一种用于肝癌早期诊断的纳米金CT造影剂及其制备方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201610345249.5 (22)申请日 2016.05.23 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 105797173 A (43)申请公布日 2016.07.27 (73)专利权人 南开大学 地址 300071 天津市南开区卫津路94号 (72)发明人 袁直 王蔚 呼振鹏 田志清 马金龙 (74)专利代理机构 天津佳盟知识产权代理有限 公司 12002 代理人 侯力 (51)Int.Cl. A61K 49/04(2006.01) (56)对比文件 CN 1028。

2、36435 A,2012.12.26, WO 2015160753 A1,2015.10.22, 赵三平等. “金纳米粒子杂化超分子水凝胶 的制备与性能” . 化学学报 .2011,第69卷(第4 期),第492496页. Zhiqian Tian等. “Shieldable Tumor Targeting Based on pH Responsive Self- Assembly/Disassembly of Gold Nanoparticles” . ACS applied materials .2014, (第6期),第1786517876页. 审查员 鲁众阳 (54)发明名称 一种用于。

3、肝癌早期诊断的纳米金CT造影剂 及其制备方法 (57)摘要 一种用于肝癌早期诊断的纳米金CT造影剂 及其制备方法。 本发明在纳米金(AuNPs)表面， 修 饰pH敏感的硫辛酸修饰的N-二异丙基乙二胺 (LA-N(iPr)2)、 硫辛酸聚乙二醇修饰的甘草次酸 (LA-PEG3.5k-GA)以及连有硫辛酸的聚乙二醇 (LA-PEG2k)， 三者物质的量比为n(LA-N(iPr)2):n (LA-PEG3.5k-GA):n(LA-PEG2k)1： 1： (3-5)。 该造 影剂具有pH敏感的配体可逆屏蔽-去屏蔽功能， 将主动靶向与被动靶向结合， 获得较主动靶向更 加优异的成像效果。 小鼠CT成像实验。

4、表明， 本造 影剂可对荷瘤鼠(小鼠H22肝癌肿瘤)皮下异位瘤 与肝癌原位瘤进行CT成像。 权利要求书1页 说明书7页 附图9页 CN 105797173 B 2018.08.21 CN 105797173 B 1.一种用于肝癌早期诊断的纳米金CT造影剂的制备方法， 其特征在于， 该方法的具体 步骤如下： 第1、 纳米金(AuNPs)制备： 采用柠檬酸钠还原法， 制备纳米金溶液， 金元素浓度为0.18mg/mL， 纳米金粒径为18- 25nm； 第2、 硫辛酸修饰的N,N-二异丙基乙二胺(LA-N(iPr)2)制备： 使用硫辛酸(LA)与N,N-二异丙基乙二胺， 在1-乙基-(3-二甲基氨基丙基。

5、)碳酰二亚胺 盐酸盐(EDC.HCL)催化下进行酰胺化反应， 20-40下反应6-12小时； 反应结束后， 使用蒸馏 水进行水洗与分液， 然后使用无水硫酸钠对二氯甲烷相进行过夜干燥； 最后将二氯甲烷旋 干， 得到黄色固体， 即胺分子LA-N(iPr)2； 利用高分辨质谱(ESI-HRMS)确认其结构； 第3、 硫辛酸聚乙二醇修饰的甘草次酸LA-PEG3.5k-GA制备： 采取丁二酰化改性GA， 使用二环己基碳二亚胺(DCC)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)做催化 剂， 并取NH2-PEG3.5k-OH加入到所述GA、 DCC以及NHS的二氯甲烷溶液中， 进行酰胺化反应， 0 下搅拌20-40分钟。

6、， 20-40下反应两天； 将反应混合液在冰乙醚中沉淀， 过滤得到白色固 体， 真空过夜干燥； 然后将产物与硫辛酸(LA)进行酯化反应， 使用1-乙基-(3-二甲基氨基丙 基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC.HCL)与4-二甲氨基吡啶(DMAP)进行催化， 于二氯甲烷溶液中0 下搅拌20分钟， 然后35下反应两天； 旋干二氯甲烷， 固体透析两天， 冻干， 得到白色粉 末； 利用核磁共振(NMR)确认其结构； 第4、 硫辛酸修饰的聚乙二醇LA-PEG2k的合成： 通过酯化反应， 制备硫辛酸修饰的聚乙二醇两千(LA-PEG2k)， 并通过核磁共振(NMR)确 认了硫辛酸-聚乙二醇两千(LA-PEG2k)。

7、的结构； 以上4步为相互独立的步骤， 先后操作顺序可以互换， 也可以分别同时进行； 第5、 纳米金CT造影剂AuNPsLA-N(iPr)2,LA-PEG3.5k-GA,LA-PEG2k制备： 通过金硫键将第4步制备的硫辛酸-聚乙二醇两千(LA-PEG2k)与第2步制备的胺分子LA- N(iPr)2、 第3步制备的靶向配体甘草次酸LA-PEG3.5k-GA按照摩尔比为1： 1： (3-5)的比例共同 修饰在第1步制备的纳米金(AuNPs)表面， 得到AuNPsLA-N(iPr)2,LA-PEG3.5k-GA,LA-PEG2k； 即纳米金CT造影剂。 2.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于该方。

8、法还包括如下步骤： 第6、 纳米金CT造影剂浓缩液制备； 通过分批离心的方法对第5步得到的AuNPsLA-N (iPr)2,LA-PEG3.5k-GA,LA-PEG2k进行离心处理， 首次离心25000转/分钟， 45分钟； 二次离心 15000转/分钟， 60分钟， 得到了具备小鼠CT成像能力的浓缩复溶性纳米金CT造影剂浓缩液， 其中金元素浓度为0.15M。 3.一种权利要求1所述方法制备的用于肝癌早期诊断的纳米金CT造影剂， 其特征在于 该造影剂结构为AuNPsLA-N(iPr)2,LA-PEG3.5k-GA,LA-PEG2k； 其中， 纳米金粒径为18-25nm， 表面修饰的三种物质的摩。

9、尔比为n(LA-N(iPr)2)： n(LA-PEG3.5k-GA)： n(LA-PEG2k)1： 1： (3- 5)。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 105797173 B 2 一种用于肝癌早期诊断的纳米金CT造影剂及其制备方法 技术领域 0001 本发明提供一种纳米金CT造影剂及其制备方法， 该方法制备的造影剂适用于肝癌 早期的CT检测， 属于生物医药技术领域。 背景技术 0002 目前， 全球的原发性肝癌死亡率在恶性肿瘤中居第三位， 我国肝癌的发病率和死 亡率均占全球的半数以上(L.A.Torre ,F .Bray ,R .L.Siegel ,J .Ferlay ,J .Lo。

10、rtet- Tieulent,A.Jemal,Global cancer statistics,2012,CA.Cancer J.Clin.65(2015)87 108.doi:10.3322/caac.21262.)。 肝癌高死亡率的原因主要有两个： 一是早期诊断困难， 肝 癌属于深层肿瘤(深度为2.5-10厘米)， 常存在于肝脏深部， 一经发现往往已属中晚期； 二是 病情进展快， 化疗效果差， 加大化疗药物剂量， 易伤及其它脏器。 因此， 实现肝癌的早期诊断 (提高检测灵敏度)十分重要。 计算机断层扫描技术(CT)在肝癌的诊断中具有广泛应用。 其 中， 成像造影剂可以加强组织之间、 正常组。

11、织与病灶之间的信号对比度(H .Lusic , M.W.Grinstaff,X-ray-Computed Tomography Contrast Agents,Chem.Rev.113(2013) 16411666.doi:10.1021/cr200358s.)， 为肝癌的早期诊断、 准确诊断及后期治疗提供必要 的依据。 目前临床上CT的造影剂主要是碘类小分子类造影剂， 它的特异性差、 信号强度较 低， 很难实现对肝癌的早期诊断， 同时存在一定的毒性(D .Kim ,S .Park ,J .H .Lee , Y.Y.Jeong ,S.Jon,Antibiofouling Polymer-Coa。

12、ted Gold Nanoparticles as a Contrast Agent for in Vivo X-ray Computed Tomography Imaging , J.Am.Chem.Soc.129(2007)76617665.doi:10.1021/ja071471p.)。 因此发展高效、 灵敏、 安 全的造影剂对实现肝癌的早期诊断、 准确诊断至关重要。 0003 纳米金是近年来被广泛研究的纳米材料之一， 具有较高的电子密度和X射线吸收 系数(在100KeV下， 金的吸收系数为5.16cm2/g， 是传统碘造影剂的2-3倍)， 因此若能将纳米 金用于CT造影剂， 就有助于实。

13、现肝癌的准确诊断和早期诊断。 0004 研究表明， 纳米金的衰减系数与纳米金的质量浓度相关， 即纳米金在造影部位的 浓度越高， CT成像效果越好(R.D.Ross,L.E.Cole,J.M.R.Tilley,R.K.Roeder,Effects of Functionalized Gold Nanoparticle Size on X-ray Attenuation and Substrate Binding Affinity,Chem.Mater.26(2014)11871194.doi:10.1021/cm4035616.)。 因此， 如 何提升纳米金造影剂在造影部位的靶向能力， 实现其在。

14、造影部位的高浓度富集是研究人员 致力解决的问题。 而单纯引入靶向配体(即主动靶向)并不能显著提高纳米金在肝脏的富集 量。 活体实验数据表明， 能够富集到肿瘤组织的纳米粒子通常不足注射量的5， 大部分在 进入肿瘤细胞之前即被清除出体外(S.Mura,J.Nicolas,P.Couvreur,Stimuli-responsive nanocarriers for drug delivery,Nat.Mater.12(2013)9911003.doi:10.1038/ nmat3776.)。 0005 除靶向配体修饰外， 纳米粒子粒径对其在肿瘤组织富集也有重要影响(H.Maeda, H.Nakamu。

15、ra,J.Fang,The EPR effect for macromolecular drug delivery to solid 说 明 书 1/7 页 3 CN 105797173 B 3 tumors:Improvement of tumor uptake,lowering of systemic toxicity,and distinct tumor imaging in vivo ,Adv .Drug Deliv .Rev .65(2013)7179.doi:10 .1016/ j.addr.2012.10.002.)。 众所周知， 100-200nm左右的粒子能较好地利用EPR效。

16、应(即被动靶 向)聚集到肿瘤部位， 但研究表明这些尺寸的纳米粒子大多分布在肿瘤部位的血管内， 只有 很少的部分能渗透进入肿瘤组织(C .Wong ,T .Stylianopoulos ,J .Cui ,J .Martin , V.P.Chauhan,W.Jiang,et al.,Multistage nanoparticle delivery system for deep penetration into tumor tissue,Proc.Natl.Acad.Sci.108(2011)24262431.doi: 10.1073/pnas.1018382108.)。 而诸多研究表明， 小粒径。

17、的纳米金对肿瘤组织的渗透滞留性 能更好。 0006 本课题组已有工作表明， 在小粒径纳米金表面连接肝靶向配体及恰当的酸敏感基 团和疏水基团， 使纳米金的聚集与分散呈现pH响应性。 pH 7.4时(血液)纳米金以聚集形式 存在， 组装体对其上的靶向配体具有很好的屏蔽作用； pH 6.8时(肿瘤部位)解组装， 靶向配 体暴露， 显示主动靶向功能(见图1)。 重要的是， 如此的配体被 “屏蔽-去屏蔽” 过程具有很好 的可逆性， 这样就可以延长血液循环时间， 反复利用主动及被动靶向作用， 有利于增大纳米 金显影剂在靶部位的浓度。 但是该体系在CT造影所需的浓度(0.1M)下稳定性差， 不适宜动 物CT。

18、实验。 因此， 如何构建既有以上可逆的配体屏蔽-去屏蔽的性质， 同时又能适宜动物成 像的纳米金CT造影剂， 是本发明致力解决的问题。 发明内容 0007 本发明目的是设计并提供一种具有CT造影剂功能的纳米金CT造影剂及其制备方 法， 制备出具有pH响应的配体可逆屏蔽-去屏蔽肝靶向纳米金CT造影剂。 0008 本发明技术方案 0009 一种用于肝癌早期诊断的纳米金CT造影剂， 该造影剂结构为AuNPsLA-N(iPr)2, LA-PEG3.5k-GA,LA-PEG2k。 其中， 纳米金粒径为18-25nm， 表面修饰的三种物质的摩尔比为n (LA-N(iPr)2) n(LA-PEG3.5k-GA。

19、) n(LA-PEG2k)1 1 (3-5)。 0010 一种用于肝癌早期诊断的纳米金CT造影剂的制备方法， 本发明在具有配体可逆屏 蔽-去屏蔽的纳米金表面， 修饰连接有硫辛酸(LA)的聚乙二醇两千(LA-PEG2k)， 获得了适宜 体内CT成像功能的纳米金CT造影剂； CT成像实验表明， 本发明设计制备的纳米金CT造影剂 可对荷瘤鼠(小鼠H22肝癌肿瘤)皮下异位瘤与肝癌原位瘤进行CT成像。 0011 本发明方法的具体步骤如下： 0012 第1、 纳米金(AuNPs)制备： 0013 采用柠檬酸钠还原法， 制备出水合粒径为18-25nm(动态光散射(DLS)方法测试)的 纳米金溶液， 金元素浓。

20、度为0.18mg/mL。 0014 第2、 硫辛酸修饰的N-二异丙基乙二胺(LA-N(iPr)2)制备： 0015 使用硫辛酸(LA)与N-二异丙基乙二胺， 在1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚 胺盐酸盐(EDC.HCL)催化下进行酰胺化反应， 20-40下反应6-12小时。 反应结束后， 使用蒸 馏水进行水洗与分液， 然后使用无水硫酸钠对二氯甲烷相进行过夜干燥。 最后将二氯甲烷 旋干， 得到黄色固体即胺分子LA-N(iPr)2。 利用高分辨质谱(ESI-HRMS)确认其结构。 0016 第3、 硫辛酸聚乙二醇修饰的甘草次酸(LA-PEG3.5k-GA)制备： 说 明 书 2/7 页 4。

21、 CN 105797173 B 4 0017 采取丁二酰化改性GA， 使用二环己基碳二亚胺(DCC)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)做 催化剂， 并取NH2-PEG3.5k-OH加入到GA、 DCC以及NHS的二氯甲烷溶液中， 进行酰胺化反应， 0 下搅拌20-40分钟， 20-40下反应两天。 将反应混合液在冰乙醚中沉淀， 过滤得到白色固 体， 真空过夜干燥。 然后将产物与硫辛酸(LA)进行酯化反应， 使用1-乙基-(3-二甲基氨基丙 基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC.HCL)与4-二甲氨基吡啶(DMAP)进行催化， 于二氯甲烷溶液中0 下搅拌20分钟， 然后35下反应两天。 旋干二氯甲烷， 固体。

22、透析两天(截留分子量3.5k)， 冻干， 得到白色粉末。 利用核磁共振(NMR)确认其结构。 0018 第4、 硫辛酸修饰的聚乙二醇(LA-PEG2k)的合成： 0019 通过酯化反应， 制备硫辛酸修饰的聚乙二醇两千(LA-PEG2k)， 并通过核磁共振 (NMR)确认了硫辛酸-聚乙二醇两千(LA-PEG2k)的结构。 0020 以上4步为相互独立的步骤， 可以分别同时进行， 其先后顺序也可以互换而对本发 明方法没有任何影响。 0021 第5、 纳米金CT造影剂AuNPsLA-N(iPr)2,LA-PEG3.5k-GA,LA-PEG2k制备： 0022 通过金硫键将第4步制备的硫辛酸-聚乙二醇。

23、两千(LA-PEG2k)与第2步制备的胺分 子(LA-N(iPr)2)、 第3步制备的靶向配体甘草次酸(LA-PEG3.5k-GA)按照摩尔比为1 1 (3-5) 的比例共同修饰在第1步制备的纳米金(AuNPs)表面， 得到AuNPsLA-N(iPr)2,LA-PEG3.5k- GA,LA-PEG2k； 即纳米金CT造影剂。 0023 第6、 小鼠CT实验： 0024 通过分批离心对第5步得到的纳米金CT造影剂AuNPsLA-N(iPr)2,LA-PEG3.5k-GA, LA-PEG2k进行离心处理， 首次离心25000转/分钟， 45分钟； 二次离心15000转/分钟， 60分钟， 得到了具。

24、备小鼠CT成像能力所需浓度的纳米金CT造影剂浓缩液， 其中金元素浓度为0.15M。 0025 H22荷瘤鼠异位瘤模型建立： 取腹腔传代H22肝癌细胞的昆明小鼠， 无菌抽取腹水， 生理盐水调整肝癌细胞数至1108/mL的细胞悬液， 直接注射接种于小鼠腋下体侧皮下， 待 肿块生长至1.5cm3时， 即形成H22荷瘤鼠异位瘤模型。 0026 异位瘤荷瘤鼠CT成像实验： 向浓缩后的纳米金造影剂溶液中加入葡萄糖， 将葡萄 糖调制成5质量浓度， 以适应体内注射。 经荷瘤鼠尾静脉注射(每组3只)， 注射体积300 L， 浓度0.15M。 荷瘤鼠经100-140 L水合氯醛(质量分数10)腹腔麻醉后， 使用C。

25、T机进行CT扫 描， 分别在注射前、 注射后0.5h、 1h、 2h、 4h以及6h进行扫描， 记录皮下瘤位置的测试值， 其单 位为CT值， 即Hounsfield Unit(HU)。 0027 H22荷瘤鼠原位瘤模型建立： 接种前， 无菌状态下完整取出步骤1中荷瘤鼠的瘤组 织， 放入生理盐水中， 剔除外周的纤维组织、 血管及中央坏死组织， 切成约1mm3瘤块备用。 利 用肝内隧道植入法构建原位肝癌。 0028 原位瘤荷瘤鼠CT成像实验： 方法同异位瘤荷瘤鼠CT成像实验， 对肝脏原位肿瘤进 行CT成像。 0029 两组CT成像实验结果表明， 较无靶向能力对照组以及不具备配体可逆屏蔽的靶向 对照。

26、组， 本发明制备的纳米金CT造影剂具备更好的肿瘤靶向能力， 即具备更好的CT成像能 力。 0030 本发明的优点和积极效果： 0031 本发明通过合理设计， 向连有靶向配体甘草次酸以及pH敏感胺分子的纳米金表面 说 明 书 3/7 页 5 CN 105797173 B 5 修饰聚乙二醇两千(PEG2k)， 显著地提高了体系在CT成像所需浓度(0.1M)下的稳定性， 获得 了适宜体内CT成像所需浓度的CT造影剂。 同时保证体系具有pH敏感的配体可逆屏蔽-去屏 蔽的功能， 将主动靶向与被动靶向结合， 提高纳米金在肿瘤成像部位的富集与组织渗透， 获 得优异的CT成像效果。 小鼠CT成像实验表明， 本。

27、发明造影剂具有良好的生物相容性， 并可对 荷瘤鼠(小鼠H22肝癌肿瘤)皮下异位瘤与肝癌原位瘤进行CT成像。 附图说明 0032 图1是背景技术部分中， 已有工作即具有pH敏感的纳米金组装-解组装用于配体屏 蔽-去屏蔽的示意图。 0033 图2是实施例2中， 纳米金CT造影剂(AuNPsLA-N(iPr)2,LA-PEG3.5k-GA,LA-PEG2k) 组装-解组装示意图。 0034 图3是实施例1中LA-PEG2k的NMR谱图。 0035 图4是实施例1中AuNPs的粒径图(DLS测试)。 0036 图5是实施例1中LA-PEG3.5k-GA的NMR谱图。 0037 图6是实施例1中纳米金C。

28、T造影剂(AuNPsLA-N(iPr)2,LA-PEG3.5k-GA,LA-PEG2k) 的粒径图(DLS表征)。 0038 图7是实施例2中纳米金CT造影剂(实验组1 4)的粒径-pH图以及粒径与pH循环变 化关系图。 0039 图8是实施例2中纳米金CT造影剂(对照组1)的粒径-pH图。 0040 图9是实施例2中BCA法测定纳米金CT造影剂对于配体屏蔽性质的蛋白吸附图。 0041 图10是实施例3中纳米金CT造影剂浓缩稳定性的效果图。 0042 图11是实施例4中纳米金CT造影剂用于异位瘤荷瘤鼠CT成像的HU-时间图。 0043 图12是实施例4中纳米金CT造影剂用于原位瘤荷瘤鼠CT成像。

29、的HU-时间图。 具体实施方式 0044 以下实施例用于说明本发明， 但不用来限制本发明的范围。 0045 实施例1： 用于肝癌早期诊断的纳米金CT造影剂的制备 0046 1)LA-PEG2k的合成： 称取2g单端甲氧基mPEG2k-OH与0.206g硫辛酸(LA)(其摩尔量 比为LA： mPEG2k-OH5 1)加入到50mL圆底烧瓶中， 向其中加入960mg 1-乙基-(3-二甲基氨 基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC.HCL)与610mg 4-二甲氨基吡啶(DMAP)， 使用30mL二氯甲烷 (DCM)溶解。 冰水浴中搅拌30分钟， 而后35水浴下反应2天。 反应结束后， 将二氯甲烷旋蒸 。

30、除去。 使用蒸馏水将剩余固体溶解， 转移至透析袋(截留分子量2k)透析两天。 冻干， 得到LA- PEG2k白色粉末状固体。 利用NMR表征， 见附图3。 0047 2)LA-PEG4k和LA-PEG10k的合成： 方法同步骤1。 0048 3)AuNPs制备： 称取59mg三水合四氯金酸， 溶于150mL去离子水中， 于250mL圆底烧 瓶中加热至沸腾30分钟。 称取171mg柠檬酸钠， 溶于15mL去离子水中， 快速加入到氯金酸的 沸腾水溶液中， 继续加热至沸腾30分钟， 降至室温， 得到AuNPs水溶液， 金元素质量浓度为 0.18mg/mL。 利用DLS表征， 见附图4。 0049 4。

31、)胺分子LA-N(iPr)2制备： 称取硫辛酸(LA)206mg与N-二异丙基乙二胺144mg溶于 说 明 书 4/7 页 6 CN 105797173 B 6 20mL二氯甲烷中， 室温下搅拌30分钟。 然后加入200mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二 亚胺盐酸盐(EDC.HCL)， 35下反应6小时。 反应结束后， 使用蒸馏水进行水洗与分液， 然后 使用无水硫酸钠对有机相进行过夜干燥。 最后将二氯甲烷旋干， 得到LA-N(iPr)2黄色固体。 高分辨质谱(ESI-HRMS):333.2030(M+1)表征合成成功。 0050 5)胺分子LA-N(Me)2制备： 方法同步骤4， 将N。

32、-二异丙基乙二胺换成N-二甲基乙二 胺。 0051 6)LA-PEG3.5k-GA制备： 称取320mg丁二酰化改性GA， 103mg二环己基碳二亚胺(DCC) 与57mgN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶于30mL二氯甲烷并至于冰水浴中， 称取1.7gNH2-PEG3.5k- OH加入到上述混合溶液中， 0下搅拌30分钟， 35下反应两天。 将反应混合液在冰乙醚中 沉淀， 过滤得到白色固体， 真空过夜干燥。 然后称取515mg硫辛酸(LA)， 479mg1-乙基-(3-二 甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC.HCL)与305mg4-二甲氨基吡啶(DMAP)， 加入到白色 固体的二氯甲烷溶液中。

33、， 0下搅拌20分钟， 然后35下反应两天。 旋干二氯甲烷， 固体透析 两天(截留分子量3.5k)， 冻干， 得到LA-PEG3.5k-GA白色粉末。 利用NMR表征， 见附图5。 0052 7)纳米金CT造影剂(AuNPsLA-N(iPr)2,LA-PEG3 .5k-GA,LA-PEG2k)的制备： 取 0.1mgLA-N(iPr)2溶于1mL蒸馏水中， 加入100 LHCl溶液(pH 1)， 室温下搅拌30分钟。 然后加 入0.12mL浓度为10mg/mL的LA-PEG3.5k-GA溶液与0.12mL浓度为20mg/mL的LA-PEG2k溶液， 即 三种物质的物质的量的比为n(LA-N(i。

34、Pr)2) n(LA-PEG3.5k-GA) n(LA-PEG2k)1 1 4， 继续 搅拌5min。 加入6mLAuNPs溶液， 室温搅拌过夜， 即得到纳米金CT造影剂， 将其标记为实验组1 4。 利用DLS表征， 见附图6。 对于LA-PEG3.5k-GA与LA-PEG2k的摩尔比为1 2和1 6两组， 制备方 法同1 4， 将得到的纳米金CT造影剂分别标记为实验组1 2与实验组1 6。 0053 8)纳米金CT造影剂(AuNPsLA-N(iPr)2,LA-PEG3.5k-GA)的制备： 方法同步骤7。 将其 标记为实验组1 0。 0054 9)纳米金CT造影剂(AuNPsLA-N(iPr。

35、)2,LA-PEG3.5k-GA,LA-PEG4k)的制备： 方法同 步骤7， 其中n(LA-N(iPr)2) n(LA-PEG3.5k-GA) n(LA-PEG4k)1 1 4， 将其标记为实验组1 4 (PEG4k)。 0055 10)纳米金CT造影剂(AuNPsLA-N(iPr)2,LA-PEG3.5k-GA,LA-PEG10k)的制备： 方法同 步骤7， 其中n(LA-N(iPr)2) n(LA-PEG3.5k-GA) n(LA-PEG10k)1 1 4， 将其标记为实验组1 4 (PEG10k)。 0056 11)纳米金CT造影剂(AuNPsLA-N(Me)2,LA-PEG3.5k-。

36、GA,LA-PEG2k)的制备： 方法同 步骤7， 将其标记为对照组1。 0057 12)纳米金CT造影剂(AuNPsLA-PEG4k)的制备： 加入0.12mL浓度为10mg/mL的LA- PEG4k溶液， 继续搅拌5min。 加入6mLAuNPs溶液， 室温搅拌过夜， 即得到纳米金CT造影剂， 将其 标记为对照组2。 0058 实施例2： 纳米金CT造影剂配体屏蔽-去屏蔽考察： 0059 1)纳米金CT造影剂组装-解组装考察 0060 对纳米金CT造影剂， 考察其在正常组织(pH 7.4)与肿瘤条件(pH 6.8)下的组装- 解组装性质。 以实验组1 4(见附图2)与对照组1为例， 具体如。

37、下： 向纳米金溶液中逐滴加入 NaOH溶液(pH 13)至pH 8-9， 待体系出现显著增强的丁达尔现象后， 分别取组装体溶液400 L， 加入800 L缓冲溶液HEPES pH 7.4与HEPES pH 6.8， 利用动态光散射(DLS)考察在不同pH 说 明 书 5/7 页 7 CN 105797173 B 7 下的粒径， 组装体粒径100-200nm， 解组装粒径30-40nm， 用以说明体系的组装-解组装性质。 然后反复调节溶液pH在pH 7.4与pH 6.8之间变化， 测试体系的粒径变化， 用以考察pH敏感 的可逆组装-解组装。 见附图7(实验组1 4)与附图8(对照组1)。 将组装。

38、-解组装结果汇总(见 表1)。 0061 表1 0062 具备组装性质不具备组装性质 实验组1 0 实验组1 2 实验组1 4 实验组1 4(PEG4k) 实验组1 4(PEG10k) 实验组1 6 对照组1 对照组2 0063 2)纳米金CT造影剂配体屏蔽性考察 0064 牛血清白蛋白(BSA)与甘草次酸(GA)具有较强的疏水结合能力， 纳米粒子表面GA 越多， 则吸附蛋白越多。 喹啉甲酸法(BCA法)是最常用的检测蛋白浓度方法之一， 其灵敏度 高， 且检测不受绝大多数化学物质的影响。 为比较两种状态粒子表面GA含量差异， 选用BCA 试剂盒来测定两种状态纳米金的蛋白吸附量(即向一定浓度BS。

39、A溶液中加入纳米金溶液， 待 蛋白吸附平衡后， 测定溶液中剩余的蛋白浓度)， 用以评价体系组装-解组装对于靶向配体 甘草次酸(GA)的屏蔽效果。 测试结果见附图9。 0065 附图9的BCA测试结果表明， 实验组1 0、 实验组1 2与实验组1 4在pH 7.4下具备对 GA的屏蔽效果， 而pH 6.8下解组装有利于配体GA的去屏蔽。 0066 实施例3： 纳米金CT造影剂浓缩稳定性考察： 0067 采用批次离心， 对修饰后的纳米金溶液(即纳米金CT造影剂)进行浓缩。 首次离心 (25000转/分钟， 45分钟)， 将批量纳米金液体进行约20倍浓缩； 二次离心(15000转/分钟， 60 分钟。

40、)， 将首次离心得到的浓缩液进一步约8倍浓缩。 最终得到适宜荷瘤鼠CT成像所需浓度 (0.1M)的纳米金浓缩液(0.15M)。 实验组1 0与实验组1 2出现沉淀， 说明造影剂在造影浓度 下稳定性差， 不适宜体内CT成像。 测试结果见附图10。 0068 综合实施例2与实施例3， 确认适合体内造影的纳米金CT造影剂为实验组1： 4(2k) (即AuNPsLA-N(iPr)2,LA-PEG3.5k-GA,LA-PEG2k)、 对照组1(即AuNPsLA-N(Me)2,LA-PEG3.5k- GA,LA-PEG2k)以及对照组2(即AuNPsLA-PEG4k)。 0069 实施例4： 小鼠CT成像。

41、实验 0070 1)H22荷瘤鼠异位瘤模型建立： 取腹腔传代H22肝癌细胞的昆明小鼠， 无菌抽取腹 水， 生理盐水调整肝癌细胞数至1108/mL的细胞悬液， 直接注射接种于小鼠腋下体侧皮 下， 待肿块生长至1.5cm3时， 即形成H22荷瘤鼠异位瘤模型。 0071 2)异位瘤荷瘤鼠CT成像实验： 以实验组1： 4为例， 将浓缩后的纳米金造影剂溶液调 制成5葡萄糖溶液浓度， 经荷瘤鼠尾静脉注射(n3)， 注射体积300 L， 浓度0.15M。 荷瘤鼠 说 明 书 6/7 页 8 CN 105797173 B 8 经100-140 L水合氯醛(质量分数10)腹腔麻醉后， 使用CT机进行CT扫描， 。

42、分别在注射前、 注射后0.5h、 1h、 2h、 4h以及6h进行扫描， 记录皮下瘤位置的测试值， 其单位为Hounsfield Unit(HU)。 测试结果见附图11。 0072 3)H22荷瘤鼠原位瘤模型建立： 接种前， 无菌状态下完整取出步骤1中荷瘤鼠的瘤 组织， 放入生理盐水中， 剔除外周的纤维组织、 血管及中央坏死组织， 切成约1mm3瘤块备用。 利用肝内隧道植入法构建原位肝癌， 即小鼠麻醉后开腹， 暴露肝左叶， 用麻醉套管针在肝叶 上刺孔， 将切好的异位移植瘤块植入肝叶内， 缝合关腹。 1周后随机处死5只接种原位肝癌昆 明小鼠， 取出肿瘤进行组织学分析后， 确认实验模型建立成功。 。

43、0073 4)原位瘤荷瘤鼠CT成像实验： 方法同步骤2， 对肝脏原位肿瘤进行CT成像。 测试结 果见附图12。 0074 实施例5： 纳米金CT造影剂(AuNPsLA-N(iPr)2,LA-PEG3.5k-GA,LA-PEG2k)的制备： 其中， n(LA-N(iPr)2) n(LA-PEG3.5k-GA) n(LA-PEG2k)1 1 3。 方法同实施例1中步骤1-步 骤7。 0075 实施例6： 纳米金CT造影剂(AuNPsLA-N(iPr)2,LA-PEG3.5k-GA,LA-PEG2k)的制备： 其中， n(LA-N(iPr)2) n(LA-PEG3.5k-GA) n(LA-PEG2k。

44、)1 1 5。 方法同实施例1中步骤1-步 骤7。 0076 实施例7： 分别取实施例5与实施例6中的纳米金CT造影剂(即n(LA-N(iPr)2) n (LA-PEG3.5k-GA) n(LA-PEG2k)1 1 3与n(LA-N(iPr)2) n(LA-PEG3.5k-GA) n(LA-PEG2k)1 1 5)进行配体屏蔽-去屏蔽考察(方法同实施例2)、 浓缩稳定性考察(方法同实施例3)以及 小鼠CT成像实验(方法同实施例4)。 结果表明， 两种纳米金CT造影剂(分别由实施例5与实施 例6制备)具备与实验组(即n(LA-N(iPr)2) n(LA-PEG3.5k-GA) n(LA-PEG2。

45、k)1 1 4)相似的 相关性质。 说 明 书 7/7 页 9 CN 105797173 B 9 图1 图2 说 明 书 附 图 1/9 页 10 CN 105797173 B 10 图3 说 明 书 附 图 2/9 页 11 CN 105797173 B 11 图4 说 明 书 附 图 3/9 页 12 CN 105797173 B 12 图5 说 明 书 附 图 4/9 页 13 CN 105797173 B 13 图6 图7 说 明 书 附 图 5/9 页 14 CN 105797173 B 14 图8 说 明 书 附 图 6/9 页 15 CN 105797173 B 15 图9 说 明 书 附 图 7/9 页 16 CN 105797173 B 16 图10 图11 说 明 书 附 图 8/9 页 17 CN 105797173 B 17 图12 说 明 书 附 图 9/9 页 18 CN 105797173 B 18 。