带正电荷具有肝靶向作用的三氧化二砷制剂的制备方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201610046284.7 (22)申请日 2016.01.25 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 105640922 A (43)申请公布日 2016.06.08 (73)专利权人 扬州大学 地址 225009 江苏省扬州市大学南路88号 (72)发明人 宋晓丽 王娟 闫彩凤 朱爱萍 郭荣 (74)专利代理机构 扬州市锦江专利事务所 32106 代理人 江平 (51)Int.Cl. A61K 9/52(2006.01) A61K 33/36(2006.01) A。

2、61K 47/10(2006.01) A61K 47/34(2017.01) A61K 47/36(2006.01) A61P 35/02(2006.01) C08B 37/08(2006.01) 审查员 王斯慧 (54)发明名称 带正电荷具有肝靶向作用的三氧化二砷制 剂的制备方法 (57)摘要 带正电荷具有肝靶向作用的新型三氧化二 砷制剂的制备方法， 属于生物医药技术领域， 本 发明以As2O3的氢氧化钠溶液为内水相， 以乳酸- 羟基乙酸的氯仿溶液为油相， 先以油相包封内水 相， 形成W/O初乳。 再以含聚乙二醇/乳糖酸-壳聚 糖的乳化剂水溶液为外水相。 采用可生物降解、 生物相容性良好的乳。

3、酸-羟基乙酸共聚物作为包 封材料， 采用双乳化-溶剂挥发法制得As2O3- PLGA/PLC NPs， 纳米粒尺寸均一， 分散性好， 包封 率、 载药量高， 在体外可稳定释放， 在体内体外都 表现出良好的抗肿瘤性能， 体现了一定的肝靶向 功能， 使As2O3能够直接靶向肝癌肿瘤部位并在 肿瘤部位实现药物的可控释放， 提高治疗效果。 权利要求书1页 说明书5页 附图12页 CN 105640922 B 2018.08.17 CN 105640922 B 1.带正电荷具有肝靶向作用的三氧化二砷制剂的制备方法， 其特征在于包括以下步 骤： 1） 将As2O3溶于氢氧化钠水溶液中， 制成As2O3的氢。

4、氧化钠溶液； 所述As2O3的氢氧化钠溶 液中As2O3含量为60 mg/mL； 2） 将乳酸-羟基乙酸共聚物溶于三氯甲烷中， 制成乳酸-羟基乙酸的氯仿溶液； 所述乳 酸-羟基乙酸共聚物含量为30 mg/mL； 3） 在磁力搅拌下， 将As2O3的氢氧化钠溶液加入到乳酸-羟基乙酸的氯仿溶液中， 然后冰 浴超声乳化， 形成W/O初乳； 所述As2O3的氢氧化钠溶液和乳酸-羟基乙酸的氯仿溶液的混合 体积比为1 20； 所述超声乳化时， 超声功率为300 W， 超声时间为90 s； 4） 将聚乙二醇/乳糖酸-壳聚糖溶解于乳化剂水溶液中， 制成含聚乙二醇/乳糖酸-壳聚 糖的乳化剂水溶液； 所用乳化剂为。

5、泊洛沙姆； 所述乳化剂水溶液中聚乙二醇/乳糖酸-壳聚 糖的浓度为1 mg/mL； 5） 将W/O初乳与含聚乙二醇/乳糖酸-壳聚糖的乳化剂水溶液混合， 冰浴超声乳化形成 W/O/W复乳； 超声乳化时， 超声功率为500W， 超声时间为180 s； 6） 将W/O/W复乳与低浓度的乳化剂水溶液均匀混合后， 蒸发除去有机溶剂， 离心收集沉 淀、 去离子水洗涤， 冷冻干燥得As2O3-PLGA/PLC NPs。 2.根据权利要求1所述制备方法， 其特征在于步骤 6） 中， 所述低浓度的乳化剂水溶液 为浓度为0.9% (w/v)的泊洛沙姆水溶液。 3.根据权利要求1所述制备方法， 其特征在于步骤4） 中。

6、， 所述聚乙二醇/乳糖酸-壳聚糖 是按以下方法合成的： 将1g 壳聚糖溶解于质量百分数为2%的6 mL醋酸中， 再加入pH为4.7 的20 mL TEMEDHCL缓冲溶液， 然后分别加入3.83mgEDC和2.30mg NHS， 30min后加入 0.16mg 聚乙二醇和1.43mg 乳糖酸， 在反应体系的pH值为4-6的条件下， 于35条件下搅拌 反应， 取得粗产物， 将粗产物置于透析袋中透析后， 经冷冻干燥， 得聚乙二醇/乳糖酸-壳聚 糖。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 105640922 B 2 带正电荷具有肝靶向作用的三氧化二砷制剂的制备方法 技术领域 0001 本发明属于。

7、生物医药技术领域， 尤其涉及一种带正电荷具有肝靶向作用的三氧化 二砷制剂的制备技术。 0002 背景技术： 0003 三氧化二砷 (As2O3) 是中药砒霜的主要有效成分， 其注射液最早用于治疗急性早 幼粒细胞白血病。 研究发现， 三氧化二砷不仅对急性早幼粒白血病疗效显著， 对实体瘤也有 着较好的抑制作用。 然而As2O3在体内半衰期较短， 给药后会被快速清除； 此外高剂量的 As2O3会带来神经麻痹、 肝功能衰竭等毒副作用， 限制了其在临床上的应用。 发明内容 0004 本发明的目的在于克服抗癌药物As2O3在使用过程中无靶向功能， 而且体内半衰期 较短的缺陷， 从而制备出一种带正电荷具有肝。

8、靶向功能的三氧化二砷制剂。 0005 本发明的步骤如下： 0006 1） 将As2O3溶于氢氧化钠水溶液中， 制成As2O3的氢氧化钠溶液； 0007 2） 将乳酸-羟基乙酸共聚物 (PLGA) 溶于三氯甲烷中， 制成乳酸-羟基乙酸的氯仿 溶液； 0008 3） 在磁力搅拌下， 将As2O3的氢氧化钠溶液加入到乳酸-羟基乙酸的氯仿溶液中， 然 后冰浴超声乳化， 形成W/O初乳； 0009 4） 将聚乙二醇/乳糖酸-壳聚糖 (PLC)溶解于乳化剂水溶液中， 制成含聚乙二醇/ 乳糖酸-壳聚糖的乳化剂水溶液； 0010 5） 将W/O初乳与含聚乙二醇/乳糖酸-壳聚糖的乳化剂水溶液混合， 冰浴超声乳化。

9、 形成W/O/W复乳； 0011 6） 将W/O/W复乳与低浓度的乳化剂水溶液均匀混合后， 蒸发除去有机溶剂， 离心收 集沉淀、 去离子水洗涤， 冷冻干燥得载As2O3纳米粒(As2O3-PLGA/PLC NPs)。 0012 本发明以As2O3的氢氧化钠溶液为内水相， 以乳酸-羟基乙酸的氯仿溶液为油相， 先 以油相包封内水相， 形成W/O初乳。 再以含聚乙二醇/乳糖酸-壳聚糖的乳化剂水溶液为外水 相。 采用可生物降解、 生物相容性良好的乳酸-羟基乙酸共聚物 （PLGA） 作为包封材料， 采用 双乳化-溶剂挥发法制得As2O3-PLGA/PLC NPs。 0013 本发明方法制备方法简单， 制。

10、备得到的纳米粒尺寸均一， 形貌可控， 分散性好， 包 封率、 载药量高， 在体外可稳定释放， 在体内体外都表现出良好的抗肿瘤性能， 体现了一定 的肝靶向功能， 使As2O3能够直接靶向肝癌肿瘤部位并在肿瘤部位实现药物的可控释放， 提 高治疗效果。 0014 进一步地， 本发明步骤1） 中， 所述As2O3的氢氧化钠溶液中As2O3含量为60 mg/mL。 0015 为了提高载药纳米粒的包封率及载药量， 步骤2） 中， 所述乳酸-羟基乙酸共聚物 (PLGA) 含量为30 mg/mL。 0016 为了提高载药纳米粒的包封率及载药量， 步骤3） 中， 所述As2O3的氢氧化钠溶液和 说 明 书 1/。

11、5 页 3 CN 105640922 B 3 乳酸-羟基乙酸的氯仿溶液的混合体积比为1 20。 0017 步骤3） 中， 所述超声乳化时， 超声功率为300 W， 超声时间为90 s， 以促进形成均匀 的W/O初乳液。 0018 为了使聚乙二醇/乳糖酸-壳聚糖成功包覆在纳米粒的表面， 制备带有正电荷的载 药纳米粒， 步骤4） 中， 所用乳化剂为泊洛沙姆； 所述乳化剂水溶液中聚乙二醇/乳糖酸-壳聚 糖的浓度为1 mg/mL。 0019 步骤 5） 中， 超声乳化时， 超声功率为500W， 超声时间为180 s， 以形成分散均匀的 W/O/W复乳液。 0020 为了进一步分散稳定W/O/W复乳， 。

12、步骤 6） 中， 所述低浓度的乳化剂水溶液为浓度 为0.9% (w/v)的泊洛沙姆水溶液。 0021 另外， 步骤4） 中， 所述聚乙二醇/乳糖酸-壳聚糖是按以下方法合成的： 将1g 壳聚 糖溶解于质量分数为2% 的6 mL醋酸中， 再加入pH为4.7的20 mL TEMEDHCL缓冲溶液， 然 后分别加入3.83mg EDC和2.30mg NHS， 30min后加入0.16mg 聚乙二醇和1.43mg 乳糖酸， 在 反应体系的pH值为4-6的条件下， 于35条件下搅拌反应， 取得粗产物， 将粗产物置于透析 袋中透析后， 经冷冻干燥， 得聚乙二醇/乳糖酸-壳聚糖。 该合成方法可一步法将聚乙二醇。

13、和 乳糖酸修饰到壳聚糖上， 获得双功能壳聚糖衍生物。 附图说明 0022 图1为PLC的合成示意图。 0023 图2为双乳化-溶剂挥发法合成As2O3-PLGA/PLC NPs的示意图。 0024 图3为PLGA、 PLC、 As2O3-PLGA/PLC NPs的红外光谱图。 0025 图4为As2O3-PLGA/PLC NPs的TEM图。 0026 图5为图4的放大图。 0027 图6为AFS测得的As2O3的标准曲线。 0028 图7为药物As2O3从As2O3-PLGA/PLC NPs中的体外缓释曲线。 0029 图8为As2O3对SMMC-7721肝癌细胞的抑制作用效果图。 0030 。

14、图9为As2O3-PLGA/PLC NPs对SMMC-7721肝癌细胞的抑制作用效果图。 0031 图10为As2O3-PLGA/PLC NPs 空球对SMMC-7721肝癌细胞的抑制作用效果图。 0032 图11为接受不同药物治疗后小鼠肿瘤体积变化曲线(XSD， n=5)图。 0033 图12为静脉注射生理盐水后肿瘤病理学检测 (HE 染色)照片。 0034 图13为静脉注射As2O3后肿瘤病理学检测 (HE 染色)照片。 0035 图14为静脉注射As2O3-PLGA/PLC NPs后肿瘤病理学检测 (HE 染色)照片。 0036 图15为静脉注射生理盐水后肾脏器官病理学检测 (HE 染色。

15、)照片。 0037 图16为静脉注射As2O3后肾脏器官病理学检测 (HE 染色)照片。 0038 图17为静脉注射As2O3-PLGA/PLC NPs后肾脏器官病理学检测 (HE 染色)照片。 具体实施方式 0039 一、 制备As2O3-PLGA/PLCNPs： 0040 1、 合成聚乙二醇/乳糖酸-壳聚糖PEG/LA-CS (简称： PLC)： 说 明 书 2/5 页 4 CN 105640922 B 4 0041 称取1g 壳聚糖 (CS) 溶解于6 mL 醋酸 (2%) 中， 加入20 mL TEMEDHCL缓冲溶 液 (pH=4.7) 稀释， 搅拌20min， 然后分别加入3.83。

16、mgEDC和2.30mg NHS， 30min后加入 0.16mg 聚乙二醇 (mPEG) 和1.43mg 乳糖酸 (LA)， 35下搅拌反应36h， 反应过程中严格 控制pH 4-6， 反应过程如图1所示。 粗产物置于透析袋中透析4天， 冷冻干燥即可得到聚乙二 醇/乳糖酸-壳聚糖(PLC)。 0042 2、 制备As2O3-PLGA/PLC NPs： 0043 如图2所示： 0044 (1) 将As2O3溶于氢氧化钠质量百分数为4% 的氢氧化钠水溶液中， 配成As2O3含量 为60 mg/mL 的As2O3的氢氧化钠溶液， 作为内水相。 0045 (2) 将乳酸-羟基乙酸共聚物 (PLGA)。

17、 溶于三氯甲烷中， 制成PLGA浓度为30mg/mL 的PLGA氯仿溶液， 作为油相。 0046 (3) 在磁力搅拌下， 将内水相加入到PLGA氯仿溶液中， 然后冰浴超声乳化(超声条 件： 300 W， 90 s)， 形成W/O初乳。 0047 (4) 将聚乙二醇/乳糖酸-壳聚糖 (PLC)溶解于9%的泊洛沙姆水溶液中 (外水 相)， 制得溶液中PLC浓度为1 mg/mL的PLC乳化剂水溶液。 0048 (5) 将W/O初乳与PLC乳化剂水溶液混合， 冰浴超声乳化(超声条件： 500 W， 180 s)， 形成W/O/W复乳。 0049 (6) 将W/O/W复乳与0.9% (w/v)泊洛沙姆水。

18、溶液均匀混合后， 蒸发除去有机溶剂， 离心收集沉淀、 去离子水洗涤， 冷冻干燥得As2O3-PLGA/PLC NPs。 0050 二、 As2O3-PLGA/PLCNPs的表征及性质： 0051 1、 红外表征 0052 图3为PLGA、 PLC、 As2O3-PLGA/PLC NPs的红外光谱图， 在As2O3-PLGA/PLC NPs谱图 中， 1760cm-1处出现了PLGA中C=O(羧基)的特征吸收峰， 2997 cm-1处为甲基中C-H 的伸缩 振动峰， 2947 cm-1处为亚甲基中C-H 的伸缩振动峰， 且1180 cm-1 处出现C-O 的伸缩振动， 表明了纳米粒中-COO-的。

19、存在； 此外， 3544cm- 1处出现的宽峰为PLC中O-H的伸缩振动与N-H 伸缩振动吸收峰的重叠峰， 由此可以说明As2O3-PLGA/PLC NPs成功制备。 0053 2、 纳米粒形貌及电位 0054 图4为As2O3-PLGA/PLC NPs的TEM， 可以看出制备出的纳米粒呈规整球形， 尺寸均 一， 表面光滑无孔。 通过动态光散射(DLS) 对纳米粒粒径大小以及分散性进行测量。 制备的 As2O3-PLGA/PLC NPs粒径较小， 在200 nm， 分布均匀， 分散系数 (PDI) 为0.197 0.008。 0055 将图4放大后， 从图5可以明显看出， 纳米粒表面被一层PL。

20、C薄膜包裹， 结果与红外 谱图相一致。 经检测As2O3-PLGA/PLC NPs表面带正电荷(+28.9 0.3) mV， 进一步印证了 PLC表面包裹。 0056 3、 包封率和载药量 0057 As2O3的标准曲线使用原子荧光光谱仪 (AFS) 进行测定， 绘制As2O3的标准曲线， 如图6所示。 所得标准曲线的线性方程为： Y=8.87821X+35.3255， R2=0.997461。 其中Y表示荧 光强度， X表示As2O3的质量浓度 (ng/mL)。 经计算， As2O3-PLGA/PLC NPs包封率为91.68% 1.42%， 载药量为72.0 1.24%。 0058 (1)。

21、As2O3-PLGA/PLC NPs体外控制释放 说 明 书 3/5 页 5 CN 105640922 B 5 0059 图7为As2O3在As2O3-PLGA/PLC NPs中的体外缓释曲线， 可以看出， As2O3-PLGA/PLC NPs可在体外持续释放药物15天， 药物累计释放率达72.83%， 可实现药物的控制释放。 0060 三、 As2O3-PLGA/PLC NPs的抗肝肿瘤性能： 0061 为了评估As2O3-PLGA/PLC NPs的抗肝肿瘤性能， 分别考察了纳米粒体内、 体外抗肿 瘤作用。 0062 1、 体外抗肿瘤性能 0063 采用As2O3、 As2O3-PLGA/P。

22、LC NPs和As2O3-PLGA/PLC NPs 空球分别对SMMC-7721肝 癌细胞的抑制作用， 结果如图8、 9、 10所示。 0064 从图8可见： As2O3可以抑制SMMC-7721细胞的生长， 随时间的延长及药物浓度的增 大， 抑制效果增强， 作用72h后药物的半抑制浓度(IC50)为0.96 0.033g As2O3/ml。 0065 从图9中可以看出， As2O3-PLGA/PLCNPs对SMMC-7721细胞具有明显的抑制作用， 随 时间的延长及药物浓度的增大， 抑制效果增强， 作用72h后药物的半抑制浓度(IC50)为0.47 0.017g As2O3/mL， 低于As。

23、2O3溶液的IC50， 说明纳米粒对肝癌细胞的生长有着更强的抑 制作用。 0066 从图10可见： 当PLGA/PLC NPs空球与细胞共同培养72 h后， 细胞存活率高于85%， 说明载体本身无细胞毒性作用。 0067 2、 体内抗肿瘤性能 0068 以HEPG-2细胞注射雄性Bale/c裸鼠腋区皮下建立动物肿瘤模型， 考察As2O3-PLGA/ PLC NPs体内抗肿瘤性能。 图11为接受不同药物治疗后小鼠肿瘤体积变化曲线， 在一个试验 周期结束后， As2O3-PLGA/PLC NPs组小鼠肿瘤体积为1.6020.524 mm3， 远低于生理盐水 (NS)模型组(2.2620.546 m。

24、m3)， 对肿瘤抑制率达34.19%。 0069 除此之外， 我们在整个治疗周期结束后通过组织病理学对处死后获得的瘤组织进 行检测进一步评价药物传输系统对肿瘤抑制作用的影响。 0070 图12、 13、 14分别为接受不同药物治疗后(A:NS; B:As2O3; C: As2O3-PLGA/PLC NPs)肿瘤病理学检测 (HE 染色)照片。 0071 空白对照组肿瘤细胞异型性明显， 表现为细胞大， 胞浆较丰富， 多边形， 细胞核大、 深染、 核分裂像易见。 肿瘤细胞弥散分布， 肿瘤细胞坏死略占肿瘤组织2/4左右， 多数坏死为 凝固性坏死， 即肿瘤细胞坏死， 细胞核消失， 但细胞轮廓存留， 间。

25、质有少量血管， 无明显出 血。 肿瘤组织与坏死部分交界处可见少量炎细胞浸润。 As2O3及As2O3-PLGA/PLC NPs治疗组 肿瘤细胞形态结构基本同空白对照组， 但边缘部肿瘤细胞排列呈条索状， 但是As2O3-PLGA/ PLC NPs治疗组肿瘤坏死程度轻于空白对照组及As2O3对照组， 说明经As2O3-PLGA/PLC NPs 治疗后肿瘤增长速度变慢， 恶性程度降低。 这些表现表明治疗组对肿瘤细胞起到了较好的 抑制作用。 0072 为了进一步验证As2O3-PLGA/PLC NPs的肝肿瘤靶向性能， 对实验小鼠处死后肾脏 器官的病理组织进行分析， 实验结果如图15、 16、 17所。

26、示。 空白对照组中： 肾脏由皮质， 髓质 和肾乳头组成， 各部位结构清晰， 肾小球无萎缩或增大， 球囊腔清晰， 肾小管上皮细胞中度 水肿变性， 主要表现为细胞增大、 胞浆疏松淡染， 细胞轮廓欠清， 腔缘不整齐。 管腔内未见管 型， 有脱离的颗粒样物。 对于As2O3和As2O3-PLGA/PLC NPs治疗组， 肾组织结构及变性细胞的 形态学改变如空白对照组， 但是As2O3组中肾小管上皮细胞重度水肿变性， 而As2O3-PLGA/ 说 明 书 4/5 页 6 CN 105640922 B 6 PLC NPs组中肾小管上皮细胞轻度水肿变性。 由此可说明， As2O3-PLGA/PLC NPs对。

27、肝肿瘤细 胞有一定的靶向性， 减少在肾脏组织的积累， 降低药物对肾脏的毒副作用。 0073 综上所述， As2O3-PLGA/PLC NPs对肝肿瘤部位具有一定的靶向作用， 可有效提高治 疗效果， 并降低对其它组织的毒副作用。 说 明 书 5/5 页 7 CN 105640922 B 7 图1 图2 说 明 书 附 图 1/12 页 8 CN 105640922 B 8 图3 图4 说 明 书 附 图 2/12 页 9 CN 105640922 B 9 图5 图6 说 明 书 附 图 3/12 页 10 CN 105640922 B 10 图7 图8 说 明 书 附 图 4/12 页 11 C。

28、N 105640922 B 11 图9 图10 说 明 书 附 图 5/12 页 12 CN 105640922 B 12 图11 说 明 书 附 图 6/12 页 13 CN 105640922 B 13 图12 说 明 书 附 图 7/12 页 14 CN 105640922 B 14 图13 说 明 书 附 图 8/12 页 15 CN 105640922 B 15 图14 说 明 书 附 图 9/12 页 16 CN 105640922 B 16 图15 说 明 书 附 图 10/12 页 17 CN 105640922 B 17 图16 说 明 书 附 图 11/12 页 18 CN 105640922 B 18 图17 说 明 书 附 图 12/12 页 19 CN 105640922 B 19 。