SFI(坐骨神经指数)并进行统计分析，结果见下表1-1和图3。
表1-1术后4周，6周，8周，10周大鼠坐骨神经指数(SFI)统计学结果(n＝8，)
注：辛伐他汀0.5mg，1mg组分别与导管组，辛伐他汀0mg组比较，p**<0.01
从试验例3可以看出，在大鼠长节段坐骨神经缺损部位植入依据本方法制备的生物材料可明显促进神经再生，提高运动功能恢复。
试验例4
神经电生理检测
术后10周再暴露坐骨神经，于移植物近端与远端分别放置双极钩状电极进行刺激，腓肠肌中插入记录电极以记录CMAPs(混合肌肉运动诱发电位)，根据波幅和神经传导速度进行统计分析，结果见下表1-2和图4。
表1-2术后10周大鼠神经电生理统计学结果(n＝5，)
注：辛伐他汀0.5mg，1mg组分别与导管组，辛伐他汀0mg组比较，p*<0.05，p**<0.01
从试验例4可以看出，大鼠长节段坐骨神经缺损部位植入依据本方法制备的生物材料可明显促进神经再生，神经传导功能明显恢复。
试验例5
荧光金逆行示踪检测
术后9周再暴露坐骨神经，在移植物远端5mm注射5ul5％的荧光金溶 液，缝合切口，1周后取其背根神经节进行常规4％多聚甲醛固定，30％蔗糖脱水，O.C.T.包埋，冰冻切片16um，于荧光显微镜下观察并计数统计，结果见下表1-3和图5。
表1-3术后10周大鼠背根神经节荧光经(FG)标记阳性细胞数统计学结果(n＝4，)
注：辛伐他汀0.5mg，1mg组分别与导管组，辛伐他汀0mg组比较，p**<0.01
从试验例5可以看出，大鼠长节段坐骨神经缺损部位植入依据本方法制备的生物材料可明显促进神经再生，并且再生的神经有效发挥神经传导功能。
试验例6
再生神经组织的组织学和组织化学检测
术后10周取再生神经中段常规行中性福尔马林固定，脱水，石蜡包埋，5um厚度切片，一部分行H&E染色，普通光镜下观察，结果见图6。
另一部分做免疫组化检测，经过常规脱蜡，封闭内源性过氧化氢酶，抗原修复，一抗(NF,S100,PTN,HGF,VEGF,GDNF,BDNF,CNTF,LIF)孵育4℃过夜，二抗孵育室温30分钟，DAB显色，普通光镜下观察，结果见图6和图9。
从图6看出，辛伐他汀治疗组的再生神经表达更多的神经丝(NF)和S100；NF和S100分别用来代表轴突和施旺细胞。
图9中，PTN(多效生长因子),HGF(肝细胞生长因子),VEGF(血管内皮生长因子)和GDNF(胶质源性神经生长因子)在辛伐他汀治疗组 表达明显升高；BDNF(脑源性神经生长因子),CTNF(睫状神经节生长因子)和LIF(白血病抑制因子)在辛伐他汀治疗组表达无显著性差异。
从试验例6看出，大鼠长节段坐骨神经缺损部位植入依据本方法制备的生物材料可明显提高内源性神经营养因子的分泌，促进神经再生。
试验例7
再生神经组织的透射电镜检测
术后10周取再生神经中段行2.5％戊二醛固定，锇酸固定，脱水，用环氧树脂包埋剂Epon包埋，制备半薄切片行甲苯胺蓝染色和超薄切片行柠檬酸盐-乙酸双氧铀染色，普通光镜下观察，并进行对再生神经的轴突直径，髓鞘厚度和G-ratio行统计学分析，结果见下表1-4和图7。
表1-4术后10周大鼠再生神经中段透射电镜统计学结果(n＝3，)
注：轴突直径，髓鞘厚度：辛伐他汀0.5mg，1mg组分别与导管组，辛伐他汀0mg组比较，p*<0.05，p**<0.01。G-ratio：辛伐他汀0.5mg组分别与辛伐他汀0mg组，导管组比较，p*<0.05，p**<0.01，辛伐他汀1mg组与导管组比较，p**<0.01
从试验例7可以看出，大鼠长节段坐骨神经缺损部位植入依据本方法制备的生物材料可明显促进神经髓鞘轴突再生。
试验例8
腓肠肌湿重和肌纤维重塑检测
术后10周取双侧腓肠肌行湿重测定并做统计，结果见图8。
腓肠肌中段一部分行常规10％中性福尔马林固定，脱水，石蜡包埋， 5um厚度横切片，行masson染色，统计肌纤维面积百分比，结果见图9。
腓肠肌中段另一部分行4％多聚甲醛固定，30％蔗糖脱水，O.C.T.包埋，冰冻切片16um，进行α-金环蛇毒素染色标记运动终板，结果见下表1-5和图8。
表1-5术后10周大鼠腓肠肌相对湿重及肌纤维面积百分比(n＝5，)
注：辛伐他汀0.5mg，1mg组分别与导管组，辛伐他汀0mg组比较，p*<0.05，p**<0.01
从试验例8可以看出，大鼠长节段坐骨神经缺损部位植入依据本方法制备的生物材料不仅可以显著促进神经再生，还可明显提高神经支配靶器官的神经接头生长进入，最终改善神经功能。
以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。