一种具有良好物理及抑菌性能的茶多酚根管封闭剂.pdf

本发明公开了茶多酚根管封闭剂，属于口腔材料技术领域。本发明的茶多酚根管封闭剂是在氧化锌丁香油封闭剂中加入茶多酚，使茶多酚、氧化锌及丁香油的功效产生协同，明显增强了其抑菌性能，同时有效减弱了氧化锌丁香油的毒性，是一种具有良好物理及抑菌性能茶多酚根管封闭剂。抑菌实验显示，本发明制备的茶多酚根管封闭剂对指示菌具有良好的抑制作用；物理实验显示，茶多酚根管封闭剂的物理性能符合封闭剂的性能标准；临床试验显示，茶多酚根管封闭剂在根管治疗后，能有效的减少疼痛等急症的发生率，同时能提高根管治疗长期的成功率。因此，有望成为一种新型的根管封闭材料运用于临床。

1.一种具有良好物理及抑菌性能的茶多酚根管封闭剂，是在氧化锌丁香油封闭剂中加入茶多酚混合均匀而得；所述茶多酚与氧化锌的质量百分比为0.5-1%、99.5-99%。 2.如权利要求1所述具有良好物理及抑菌性能的茶多酚根管封闭剂，其特征在于：茶多酚封闭剂中茶多酚的浓度为2.5-10g/L。

技术领域

本发明属于口腔材料技术领域，涉及一种根管封闭剂，尤其涉及一种具有良好物理及抑菌性能茶多酚根管封闭剂。

背景技术

根管治疗是牙髓及根尖周疾病最有效的治疗方法，目前根管治疗的成功率为53%-95%，如何继续提高根管治疗的成功率仍是国内外学者的研究热点。根管治疗失败的原因是多方面的，例如根管系统的复杂、治疗过程中操作不当等，研究表明最主要原因是微生物因素，顽固不易清除的细菌导致了根管治疗的失败。根管治疗失败的主要原因是微生物因素，抑制白色念珠菌和粪肠球菌的生长对于降低根管治疗的失败率有重要意义。尽管根管封闭剂中加抗生素有较好的抑菌效果，但近年来抗生素的滥用引起了细菌耐药等许多生物安全问题，所以寻找一种抑菌性能良好的天然药物作为根管封闭剂的添加物是很重要的。

氧化锌丁香油根管封闭剂是一种具有抑菌性能的根管封闭剂，但是其在临床以及体外研究中表现出了一定的细胞毒性（其毒性主要来源于其固化后所释放出来的丁香油酚），因此给其临床应用带来限制。

茶多酚(Tea Polyphenols, TP)是茶叶中多酚类化学物质的总称，是茶叶中有保健功能的主要成份之一，具有去除口臭、促进口腔溃疡愈合、抗口腔辐射伤害等作用，同时茶多酚能够抑制口腔多种致病菌的生长。有研究表明茶多酚对于根管内的白色念珠菌、粪肠球菌等生物膜的形成有抑制作用。但是将茶多酚加入根管封闭剂中，研制出一种新型的茶多酚根管封闭剂尚未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有良好物理及抑菌性能茶多酚根管封闭剂的制备方法。

一、茶多酚根管封闭剂的制备

本发明的茶多酚根管封闭剂，是在氧化锌丁香油封闭剂中加入茶多酚混合均匀而得。其中茶多酚与氧化锌的质量百分比为0.25-1%、99.75-99%；茶多酚封闭剂中茶多酚的浓度为2.5-10g/L。

二、茶多酚根管封闭剂的性能测试

1.抑菌性能的测定

采用琼脂扩散法，指示菌为白色念珠菌( Canidia albicans, C.albicans)ATCC 10231、粪肠球菌(Enterococcus faecalis, E.faecalis)ATCC 29212、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus, S.aureus)ATCC 25923、大肠杆菌(Escherichia coli, E.coli)ATCC 25922标准菌株(西北民族大学国家民委口腔微生物重点实验室提供)。在100mLBHI培养基灭菌后冷却至45℃时混入菌液10μL（CFU 1x106/ml），倒入培养皿中待凝固后用打孔器均匀打孔。按照顺时针方向依次在打下的孔中加入不同质量分数的茶多酚根管封闭剂，直至与培养基表面平齐，以氧化锌根管封闭剂做阴性对照；平板置于37 ℃孵箱培养24h。按照十字交叉法用电子尺测量抑菌圈直径。

不同质量分数根管封闭剂的抑菌作用如图1所示，其中Blank为阴性对照组（氧化锌丁香油根管封闭剂）；A、B、C、D分别代表茶多酚的质量分数为0.25%、0.5%、1%和2%。统计分析后各组封闭剂抑菌圈大小和组间差异如图2所示（*表示p<0.05）。抑菌圈直径：Blank<A<B<C<D；其中C.albicans和E.faecalis Blank与A以及S.aureus Blank与A，A与B组间相比无显著差异(P>0.05)，其它组间两两比较均有显著性差异(P<0.05)。

上述抑菌实验结果显示，0.25%的茶多酚封闭剂抑制白色念珠菌和粪肠球菌的能力与对照组无显著差异，当质量分数增加到0.5%（5 g/L）时才有显著性差异，表明茶多酚的抑菌能力与浓度呈正相关；1%、1.5%的茶多酚封闭剂对金黄色葡萄球菌的抑制作用非常强，与空白组、0.25%、0.5%有显著差异；此外，0.25%的封闭剂即对大肠杆菌表现出较强的抑制作用。因此，本发明制备的茶多酚根管封闭剂对指示菌具有良好的抑制作用，而且0.5%、1%和1.5%的封闭剂对指示菌的抑制作用明显优于空白组和0.25%。

2.流动性的测定

采用ISO 6878:2001的方法，输送0.05mL(±0.005mL)封闭剂置于玻璃板中心，180s(±5s)后将第二块玻璃板和100g(±2g)的重物块压在上面。10min后取下重物块并且测量所压封闭剂试片直径。每个封闭剂试片测量3次，精确到0.001mm。

各组封闭剂流动性大小和组间差异如图3所示，流动性大小：Blank>A>B>C>D；Blank与A，A与B组间相比无显著性差异(P>0.05)，其他组间两两比较均有显著性差异(P<0.05)。

临床上根管充填要求封闭剂容易进入细小不规则的侧副管，实现充分严密的充填，因此封闭剂应该具有良好的流动性。本研究结果显示，加入茶多酚后封闭剂的流动性随茶多酚质量分数的增大而减小，这可能是因为茶多酚的存在增大了材料的粘稠度，在相同的载荷下含茶多酚较少的封闭剂容易形成直径较大的平面，具有更好的流动性，可阻止微生物及代谢产物进入根管，防止细菌的再次感染导致根管治疗的失败。

3.薄膜厚度的测定

采用ISO 6878:2001的方法，测量相接触的两玻璃平板的厚度。输送0.05mL(±0.005mL)封闭剂，将其置于一片玻璃板的中心，再于中央放上第二块玻璃板。从调和开始180s(±l0s)时用加荷装置对玻璃平板顶部垂直施加150N的载荷，确保封闭剂完全充满两玻璃板之间。l0min后测量两玻璃板连同封闭剂薄膜的厚度，分别测量3次，取其平均值作为玻璃板及封闭剂薄膜的总厚度，通过计算带封闭剂和不带封闭剂的玻璃板厚度的差值，得出薄膜厚度。每个封闭剂试片测量3次，精确到lμm。

各组封闭剂薄膜厚度大小和组间差异如图4所示，薄膜厚度大小：Blank<A<B<C<D；所有组间两两比较均有显著性差异(P<0.05)。

减少根管治疗中微渗漏的发生是提高根管治疗成功率的一个重要途径，封闭剂薄膜厚度过大会使牙胶与根管壁之间的间隙增加，降低根管封闭剂的粘结性，增加微渗漏的机会。本研究结果显示，封闭剂薄膜厚度随茶多酚质量分数的增加而增厚，可能与茶多酚是一种混合物质有关，其成分大小不一，与氧化锌混合后微粒间距增加，薄膜厚度相应增大。根据ISO 6878:2001的标准，膜厚度应不大于50μm。实验结果表明，茶多酚封闭剂的薄膜厚度满足国家行业标准。

4.收缩性的测定

采用ISO 6878:2001的方法，调和2g材料稍超充于模具中，固定5min后，放入相对湿度为95%-100%，温度为37℃(±1℃)的环境中。1天后取出模具，在P600的湿砂纸上磨平试样两端。去除模具后测量其高度，精确到l0μm。后将其贮存在37℃(±1℃)的蒸馏水中30d，再次测量试样高度，精确到10μm。计算试样高度的变化与原高度的百分比，完成3次上述测量，其平均值作为材料的收缩性。

各组封闭剂收缩性大小和组间差异如图5所示，收缩性大小：Blank<A<B<C<D；Blank与A组间相比无显著性差异(P>0.05)，其他组间两两比较均有显著性差异(P<0.05)。

封闭剂的收缩性过大也会造成微渗漏，增加根管再感染的机会。本研究结果显示，封闭剂的收缩性随茶多酚的质量分数增加而增大，而且2%的茶多酚封闭剂收缩最为明显，原因在于氧化锌和茶多酚微粒之间的作用力不如氧化锌本身强，导致材料固化后在去离子水中稍有溶解，产生收缩。根据ISO 6878:2001的标准封闭剂收缩性应不大于1.0%。

5.溶解性的测定

根据M.G.Gandolfi等的方法对ISO 6876:2001的方法进行改良。将材料充填于模具中，固定后放入恒温恒湿箱中，待其完全凝固取出试样，测量其质量M1，精确到0.001g。后将试样置于去离子水中，在37℃(±1℃)的环境下，分别浸泡1天、7天和14天后取出，干燥后称重量M2，完成3次上述测量，其平均值作为最终的M1和M2。利用公式计算出封闭剂的溶解度，公式如下：溶解度=(M1-M2)/M1×100%。

各组封闭剂溶解性大小和组间差异如图6所示，溶解性大小：Blank<A<B<C<D；第一天：Blank与A、B与C、B与D、C与D组间相比无显著性差异(P>0.05)，第七天：A与B、A与C、B与C组间相比无显著性差异(P>0.05)，第十四天：A与C、B与C组间相比无显著性差异(P>0.05)，其余组间两两比较均有显著性差异(P<0.05)。

根管封闭剂的溶解会使材料的封闭性能降低，导致微渗漏的发生，同时化学物质的释放会刺激根尖周组织导致根管治疗的失败，因此封闭剂的溶解性也是影响根管治疗的一个重要因素。本研究实验结果显示，封闭剂的溶解性随茶多酚质量分数以及天数的增加而增大，均满足ISO 6876:2001的标准，保证根充材料与根管壁牙本质紧密接触无缝隙出现，从而减少微渗漏的发生，使根管封闭剂有较理想的封闭能力。

三、毒性试验

采用MTT法，在L-929细胞达到对数生长期末，细胞趋于融合时，胶原酶消化分散，配成5×104个/ml的细胞悬液，取96孔细胞培养板，每孔加入100μl细胞悬液，于含5%CO2、湿度37℃条件下培养24h待细胞贴壁，弃去孔内的原培养液，每孔分别加入100μl的DMEM培养基（阴性对照组），以及A、B、C、D四组的材料浸提液，继续培养24h和48h后取出。每孔加入5mg/ml的MTT50μl，继续培养4h后，用PBS清洗2遍，弃去孔内液体终止反应。每孔加入150μl二甲基亚砜（DMSO），在37℃下轻轻震荡10min，测其OD值，酶联仪波长为490nm。样本检测OD值取均值。利用公式计算出细胞相对增殖率（RGR），公式如下：RGR=OD实验组/OD对照组×100%。具体标准由表1所示。

各组封闭剂RGR大小所对应的细胞毒性级数如表2所示，细胞毒性大小为：Blank>A>B>C>D>Neg.。

各组封闭剂RGR大小和组间差异如图7所示，RGR大小：Blank<A<B<C<D< Neg.；24h：B与C组间相比无显著性差异(P>0.05)，48h：B与C组间相比无显著性差异(P>0.05)，其余组间两两比较均有显著性差异(P<0.05)。

氧化锌丁香油根管封闭剂在临床以及体外研究中表现出了一定的细胞毒性，其毒性主要来源于其固化后所释放出来的丁香油酚。茶多酚作为茶叶的提取物，是一种天然药物，无毒副作用，并且具有很强的抗炎解毒功效，将茶多酚加入至氧化锌丁香油封闭剂中，有效减弱了氧化锌丁香油封闭剂的毒性。

四、临床试验

选择牙髓病或根尖周病的患者206例的206颗患牙，其中男109例，女97例，年龄18~63岁，均为恒牙。纳入标准为：患者身体健康，无系统性疾病；松动度≤1°；X线片示根管通畅，无钙化；根尖发育完成，根尖稀疏区直径≤1cm。将全部患牙随机分为4组分别为A组（茶多酚质量分数为0.25%）52颗其中前牙25颗，后牙27颗、B组（茶多酚质量分数为0.5%）51颗其中前牙26颗，后牙25颗、C组（茶多酚质量分数为1%）52颗其中前牙26颗，后牙26颗、Blank组（ZOE糊剂）51颗，其中前牙25颗、后牙26颗。所有患牙经过严密根管治疗1周后复诊，根据患牙疼痛情况分为4级，分别为无反应：任何疼痛；轻度：轻微疼痛，咬合不适，可自行缓解；中度：自发性疼痛，影响咬合，口服消炎药可缓解；重度：自发性疼痛，根尖区肿胀，口服消炎药无效。其结果如表3所示。所有患者一年后再次复诊，将根管治疗疗效分为成功和失败，标准为：成功：无自觉症状，无叩痛，无窦道，X线示原根尖稀疏区消失或缩小；失败：有自觉症状，有叩痛，出现窦道或原窦道未闭合，X线示原根尖稀疏区无变化或扩大，患牙重新治疗或拔除。其结果由表4所示。

上述临床试验显示，茶多酚根管封闭剂在根管治疗后，能有效的减少疼痛等急症的发生率，同时能提高根管治疗长期的成功率。

综上所述，本发明在氧化锌丁香油封闭剂中加入茶多酚，使茶多酚、氧化锌及丁香油的功效产生协同，明显增强了其抑菌性能，同时有效减弱了氧化锌丁香油的毒性，是一种具有良好物理及抑菌性能茶多酚根管封闭剂，对于粪肠球菌和白色念珠菌具有较强的抑制作用，同时具有符合国家标准的物理性能，有望成为一种新型的根管封闭材料运用于临床。

附图说明（*表示p<0.05）

图1为不同质量分数根管封闭剂的抑菌作用；

图2为不同质量分数根管封闭剂的抑菌性比较；

图3为不同质量分数根管封闭剂的流动性比较；

图4为不同质量分数根管封闭剂的薄膜厚度比较；

图5为不同质量分数根管封闭剂的收缩性比较；

图6为不同质量分数根管封闭剂的溶解性（1d、7d、14d）比较；

图7为不同质量分数根管封闭剂细胞毒性（24h、48h）比较。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明茶多酚根管封闭剂的制备及性能作进一步说明。

实施例1、将质量分数的茶多酚1%、氧化锌99%混合制成粉剂，再与丁香油混合均匀，制成茶多酚封闭剂，其中茶多酚的浓度为10 g/L。其各项性能指标见图1-7。

实施例2、将质量分数的茶多酚0.5%、氧化锌99.5%混合制成粉剂，再与丁香油混合均匀，制成茶多酚封闭剂，其中茶多酚的浓度为5 g/L。其各项性能指标见图1-7。

实施例3、将质量分数的茶多酚0.25%、氧化锌99.75%混合制成粉剂，再与丁香油混合均匀，制成茶多酚封闭剂，其中茶多酚的浓度为2.5 g/L。其各项性能指标见图1-7。

上述实施例及实验中的茶多酚纯度98%，由上海伊卡生物有限公司提供。