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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810241437.2 (22)申请日 2018.03.22 (71)申请人 中国人民解放军第二军医大学 地址 200433 上海市杨浦区翔殷路800号 (72)发明人 陈媛媛 蔡建明 高福 杨彦勇 雷霄 郭佳铭 李百龙 崔建国 刘哲 许洋 刘蕾 曲红金 (74)专利代理机构 上海元一成知识产权代理事 务所(普通合伙) 31268 代理人 赵青 (51)Int.Cl. A61K 31/7088(2006.01) A61K 31/713(2006.01) A61P 35/00。
2、(2006.01) (54)发明名称 抑制或下调AKAP12基因表达的试剂在制备 肿瘤放疗增敏药物中的应用 (57)摘要 本发明涉及基因药物领域， 具体是抑制或下 调AKAP12基因表达的试剂在制备肿瘤放疗增敏 药物中的应用。 本发明提供了AKAP12基因和抑制 或下调AKAP12基因表达的试剂的新应用， 能够有 效提高肿瘤细胞的放射敏感性。 权利要求书1页 说明书5页 序列表1页 附图4页 CN 108464987 A 2018.08.31 CN 108464987 A 1.抑制或下调AKAP12基因表达的试剂在制备肿瘤放疗增敏药物中的应用。 2.根据权利要求1所述的抑制或下调AKAP12基。
3、因表达的试剂在制备肿瘤放疗增敏药物 中的应用， 其特征在于， 所述的抑制或下调AKAP12基因表达的试剂是通过RNA干扰沉默 AKAP12基因的试剂。 3.根据权利要求1所述的抑制或下调AKAP12基因表达的试剂在制备肿瘤放疗增敏药物 中的应用， 其特征在于， 所述的抑制或下调AKAP12基因表达的试剂是靶向AKAP12基因的 siRNA， 包括正义链和反义链， 所述的正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示， 所述的反义 链的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。 4.根据权利要求1所述的抑制或下调AKAP12基因表达的试剂在制备肿瘤放疗增敏药物 中的应用， 其特征在于， 所述的肿瘤。
4、放疗增敏药物促进肿瘤细胞凋亡， 促进肿瘤细胞G2期细 胞阻滞， 促进照射对肿瘤细胞的DNA损伤， 提高肿瘤细胞对放射治疗的敏感性。 5.根据权利要求1所述的抑制或下调AKAP12基因表达的试剂在制备肿瘤放疗增敏药物 中的应用， 其特征在于， 所述的肿瘤放疗增敏药物是用于肺癌的放疗增敏药物。 6.一种重组载体在制备肿瘤放疗增敏药物中的应用， 所述的重组载体中包含靶向 AKAP12基因的siRNA， 所述的靶向AKAP12基因的siRNA包括正义链和反义链， 所述的正义链 的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示， 所述的反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。 7.一种肿瘤放疗增敏剂， 。
5、所述的肿瘤放疗增敏剂中包含靶向AKAP12基因的siRNA； 所述 的靶向AKAP12基因的siRNA包括正义链和反义链， 所述的正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示， 所述的反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 108464987 A 2 抑制或下调AKAP12基因表达的试剂在制备肿瘤放疗增敏药物 中的应用 技术领域 0001 本发明涉及基因药物领域， 具体地说， 是抑制或下调AKAP12基因表达的试剂在制 备肿瘤放疗增敏药物中的应用。 背景技术 0002 肺癌是我国非常常见的肿瘤之一， 根据我国居民死因调查的结果， 肺癌死亡率。
6、从 20世纪70年代中期至90年代初期的20年增加近1.5倍， 是增长最快的恶性肿瘤。 肺癌一般指 的是肺实质部的癌症， 通常不包含其他肋膜起源的中胚层肿瘤， 或者其他恶性肿瘤如类癌、 恶性淋巴瘤， 或是转移自其他来源的肿瘤。 肺癌占了肺实质恶性肿瘤的90-95。 近50年来， 世界上很多国家的肺癌发病率和死亡率呈急剧上升趋势。 根据世界卫生组织的数据， 肺癌 目前是全世界癌症死因的第一名， 约占全部恶性肿瘤的19。 全世界每年的新增病例超过 120万。 在男性肿瘤死因中已居首位， 在女性中仅次于乳腺癌居第二位。 男女患病率为2.3: 1。 目前已知肺癌的发生有多个危险因素， 如吸烟， 环境污。
7、染， 职业暴露， 肺部慢性疾病和人 体自身免疫力下降等因素， 存在危险因素的个体患肺癌的概率会增加。 相应的预防肺癌的 发生就要减少危险因素暴露， 如戒烟， 在石棉等暴露环境中工作使用保护面罩等。 肺癌的病 因至今尚不完全明确， 但是严重影响了患者的生命健康和生存质量。 目前肺癌的主要治疗 手段包括手术治疗、 放射治疗、 化学治疗及靶向治疗。 其中， 放射治疗是是治疗非小细胞肺 癌的重要手段， 但很多患者出现辐射抵抗， 治疗效果不如人意。 肿瘤对辐射不敏感或对辐射 产生抗拒性， 是放射治疗难以根治恶性肿瘤的主要原因之一。 0003 A型激酶锚定蛋白12(Akinaseanchoring pro。
8、tein12， AKAP12)是A型激酶锚定蛋 白家族的成员之一。 AKAP12是一种细胞支架蛋白， 其基因定位于6q24-q25.2， 其表达产物最 初是由Gordon从重症肌无力患者的血清中获得。 目前研究发现， AKAP12能够锚定一些关键 信号分子， 从而调节蛋白激酶A(proteinkinase A， PKA)、 蛋白激酶C(proteinkinase C， PKC)和细胞周期素D1(cyclinD1)等多条信号途径。 AKAP12是通过与PKA、 PKC、 钙调蛋白、 磷 酸酯酶、 B2-肾上腺素受体等多种分子形成信号复合物， 以此参与cAMP-PKA、 PKC及其他信号 转导通路。
9、， 促进局部信号转导的效率和反应特异性， 从而辅助细胞运动， 调节细胞分泌和有 丝分裂。 大量研究表明， AKAP12是一种肿瘤抑制基因； 且在多种人类肿瘤中表达下调或缺 失， 但在放疗耐受肿瘤中高表达； 同时研究发现， AKAP12不仅能够抑制肿瘤发生， 而且能够 抑制肿瘤转移。 这些研究表明， AKAP12与肿瘤的发生发展密切相关。 0004 然而抑制或下调AKAP12基因表达的试剂在制备肿瘤放疗增敏药物中的应用国内 外至今无人报道。 发明内容 0005 本发明的目的在于提供抑制或下调AKAP12基因表达的试剂的新用途， 即抑制或下 调AKAP12基因表达的试剂在制备肿瘤放疗增敏药物中的应。
10、用。 说 明 书 1/5 页 3 CN 108464987 A 3 0006 为了实现上述目的， 本发明的第一方面， 提供抑制或下调AKAP12基因表达的试剂 在制备肿瘤放疗增敏药物中的应用。 0007 进一步的， 所述的抑制或下调AKAP12基因表达的试剂是通过RNA干扰(RNAi)沉默 AKAP12基因的试剂。 0008 进一步的， 所述的抑制或下调AKAP12基因表达的试剂是靶向AKAP12基因的siRNA， 包括正义链和反义链， 所述的正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示； 所述的反义链的核 苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。 0009 正义链： 5 -AGACGGAUG。
11、UAGUGUUGAA-3 (SEQ ID NO:1)； 0010 反义链： 5 -UUCAACACUACAUCCGUCU-3 (SEQ ID NO:2)； 0011 正义链和反义链都在3 端再加上TT以增加siRNA的稳定性。 0012 进一步的， 所述的肿瘤放疗增敏药物促进肿瘤细胞凋亡， 促进肿瘤细胞G2期细胞 阻滞， 促进照射对肿瘤细胞的DNA损伤， 提高肿瘤细胞对放射治疗的敏感性。 0013 进一步的， 所述的肿瘤放疗增敏药物是用于肺癌的放疗增敏药物。 0014 本发明将AKAP12siRNA及NC序列通过脂质体3000(lipofectamine 3000)转入肺癌 细胞A549中， 。
12、72h应用Western blot对肺癌细胞A549的AKAP12蛋白进行检测。 结果发现： AKAP12siRNA可以有效抑制A549细胞中高度表达的AKAP12蛋白。 0015 进一步， 对正常A549细胞和转染AKAP12siRNA及NC序列的A549细胞给予不同剂量 (0、 2、 4、 8Gy)的60Co射线照射， 然后继续培养2周后采用克隆形成率检测细胞生长和增殖， 结果显示： 转染AKAP12siRNA的A549细胞随着照射剂量的增加， 细胞死亡率明显高于正常 A549细胞和转染NC序列的A549细胞。 同时， 本发明给予三种细胞8Gy的60Co射线照射， 然后 继续培养24h后采。
13、用Annexin V-FITC及PI双染后通过流式细胞仪检测细胞凋亡， 结果显示： 转染AKAP12siRNA的A549细胞的凋亡率照后明显高于正常A549细胞组及转染NC组。 0016 同时， 本发明将三种细胞以1105个/ml密度接种于六孔板， 加2mlDMEM培养基培 养； 第二天给予三种细胞8Gy的60Co射线照射， 分别在0h、 8h、 12h及24h用胰酶进行消化， 1000rpm离心5min； 用PBS液洗一遍， 弃上液； 用0.3ml PBS溶液重新悬浮细胞， 然后缓慢加入 4预冷的无水酒精0.7ml， -20冰箱过夜； 检测前进行PI单染： 1000rpm离心5min， 去上。
14、液； 加PBS清洗一遍， 加100 l 5mg/ml RNA酶溶液， 37保温30min， 然后冰浴终止酶作用； 加PI 染液(100 g/ml)避光染色30min； 应用FCM测细胞周期： 用EPICSXL流式细胞仪(美国贝克曼 库尔特公司)进行细胞周期分析， 氩离子激发PI荧光， 激发光波长为488nm， 用620nm波长滤 器检测对数红色荧光， 收集数据待分析。 0017 最后， 本发明将三种细胞以1105个/ml密度接种于六孔板， 加2mlDMEM培养基培 养； 将清洁的载玻片浸入熔融的1高熔点琼脂糖中并立即擦拭来制备彗星电泳预涂片。 第 二天给予三种细胞8Gy的60Co射线照射， 分。
15、别在0h、 4h及8h用胰酶进行消化， 1000rpm离心 5min； 用PBS液洗一遍， 弃上液； 用无Ca2+、 Mg2+的PBS将单细胞悬浮液的浓度调节至2104个 细胞/ml， 然后将0.4ml的溶液浸入1.2ml的0.65低熔点琼脂糖中， 40水浴。 将1.2ml细胞 悬浮液混合并快速移液到预涂片的表面上并铺均匀； 晾干后将玻片轻轻浸于新鲜配置并预 冷的细胞裂解液中， 4避光裂解1小时。 从裂解液中取出玻片， 用电泳液淋洗5秒后移入水 平电泳槽， 倒满电泳液。 25V电泳30分钟。 电泳后取出玻片， 用双蒸水轻轻清洗。 用PI(10 g/ ml)染色20分钟， 然后用双蒸水轻轻冲洗。。
16、 最后， 通过荧光显微镜(Olympus BX60)在10x目标 说 明 书 2/5 页 4 CN 108464987 A 4 下观察所有凝胶。 使用CASP 1.2.3b2(CASPlab， Wroclaw， Poland进行分析。 0018 因此， 本发明要求保护抑制AKAP12基因在制备肿瘤放疗增敏药物中的应用。 通过 抑制AKAP12基因， 可以提高放射治疗的敏感性， 从而提高放射治疗疗效。 0019 本发明的第二方面， 提供一种重组载体在制备肿瘤放疗增敏药物中的应用， 所述 的重组载体中包含上述的靶向AKAP12基因的siRNA。 0020 本发明的第三方面， 提供一种肿瘤放疗增敏剂。
17、， 所述的肿瘤放疗增敏剂中包含上 述的靶向AKAP12基因的siRNA。 0021 本发明与现有技术相比具有下列优点： 0022 本发明提供了AKAP12基因和抑制或下调AKAP12基因表达的试剂的新应用， 能够有 效提高肺癌的放射敏感性。 附图说明 0023 图1为实施例1中转染AKAP12siRNA、 NC序列的A549细胞和正常A549细胞AKAP12蛋 白的表达情况； 0024 图2为实施例2中正常A549细胞和转染AKAP12siRNA及NC序列的A549细胞照后生长 和增殖的改变； 0025 图3为实施例3中正常A549细胞和转染AKAP12siRNA及NC序列的A549细胞照后的。
18、凋 亡变化； 0026 图4为实施例4中正常A549细胞和转染AKAP12siRNA及NC序列的A549细胞照后细胞 周期变化。 0027 图5为实施例5中正常A549细胞和转染AKAP12siRNA及NC序列的A549细胞照后DNA 损伤变化。 具体实施方式 0028 下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。 0029 材料： 细胞株和细胞培养： 将人肺泡II型上皮癌细胞系A549(美国细胞收藏中心) 在含有10胎牛血清的DMEM培养基于37、 5CO2培养箱中培养。 药物与主要试剂： 药DMEM 培养基、 胎牛血清、 胰酶购自Gibco公司； Annexin V-FITC及PI。
19、购自Invitrogen公司。 结晶 紫、 标准蛋白质分子量、 SDS-PAGE上样缓冲液、 RIPA蛋白裂解液、 TE电泳缓冲液、 10转膜 液、 30Acry-Bis、 Tris-HCl、 过硫酸铵(AP)、 SDS、 四甲基乙二胺(TEMED)、 碘化丙啶(PI)购 自江苏碧云天生物技术研究所； 二甲基亚砜(DMSO)、 琼脂糖和Tween-20来自上海高科技生 物工程有限公司； 抗AKAP12、 GAPDH抗体购自CST。 0030 实施例1： 0031 (1)细胞培养： 将A549细胞培养于含10胎牛血清的DMEM培养基中； 将其细胞置于 37、 5CO2培养箱中培养， 每2-3天传。
20、代一次， 取对数生长期细胞用于实验。 0032 (2)细胞转染： 转染前一天， 将细胞用胰酶消化、 计数， 以合适的密度接种6孔板， 置 于CO2培养箱中培养过夜， 使转染当日细胞融合度为7090。 铺板和转染期间避免使用 抗生素。 0033 转染溶液配制： 按照质粒： Lipofectamine3000用量比为1 g/孔： 1.5 l/孔。 500ng/ 说 明 书 3/5 页 5 CN 108464987 A 5 孔DNA及5 l/孔P3000加入250 l Opti-MEM培养基混匀， 室温静置5min， 备用； 3.75 l/孔 Lipofectamine3000加入250 l/孔Op。
21、ti-MEM培养基混匀， 室温静置5min， 备用； 将稀释的DNA 同稀释的脂质体试剂混合， 在室温保温20min后， 加入待转染的A549细胞中， 5CO2， 37培 养。 24后， 弃去含转染试剂的培养液， 加入新鲜的完全培养基， 继续培养后， 72小时内完成瞬 时转染。 0034 (3)转染72小时后提取蛋白 ， 进行Western blot电泳。 结果如图1所示， AKAP12siRNA转染入A549细胞后成功抑制了AKAP12蛋白的表达。 0035 实施例2： 0036 (1)细胞培养及细胞转染同实施例1； 0037 (2)细胞克隆形成方法： 取对数生长期A549细胞及转染AKAP。
22、12siRNA、 NC序列72h的 A549细胞， 并按不同照射剂量要求接种不同数量的细胞到六孔板中(0,2,4,8Gy剂量接种细 胞数量分别为200,400,800和1600个)。 三组细胞同时接受不同剂量(0-8Gy)的-射线照 射， 照后继续直至培养皿中出现明显肉眼可见的细胞克隆时终止培养。 弃培养基， PBS洗两 次， 并采用无水甲醇固定30分钟， Gimsa染液染色30分钟， 流水冲洗后晾干后进行计数， 计算 出细胞存活率。 所得结果如图2所示， 随着照射剂量的增加， 转染AKAP12siRNA的A549细胞的 细胞死亡率明显高于正常A549及转染NC序列的A549组。 0038 实。
23、施例3： 0039 (1)细胞培养及细胞转染同实施例1； 0040 (2)流式细胞仪检测细胞凋亡法： 取对数生长期A549细胞和转染AKAP12siRNA72h 及NC序列的A549细胞(1105/mL)接种至六孔板中， 给予三组细胞8Gy的60Co射线照射， 然 后继续培养24h后， 使用不含EDTA的胰酶消化细胞， 1500转离心5分钟后PBS洗三遍， 采用 Annexin V-FITC及PI双染后通过流式细胞仪检测细胞凋亡。 所得结果如图3所示， 转染 AKAP12siRNA的A549细胞的凋亡率照后明显高于正常A549细胞组及转染NC序列的A549组。 0041 实施例4： 0042 。
24、(1)细胞培养及细胞转染同实施例1； 0043 (2)流式细胞仪检测细胞周期： 取对数生长期A549细胞和转染AKAP12siRNA及NC序 列72h的A549细胞(1105/mL)接种至六孔板中， 第二天给予三组细胞8Gy的60Co射线照 射， 分别在0h、 8h、 12h及24h用胰酶进行消化， 1000rpm离心5min； 用PBS液洗一遍， 弃上液； 用 0.3ml PBS溶液重新悬浮细胞， 然后缓慢加入4预冷的无水酒精0.7ml， -20冰箱过夜； 检 测前进行PI单染： 1000rpm离心5min， 去上液； 加PBS清洗一遍， 加100 l 5mg/ml RNA酶溶液， 37保温。
25、30min， 然后冰浴终止酶作用； 加PI染液(100 g/ml)避光染色30min； 应用FCM测细 胞周期： 用EPICSXL流式细胞仪(美国贝克曼库尔特公司)进行细胞周期分析， 氩离子激发PI 荧光， 激发光波长为488nm， 用620nm波长滤器检测对数红色荧光， 收集数据待分析。 0044 所得结果如图4所示， 三种细胞G0/G1期细胞比例总的趋势是随照后时间的增加， 细胞比例呈下降趋势， 12小时达到最低， 24小时有所回复。 其中， 敲低AKAP12组的细胞比例 下降明显高于对照组与转染NC序列组(p0.05)， 而对照组与转染NC序列组无明显差异(p 0.05)； 三种细胞G2。
26、/M期细胞比例总的趋势是随照后时间的增加， 细胞比例呈上升趋势， 12小时达到最高， 24小时有所回复。 其中， 敲低AKAP12组的细胞比例上升明显高于对照组与 转染NC序列组(p0.05)， 而对照组与转染NC序列组无明显差异(p0.05)。 这些结果说明， 说 明 书 4/5 页 6 CN 108464987 A 6 抑制AKAP12基因在照射后促进A549细胞发生了更明显的G2期细胞阻滞。 0045 实施例5： 0046 (1)细胞培养及细胞转染同实施例1； 0047 (2)彗星电泳检测DNA损伤变化： 将三种细胞以1105个/ml密度接种于六孔板， 加 2mlDMEM培养基培养； 将。
27、清洁的载玻片浸入熔融的1高熔点琼脂糖中并立即擦拭来制备彗 星电泳预涂片。 第二天给予三种细胞8Gy的60Co射线照射， 分别在0h、 4h及8h用胰酶进行消 化， 1000rpm离心5min； 用PBS液洗一遍， 弃上液； 用无Ca2+、 Mg2+的PBS将单细胞悬浮液的浓度 调节至2104个细胞/ml， 然后将0.4ml的溶液浸入1.2ml的0.65低熔点琼脂糖中， 40水 浴。 将1.2ml细胞悬浮液混合并快速移液到预涂片的表面上并铺均匀； 晾干后将玻片轻轻浸 于新鲜配置并预冷的细胞裂解液中， 4避光裂解1小时。 从裂解液中取出玻片， 用电泳液淋 洗5秒后移入水平电泳槽， 倒满电泳液。 2。
28、5V电泳30分钟。 电泳后取出玻片， 用双蒸水轻轻清 洗。 用PI(10 g/ml)染色20分钟， 然后用双蒸水轻轻冲洗。 最后， 通过荧光显微镜(Olympus BX60)在10x目标下观察所有凝胶。 使用CASP 1.2.3b2(CASPlab， Wroclaw， Poland进行分析。 0048 所得结果如图5所示， 照后三种细胞的尾矩及尾相均有增加， 但是敲低AKAP12组与 转染NC组及对照组有明显差异。 说明敲低AKAP12促进了照射对A549细胞的DNA损伤。 0049 其中， 照射条件： 辐射中心(第二军医大学海军医学院， 中国上海)的60Co射线照 射。 以8Gy的射线照射剂。
29、量率1Gy/min处理细胞。 0050统计学处理： 上述实施例的所有实验均重复3次以上， 结果采用表示。 采用 SAS统计软件对相关数据进行t检验， 以P0.05为有显著性差异。 0051 以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明， 但本发明创造并不限于所述 实施例， 熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的 变型或替换， 这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。 说 明 书 5/5 页 7 CN 108464987 A 7 序列表 中国人民解放军第二军医大学 抑制或下调AKAP12基因表达的试剂在制备肿瘤放疗增敏药物中的应用 / 2 SIP。
30、OSequenceListing 1.0 1 19 RNA 人工序列(Artificial) 1 agacggaugu aguguugaa 19 2 19 RNA 人工序列(Artificial) 2 uucaacacua cauccgucu 19 序 列 表 1/1 页 8 CN 108464987 A 8 图1 图2 说 明 书 附 图 1/4 页 9 CN 108464987 A 9 图3 说 明 书 附 图 2/4 页 10 CN 108464987 A 10 图4 说 明 书 附 图 3/4 页 11 CN 108464987 A 11 图5 说 明 书 附 图 4/4 页 12 CN 108464987 A 12 。