技术领域
本发明涉及一种疏水性病毒衣壳蛋白的制备方法及其应用，特别涉及一种戊型肝炎病毒样颗粒疫苗的制备方法及其应用，属于生物医药技术领域。
背景技术
戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus，HEV)是肝炎病毒科肝病毒属成员之一，含一正向单链RNA，基因组有3个重叠开放阅读框架(ORFs)，包括ORF1、ORF2、ORF3。病毒分为4种基因型，基因I型和基因II型病毒主要从人体分离，基因III型、基因IV型病毒主要来源于猪、鸡、兔、犬等动物，甚至有基因V型病毒发现。基因I型病毒主要在中国以及东南亚流行，HEV是急性肝炎的主要病原，引起中度、严重肝炎，严重程度随年龄增加。
HEV在许多发展中国家流行，特别是南亚、东南亚、北非、中东地区，流行病学调查全球有1/3人感染。HEV通过饮用污染水源的粪口途径传播。普通人感染的死亡率1-15％，但对怀孕妇女引起致死急性感染，死亡率高达30％，感染存活的怀孕妇女发生高概率流产、早产。对慢性肝炎病人，HEV二次感染导致严重后果。所以HEV是严重威胁公共卫生的疾病，快速的诊断和预防HEV是非常有必要的。
人的戊型肝炎尽管在普通人群中发病率小于1％，但在发展中国家或卫生条件不好的地区，因为污染的水源大规模急性戊型肝炎经常发生，发达国家也有食品污染散发流行。截至目前，已经鉴定和确定4个基因型HEV病毒，基因I型、基因II型病毒只在人群传播，而基因III型、基因IV型病毒在动物之间传播，甚至发现了在野猪和大鼠中流行基因V型、基因VI型戊型肝炎病毒。所有已经辨明的猪戊型肝炎病毒属于基因III型或基因IV型病毒，可跨种属间的屏障传播，其他动物犬、兔的HEV也能感染猪。人的动物源性戊型肝炎病毒感染经常多发生于消费了污染的猪肝、猪肉、鹿肉或其他污染传染性HEV的肉制品或水。
鸡戊型肝炎病毒引起肝炎脾肿大综合症(hepatitis splenomegaly syndrome(HS syndrome))，引起30-72周的蛋鸡卵巢萎缩，肝脾肿大、腹腔大量红色积液。禽HEV的基因组基因测序显示禽HEV基因组结构和哺乳动物相似，核苷酸序列有50％的同源性，与人HEV和猪HEV基因结构和功能相似。禽HEV的衣壳蛋白和哺乳动物有共同的抗原性和抗原表位。美州的禽HEV、欧洲禽HEV、东南亚分离的禽HEV的核苷酸同源性达80％，应属于肝炎病毒不同的属，其他人、猪、犬HEV为肝炎病毒科不同肝炎病毒属。
60周龄的SPF鸡静脉注射5×104.5 50％禽感染剂量，引起HS综合症，有淋巴细胞lymphocytic periphlebitis和phlebitis为特征的肝损伤，约有25％感染的鸡有subcapsular出血或肝右中叶肥大现象，浆肝酶乳糖脱氢酶轻微上升(the plasma liverenzyme lactate dehydrogenase)。禽HEV的致病性的发现给HEV致病和免疫的研究提供了小个体动物模型，同时也为HEV疫苗的评估和研究提供了平台，特别是疫苗对HS综合症的防控效果。
一般地，健康鸡感染HEV有抗体产生，显示为亚临床症状。从HS的鸡和健康鸡的分离的病毒核苷酸的同源性为91％，其致病性不同，因此疫苗对不同HEV的毒株的保护性不同，实例强调了对禽不同致病性的毒株的保护效果。
禽戊型肝炎病毒在鸡群中流行，引起肝炎型脾肿大综合症，在澳大利亚、西班牙、美国、中国发现已经鉴别了至少3个基因型HEV，和人、猪源的HEV核苷酸同源性50-60％。除此之外，大鼠、獴、鹿、兔、鱼都发现有HEV，哺乳类HEV只有1个血清型。
减毒或灭活的疫苗因为无适合的细胞系统未能开发，只有中国开发注册了一大肠杆菌表达的HEV病毒样颗粒疫苗，但表达的病毒样颗粒制造工艺复杂，表达的蛋白为包涵体，需要复杂的变复性过程才能组装成病毒样颗粒。在HEV蛋白中，ORF1编码非结构蛋白，在免疫中不形成中和抗体，ORF3编码一种功能不清的非结构蛋白，短期形成抗体，但无中和作用。ORF2编码72kD衣壳蛋白，有660个氨基酸组成，其中的组成片段具有免疫原性且在各基因型戊型肝炎病毒高度保守。衣壳蛋白的抗体体外中和HEV，保护非人类灵长动物猿猴免受感染，且长期保护。ORF2全长衣壳蛋白(72kDa)不适宜作为疫苗抗原，因为其掩盖主要免疫表位，有一定的疏水性性质。截断的衣壳蛋白55kDa是一种较为稳定、安全且具有免疫原性的疫苗抗原。由于HEV缺乏有效的组织培养体系，对于HE灭活及减毒活疫苗的研制造成了难度，目前HE疫苗研究主要集中于HE基因工程疫苗的研制。ORF2含有重要的中和抗原表位，目前已有ORF2许多片段在不同表达系统中成功地进行了表达，如原核、昆虫、酵母、植物细胞等表达系统，且表达产物均具有一定的免疫原性。
HEV重组的衣壳蛋白在人、非人类灵长动物、鸡上可诱导HEV中和抗体，其中截断的衣壳蛋白，含HEV的免疫表位并形成病毒样颗粒，增强疫苗免疫效果，并对异源HEV病毒攻击产生交叉保护。
发明内容
戊型肝炎病毒由于缺乏适宜的疫苗细胞基质，用细胞培养的方法不能达到生物制品用抗原或疫苗的要求，现多采用基因工程方法制备，一般采用真核系统进行表达，如昆虫、哺乳动物细胞、酵母。用真核系统表达、提取、纯化的步骤多，收率低，仪器和厂房的成本费用昂贵且要求高。全长衣壳蛋白(72kDa)不适宜作为HEV病毒样颗粒疫苗抗原，因为其掩盖主要免疫表位，有一定的疏水性性质。截断的衣壳蛋白55kDa是一种较为稳定、安全且具有免疫原性的疫苗抗原。
针对以上问题，本发明公开了一种制备戊型肝炎病毒样颗粒疫苗的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)合成野生型戊型肝炎病毒全长ORF2基因，基因合成后，插入克隆质粒pGEM-T；
(2)合成戊型肝炎病毒截断的ΔORF2基因
使用大肠杆菌喜好的密码子，设计编码戊型肝炎病毒112-660位氨基酸的截断的ΔORF2基因，然后以野生型戊型肝炎病毒全长ORF2基因为模板，设计引物合成ΔORF2基因，合成的ΔORF2基因产物与同样酶切的pMAL-p4x表达质粒片段连接；
(3)戊型肝炎病毒截断的ΔORF2基因在大肠杆菌中的表达
连接产物转化大肠杆菌，挑选阳性克隆，测序，得到pMAL-p4X MBP-ΔORF2重组质粒；重组质粒pMAL-p4xMBP-ΔORF2接种LB培养基，按1∶200～1∶1000(V/V)转接到含有18L LB培养基的20L的发酵罐中，以250rpm转速37℃培养4～6h，菌液OD600达到0.6～0.8时，按浓度0.5～0.7mmol/L加入IPTG诱导4h，4000rpm离心25min，获得湿重为110～120g/L的菌体培养物；
(4)戊型肝炎病毒截断的衣壳蛋白ΔORF2的提取和纯化
a裂解剂筛选和细菌膜蛋白提取
将步骤(3)得到的菌体培养物融化，重悬于层析缓冲液，用超声仪在冰浴中破碎细胞壁，超声液75,000g、4-8℃离心1小时分离上清和沉淀，沉淀用溶解液溶解，加入裂解剂在4℃搅拌2h提取大肠杆菌膜蛋白，测定提取物的活性，以确定总蛋白和裂解剂的比例，提取物以100,000g超速离心1小时，获得可溶性上清，再用层析缓冲液稀释至最终裂解物的浓度为0.5-1.0％(w/v)以便于后续纯化；
其中，所述的层析缓冲液含有20mM NaH2PO4，100mM NaCl，1μM蛋白酶抑制剂E-64、0.3mM三羧甲基磷酸，pH 7.5，；
所述的溶解液含有20mM Tris-HCl，300mMNaCl，1mM 2-巯基乙醇，pH 8.0，；
所述的裂解剂为Triton X-100和DDM的混合物；
b麦芽糖结合蛋白-ΔORF2纯化
在4℃条件下，20mL直链淀粉介质装柱、用3-5倍柱体积的含1.0％(w/v)Triton-X100和1.0％(w/v)DDM的平衡溶液平衡，含麦芽糖结合蛋白-ΔORF2的上清液以2mL/min的速度进行虹吸上样，上样后用10倍柱体积的含1.0％(w/v)Triton-X100和1.0％(w/v)DDM的平衡溶液洗涤，再用3倍柱体积的不含裂解剂Triton-X100、DDM和EDTA的平衡溶液洗涤，最后用含10mmol麦芽糖的溶液(20mM Tris，pH 8.0，0.2M NaCl，10mM麦芽糖)洗脱，分步收集，测定蛋白含量、纯度；
其中，所述的平衡缓冲液含有20mM Tris-HCl，pH 8.0，300mM NaCl，1mM 2-巯基乙醇，1mM EDTA；
c酶切
按75-100ug蛋白加入1单位的Xa因子常温反应36-48h，使酶切程度达到90-95％；
d抗麦芽糖抗体Sepharose 4亲和层析纯化
酶切反应液与抗麦芽糖抗体偶联Sepharose 4亲和介质充分混合后，4℃孵育18-24小时，吸附除去麦芽糖结合蛋白，收集流穿液，流穿液室温4000rpm离心后收获上清，在上清液获得纯化的戊型肝炎病毒ΔORF2蛋白，纯度检测可达90％；
e分子筛层析纯化
在上步流穿液离心后的上清液中，加入Triton X-100使其终浓度为0.031％(w/v)，用截留值为20kDa的滤器离心浓缩至含5-10mg/mL蛋白，使用2500mL Superdex 20002/150柱进行分子筛层析，浓缩蛋白注射上样，层析柱用平衡液洗脱，分步收集洗脱液，收集液检测纯度和含量，合并收集洗脱液并用截留值截留值为20KDa的超滤器透析浓缩，获得高度纯化的ΔORF2蛋白，纯度检测可达99.0％；
其中，所述的平衡液含有10mM HEPES，pH 7.2，150mM NaCl，0.3mM TCEP，0.031％(w/v)Trioton X-100；
(5)戊型肝炎病毒样颗粒疫苗配制
根据使用对象的不同，采用不同类型的佐剂，人作为使用对象时，纯化的ΔORF2蛋白按0.6-0.7mg/mL加入佐剂氢氧化铝吸附，即得；猪、犬和鸡作为使用对象时，纯化的ΔORF2蛋白按1∶3重量比加水包油包水佐剂乳化，即得。
在本发明中，优选的，步骤(2)中所述的引物为：
上游引物：
5’-AAGGATCCATGGCGGTCGCTCCAGCCCATGACACCCCGCCAGT-3’；
下游引物：
5’-GGTCTAGACTATAACTCCCGAGTTTTACCCACCTTCATCTT-3’。
在本发明中，优选的，步骤(3)中所述的大肠杆菌为B834-pRARE2。
在本发明中，优选的，步骤(4)中所述的裂解剂中Triton X-100和DDM浓度均为5-10％(w/v)；所述的总蛋白和裂解剂的比例为1∶4(w/w)。
在本发明中，优选的，所述的野生型戊型肝炎病毒全长ORF2基因是指来源于人、猪、犬、禽、牛、羊、骆驼以及兔的戊型肝炎病毒全长ORF2基因。
本发明还提供了由以上任一项所述的的制备方法制备得到的戊型肝炎病毒样颗粒疫苗。
进一步的，本发明提供了所述的戊型肝炎病毒样颗粒疫苗在制备戊型肝炎病毒截断的衣壳蛋白多克隆抗体中的应用；以及
所述的戊型肝炎病毒样颗粒疫苗在制备预防戊型肝炎病毒所引起的疾病的药物中的应用。
在本发明中，优选的，采用亲和层析纯化戊型肝炎病毒截断的衣壳蛋白多克隆抗体。
本发明对戊型肝炎病毒截断衣壳蛋基因进行了密码子优化，筛选了采用原核表达系统可提高疏水蛋白表达水平大肠杆菌菌株，融合了提高疏水蛋白可溶性表达、方便分离纯化标签麦芽糖结合蛋白MBP，对大肠杆菌膜蛋白抽提能力不同的裂解剂进行筛选和组合，通过融合表达、细菌破碎、细菌膜抽提、麦芽糖直链淀粉亲和层析，并通过体外酶切、亲和层析、分子筛层析除去麦芽糖结合蛋白和非病毒结构蛋白，并促使病毒样颗粒的组装，使戊型肝炎病毒截断的衣壳蛋白HEV-ΔORF2的病毒样颗粒纯度达99.0％以上，克服了HEV-ORF2蛋白疏水和大肠杆菌表达生成的包涵体的问题，且没有任何蛋白标签并具有生物活性，本发明的戊型肝炎病毒截断的衣壳蛋白HEV-ΔORF2以非包涵体形式存在，纯化过程中不经变性和复性的步骤，并具有可溶性。
本发明中除采用基因密码子优化提高戊型肝炎病毒样颗粒的表达外，优选了高水平的表达大肠杆菌菌株，稀有密码子补充的大肠杆菌B834-pRARE2是高水平、可溶性表达制备具有生物活性的戊型肝炎病毒衣壳蛋白的最佳细菌。pMBP-HEVΔORF2转化稀有密码子补充菌BL21(DE3)-RILP没有改善融合蛋白可溶性和高水平表达，另外的稀有密码子补充菌株C41(DE3)-pRARE2和C43(DE3)-pRARE2表达MBP-ΔORF2的水平与E.coli B834-pRARE2一样，表达的蛋白不形成包涵体。
Triton X-100和DDM的混合极大降低了总蛋白的提取所需裂解剂的用量，降低了裂解剂剂对戊型肝炎病毒衣壳蛋白生物学、理化性质以及后处理的负面影响，提高了戊型肝炎病毒衣壳蛋白融合蛋白的提取和纯化收率。后续步骤中亲和层析纯化和分子筛凝胶层析纯化去除了分子标签MBP和未切断的融合蛋白，同时产生了自我组装的高纯度、高收率的戊型肝炎病毒样颗粒。
利用本发明制备方法，20L(工作体积18L)的发酵罐发酵诱导培养最终均可得4～6mg的戊型肝炎病毒样颗粒蛋白，纯度99.0％以上，可用于戊型肝炎病毒样颗粒疫苗制备和戊型肝炎治疗、诊断抗体的制备。
本发明一个优选的实施例中强调了对禽不同致病性的HEV毒株的保护效果。首先制备感染性禽HEV，并确立其在禽上的致病性。为评估配制的禽用疫苗的免疫保护效果，5周龄72只鸡分成4组，每组18只。1-2组免疫禽用水包油包水佐剂配制的疫苗，含抗原2.5微克，免疫2次，间隔1月。6月后1组静脉注射5×102.5 50％鸡感染剂量的鸡戊肝前体病毒，2组静脉注射5×102.5 50％鸡感染剂量鸡HEV-ZL株，3组和4组作为不免疫阴性对照。每组的鸡在感染攻击2、3、4周进行解剖。全部免疫鸡在免疫后抗体阳转，阴性对照全部抗体阴性。
感染前体病毒3组鸡的平均抗体滴度高于感染禽HEV-ZL病毒组禽产生的抗体，但无显著差异；3-4组在病毒血症、粪便排毒方面无显著差异。在血液分析中，除鸡HEV前体病毒组的血清肌酸磷酸激酶高于HEV-ZL株感染组外，其余指标与未免感染组无显著差异。结果揭示HEV-ZL致病性减弱，HS综合症的发生伴随其他相互作用的病因。
鸡HEV引起鸡肝炎脾肿大综合症，由于标准的鸡HEV的稀少和目前无法细胞培养，采用分离HEV原型株和毒力减弱的鸡传代恢复株进行攻毒。首先对分离的HEV进行传染性滴定。采用商用水包油包水禽用佐剂，乳化成含2.5μg抗原的疫苗，免疫程序2剂、肌肉注射、间隔1月，攻毒时间为免疫后6个月，对免疫组鸡和未免疫鸡感染攻击毒致病性在临床过程、病理损伤方面进行了比较了确定。即对疫苗的免疫原性、保护效果，包括抗体生成能力，对HEV感染引起病毒血症、粪便排毒、肝脾损伤、以及CPK水平的保护进行了比较。
疫苗组在感染攻击后一周内抗体水平明显提高，不同致病性的毒株攻击的疫苗组抗体水平无显著差异。对禽HEV原型病毒和鸡上的恢复传染性病毒引起的病毒血症、粪便排毒以及病理损伤产生保护。
本发明另一个优选的实施例中，从血清流行病学调查，宠物犬、猫感染戊型肝炎病毒，无临床症状，有肝炎组织病理变化，但至今犬HEV病毒没有适宜的细胞培养系统，且分离克隆困难，适宜标准的犬HEV感染病毒目前未能建立，通过建立犬免疫感染HEV模型，了解犬感染戊肝病毒的进程和病理(感染犬)，评估本发明疫苗的安全性和对犬感染、临床、疾病是否保护以及免疫保护期。本发明的HEV截断衣壳蛋白疫苗，在猪上免疫10-100μg疫苗抗原，间隔2周，加强免疫，12月后用不同来源的HEV静脉注射攻击，攻击后4周进行尸检，观察病毒血症、粪便病毒排毒情况、以及肝组织病理变化，评估HEV疫苗的安全性、免疫原性、免疫交叉保护性。免疫动物诱导了强烈的IgG anti-HEV反应，对动物源性的人、猪戊型肝炎病毒感染攻击产生完全保护。表明本发明疫苗可防控动物源性的戊型肝炎。
本发明另一个优选的实施例中，因为HEV至今未能在细胞上繁殖，使HEV病毒繁殖与体内感染异常困难。至今发现猪、鸡、兔可作为试验性疫苗的动物模型，但所采用的攻击毒为必须适应细胞系繁殖或分子克隆，掌握和了解HEV在动物模型上的致病和免疫机制。为评估发明的疫苗，实施例中用猪作为疫苗评估动物模型，注射疫苗含10-100μgHEV抗原(兽用水包油包水佐剂，人用含0.75mg/mL氢氧化铝)，猪分为8个组，每组6头，分别免疫1-3个抗原含量疫苗，在免疫剂后，间隔1月，加强免疫，免疫完成后12月后分别用同基因型的III型猪HEV、III型人HEV、基因IV型人HEV攻毒。对照组用PBS免疫，分别攻毒。毒后每组动物每周取血测定HEV RNA和抗HEV IgG抗体，所有猪收集每周粪便样本检测HEV RNA，由于HEV感染猪产生亚临床症状，发明中特别采用病毒血症产生、病毒血症持续时间、粪便病毒以及显微肝脏损失作为评估保护感染的指标。猪攻毒后感染的证据为粪便有病毒排泄和病毒血症。所有猪在免疫12月后都无病毒血症，并全部产生了抗HEV IgG抗体，揭示疫苗对不同源、不同基因型HEV感染的保护，疫苗对动物HEV感染的广谱免疫性和保护效果。疫苗在HEV动物模型猪上，可对人、猪HEV感染产生完全保护。
目前正在注册和试验性HEV疫苗，都是单一病毒株的HEV衣壳蛋白为抗原，许多不同基因型的动物HEV的发现和识别，单一HEV株的疫苗能否对不同基因型的病毒产生保护，特别是不同基因型动物源性HEV的感染产生足够的保护，本发明提供的疫苗在猪体上对猪、人HEV病毒感染产生交叉保护作用。
实施例中，各组6头未免的动物在HEV病毒攻击后持续2周有100％的猪发生了粪便散毒现象。相反在用疫苗免疫的猪HEV攻击的各组中，粪便散毒显著减少。揭示疫苗对人、猪HEV攻击产生了一定水平的保护。一般情况下，猪HEV感染产生轻微肝组织损伤，特征淋巴胞质溶解性炎症。尸检后，所有未免疫-攻击组的肝损失平均分值均高于免疫组攻击组，说明对动物的5种HEV产生一定水平的交叉保护，粪便散毒的检测足以证明本发明疫苗的保护作用。
所有感染基因III型猪HEV的猪，抗HEV IgG阳性，表明已经感染，粪便中出现排毒，感染病毒后表现健康无临床症状，开始且持续排毒2周，且病毒血症、抗体阳转、粪便排毒的发生时间、持续时间因猪HEV不同而不同。一些猪的粪便排毒、病毒血症持续时间较长。与HEV感染鸡所发生的现象类似。人HEV慢性病人也有长时间排毒的类似现象。基因III型猪HEV自然感染的猪也有持续排毒现象，排毒时间长达12周，由此判断HEV感染猪有的发展成持续感染。同时2剂免疫后的猪全部抗HEV IgG阳性，抗体水平高于阈值。说明疫苗诱导了体液免疫反应，在12月后感染攻击，对基因III型、基因IV型人HEV病毒以及同源基因IV型猪HEV产生了保护，没有发生病毒血症和粪便排毒。疫苗对人、猪的同源基因型、异源基因型的HEV感染产生完全保护。
HEV在人、猪、犬、禽、猫、羊、牛、骆驼、兔子上流行，在国内有I-IV基因型HEV，如基因I型、基因III型、基因IV型的流行，但因这些病毒分离、培养和动物试验性跨种感染未能成功，实例用的病毒感染物有限。实例中证实了发明疫苗的免疫原性以及广谱性，对同源基因型和异源基因型HEV病毒感染产生了交叉保护，至少该疫苗对猪和人基因I型、基因III型、基因IV型病毒产生感染产生保护。
这些实施例说明，本发明的戊型肝炎病毒样颗粒疫苗对人、猪HEV感染的临床症状(粪便排毒和病毒血症)的完全保护性，对犬禽HEV病毒感染排毒、病毒血症的完全保护。同时也说明除非人类灵长动物上外，猪、禽为HEV疫苗评估的最佳模型。
与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：
本发明戊型肝炎病毒样颗粒疫苗的制备方法简单、易于放大和转化，适合建立规模化，易于质量控制、成本低廉的大肠杆菌发酵、纯化工艺；相对成熟的质量控制方法和质量标准，高纯度不加任何分子标签的病毒样颗粒抗原，适合体内用生物制品的研制；方法可按GMP要求生产2类不同使用对象产品，人用戊型肝炎生物制品和兽用戊型肝炎生物制品。戊型肝炎病毒样颗粒蛋白，纯度99.0％，用于戊型肝炎结构、如X-ray、质谱、晶体结构、戊型肝炎病毒免疫和致病研究。本发明戊型肝炎病毒样颗粒疫苗对猪、犬、鸡HEV感染产生完全保护，不同基因型HEV病毒之间有交叉保护性抗原。在动物上可作为一种疫苗，预防猪、犬、禽HEV引起的疾病和感染。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1戊型肝炎病毒衣壳蛋白基因密码子优化
所用试剂和酶：T4DNA连接酶和限制性内切酶均购自美国NEB公司，Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside(IPTG)、多聚酶、dNTP和蛋白标记均购自德国罗氏公司，生物反应器购自Lithuania公司，所有化学药品购自德国Merck(Germany)和美国Sigma公司。
HEV基因ORF2基因组序列来自基因库中国HEV分离毒(accession no.AF444002.1)。野生型截断的ORF2.1编码HEV衣壳蛋白1-660位氨基酸，用GenScript软件对野生型的ORF2基因组序列进行稀有密码子分析，在ORF2基因两端放置2个限制性内切酶NdeI和XbaI。按表1所示的酶切位点酶切消化pGEM-T质粒，合成野生型戊型肝炎病毒全长ORF2基因，基因合成后，插入克隆质粒pGEM-T。
为构建截断ORF2(编码HEV衣壳蛋白112-660位氨基酸序列)，在112位氨基酸前端加上BamHI酶切位点，660位氨基酸序列后加上XbaI酶识别位点和终止密码子，用软件模拟酶切和表达确证设计序列的准确性。设计合成引物ORF2-F(5’AAGGATCCATGGCGGTCGCTCCAGCCCATGACACCCCGCCAGT-3’)和ORF2-R(5’GGTCTAGACTATAACTCCCGAGTTTTACCCACCTTCATCTT-3’)。
多聚酶链式反应25μL反应混合物：10μLORF2合成的基因产物、2mM MgCl2、1×标准缓冲液II(Perkin Elmer Corp.)，0.2mM dNTP、0.375单位Taq酶、0.3μM 5’引物MF1、0.3μM 3’引物MR1，引物见表1。多聚酶链式反应条件：95℃5min变性，进入30次循环反应，每次循环95℃变性30s、50℃退火30s、72℃延伸45s，30个循环后产物72℃延伸10min，置于4℃。PCR产物纯化可用商用试剂盒按说明书进行。
以野生型戊型肝炎病毒全长ORF2基因为模板，采用表1中的引物ORF2-F和ORF2-R合成ΔORF2基因。使用GenScript软件分析截短的ORF2基因(orf2.1)密码子，在未改变氨基酸的前提下均使用大肠杆菌喜好的密码子，原始和优化的密码子适合指数(codon adaptation index，CAI)进行了比较，蛋白质的表达水平与CAI值密切相关，CAI大于0.8时，蛋白能有良好表达，CAI＝1时，表达最为理想。本发明优化基因的CAI为0.85。
表1HEV蛋白基因扩增引物、酶切位点、产物和蛋白表达
实施例2戊型肝炎病毒截断的衣壳蛋白HEV-ΔORF2蛋白的可溶性、大量表达和提取
1试验方法
1.1可溶性表达质粒构建和筛选
将实施例1合成的ΔORF2基因产物与同样酶切的pMAL-p4x表达质粒片段连接。为增加表达产物的可溶性，选择适合的融合伴侣和纯化标签，特别是优化的融合伴侣为N端麦芽糖结合蛋白，C端不加融合伴侣或纯化标签，保证重组表达产物可做疫苗抗原。MBP(麦芽糖结合蛋白)标签蛋白大小为40kDa，由pMAL-p4x表达质粒上的malE基因编码。MBP可增加在细菌中过量表达的融合蛋白的溶解性，尤其是真核蛋白。MBP标签可通过免疫分析很方便地检测。
1.2表达细菌的筛选
构建的MBP-ΔORF2不同表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)、B834-pRARE2、BL21(DE3)-RILP、C41(DE3)-pRARE2、C43(DE3)-pRARE2。BL21(DE3)和B834活化细胞均购自德国Novagen公司，BL21(DE3)-RILP购自美国Stratagene公司，C41(DE3)和C43(DE3)均购自Lucigen公司，稀有密码子补充质粒pRARE2来自大肠杆菌Rosetta2，在应用中转入适当细菌增强表达，购自Novagen公司，培养基加入100μg/mL氨苄青霉素，在培养含稀有密码子增强表达质粒(pRARE2，RILP)转化菌中按34μg/mL加入氯霉素。细菌种子用3mLLB培养基，37℃培养至OD600达0.5-0.6时，接种到100mL的LB培养基中，25℃过夜摇动培养，接种1L有LB培养基37℃培养至OD600为0.7时，加入0.7mM IPTG在37℃培养4-6小时，离心收集细菌，-80℃保存。取0.1g细菌作为样品进行电泳分析。
1.3裂解剂的筛选和组合
0.2g细菌沉淀物重悬35mL层析缓冲液(20mM NaH2PO4，pH 7.5，100mM NaCl，1μM蛋白酶抑制剂E-64、0.3mM三羧甲基磷酸)，在冰浴上超声15分钟，超声2s，停顿2s，输出设置为7，超声仪Misonix 3000。超声液75,000g、4-8℃离心1小时，沉淀用800μL溶解液(20mM Tris-HCl，pH 8.0，300mM NaCl，1mM 2-巯基乙醇)溶解。总蛋白含量用还原试剂兼容型的BCA试剂盒测定，试剂盒中稀释液用蒸馏水代替，所有标准和稀释液用去离子水配制，其他操作按说明书进行。
所选用的裂解剂为：Triton X-100(5％或10％w/v)、N-乙基-N-全氟辛基磺酰基-氨基乙醇(FC-10)、2-羟基-N，N，N-三甲基-2-膦酰基-1-十四烷基铵(FC-12)、月桂基二甲基氧化胺(LDAO)、3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐(CHAPS)、十二烷基-β-D-麦芽糖苷(DDM)、胆酸钠、八烷基葡萄糖苷(β-OG)、洋地黄皂苷(Digitonin)。
用96孔板筛选，每次选5种裂解剂在96孔板中稀释，45μL转移到另一分析用96孔板，对照孔只加入裂解剂，每孔加入5μL重悬的细菌液，4℃过夜或在室温放置3小时，分析板10℃5,500rpm离心1小时，含溶解蛋白上清转入到另一新的微孔板，原来板孔沉淀加入50μL溶解缓冲液，取10μL上清溶解液(S)和非溶解蛋白液(P-pellet)进行SDS-PAGE电泳。通过比较沉淀和溶解液获得各裂解剂的溶解效率，当上清溶解液(S)的溶解效率大于50％，则单独或联合裂解剂使用，提高优化裂解剂的溶解膜蛋白的效率。
1.4HEV蛋白纯化
2.2cm直径含10mL直链淀粉介质的柱用含1.0％(w/v)Triton X-100和1.0％(w/v)DDM的平衡溶液(20mM Tris-HCl，pH 8.0、300mM NaCl、1mM 2-巯基乙醇、1mM EDTA)平衡，含融合蛋白MBP-ΔORF2的上清液在4℃以2mL/min流速上样，上样后用10倍柱体积的含1.0％(w/v)Triton X-100和1.0％(w/v)DDM的平衡溶液洗涤，再用3倍柱体积的不含裂解剂Triton-X100、DDM和EDTA的平衡溶液洗涤，最后用10倍柱体积洗脱溶液(20mM Tris-HCl，pH 8.0、300mM NaCl、1mM 2-巯基乙醇、10mM麦芽糖)洗脱，收集5mL洗脱液用4-20％梯度SDS-PAGE胶检测纯度，蛋白含量用还原试剂兼容型的BCA试剂盒检测。免疫印迹测定分子量，具体步骤：细菌裂解液(100mM Tris-HCl，pH7.2，1mM EDTA，2％Triton-X 100，0.5M KCl)、膜抽取物、MBP亲和层析纯化产物、凝胶层析经12％SDS-PAGE电泳，转到CAPS(10mM 3-(环己胺)-1-丙磺酸)，pH10.5，0.5％W/V DTT，15％V/V甲醇)缓冲液PVDF膜(Milliporo，0.45μm)上，电压65V，时间1h。PVDF膜在4℃用Superblock PBS(Pierce产品，含0.05％Tween 20)封闭过夜，用PBST(PBS含0.05％Tween 20)洗涤3次。一抗为兔抗HEV纯化多克隆抗体，用PBS稀释5000或10000倍，和PVDF膜室温下一起反应1h，再用PBST洗涤3次，再用辣根过氧化合物酶标记的羊抗兔IgG抗体(1∶10000稀释)室温下反应1h，HRP(辣根过氧化合酶)用ECL(Enhanced chemiluminescence)试剂检测。
2试验结果
2.1表达质粒和表达细菌的筛选结果
设计合成引物后，采用PCR法构建携带ΔORF2的不同表达质粒，在大肠杆菌单独或和(谷胱甘肽-S-转移酶，GST)、Intein(内含肽)融合表达，产生不溶性的包涵体，结构和活性丧失。为使戊型肝炎病毒衣壳蛋白可溶性表达，进行MBP-ΔORF2融合蛋白表达，利用引物使HEVΔORF2N端和MBP融合，在HEVΔORF2N端上游是麦芽糖结合蛋白MBP的编码基因MalE，中间由Factor Xa酶切位点相连，它们共同位于同一启动子Ptac下，便于融合表达可溶性产物，也有利于把截断的衣壳蛋白HEV-ΔORF2蛋白从融合蛋白上酶切下来，插入质粒pMal p4X和质粒pMal c4x，转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，发现HEV在pMAL p4XMBP-ΔORF2产生了可溶性表达，pMLl c2xMBP-M表达产生了不溶性的包涵体。
pMAL-p4XMBP-ΔORF2在BL21(DE3)和B834-pRARE2表达MBP-ΔORF2，用直链淀粉层析柱纯化后检测融合蛋白MBP-ΔORF2，SDS-PAGE分析其分子量为100kDa。pMAL-p4XMBP-ΔORF2在B834-pRARE2表达MBP-ΔORF2的量高于BL21(DE3)，达到5-6mg/L，而BL2(DE3)表达MBP-ΔORF2的量为1mg/L。
pMAL-p2XMPB-ΔORF2在C41(DE3)-pRARE2、C43(DE3)-pRARE2、C41(DE3)、C43(DE3)表达、纯化后的量和B834-pRARE2表达纯化比较，MBP-ΔORF2的表达水平并未提高。因此戊型肝炎病毒ΔORF2蛋白的表达质粒为pMAL-p4XMPB-M，优选大肠杆菌为B834-pRARE2。所选培养基为LB培养基(1.0％蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％氯化钠、0.2％蔗糖、100μg/m氨苄)，诱导用IPTG的终浓度0.7mM。
pMAL-p4XMPB-ΔORF2/B834-pRARE2按1∶1000体积比接种20L发酵罐，工作体积18L，转速250rpm，37℃培养，OD600达到0.7时，加入(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，IPTG)使终浓度达到0.7mM，继续培养4小时后4000rpm离心25分钟收集菌体，获得菌体称湿重110-120g/L。
表达的优化条件：表达质粒pMAL-p4XMBP-ΔORF2，表达的宿主菌B834-pRARE2，诱导剂IPTG，浓度0.7mM，37℃诱导4小时，菌体称湿重110-120g/L，MPB-ΔORF2的量达到5-6mg/L。
2.2大肠杆菌膜裂解剂筛选和组合结果
裂解剂CHAPS(3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐，CHAPS)、LDAO(月桂基二甲基氧化胺，LDAO)、TritonX-100、洋地黄皂苷(Digitonin)可有效抽提融合蛋白，裂解剂和蛋白比例4∶1(w/w)，其中TritonX-100抽提MBP-ΔORF2蛋白的效率高且价格低廉，因此本发明采用裂解剂TritonX-100。
Triton X-100对有活性的HEV膜蛋白具有稳定作用，单独使用Triton X-100提取大肠杆菌膜上MBP-ΔORF2的蛋白总量小于50％，Triton X-100混合其他裂解剂抽提膜的能力检测和筛选表明：Triton X-100(5％或10％w/v)和另外裂解剂(FC-10、FC-12、CHAPS、LDAO、β-OG、DDM、胆酸钠)混合物中有几种组合提高了MBP-ΔORF2的稳定作用，Triton X-100/DDM、Triton X-100/FC-10组合的抽提能力达90％，但DDM的临界微粒浓度为0.009％w/v，FC-10临界微粒浓度为0.35％w/v，以及价格低廉，容易结晶，所以本发明选择Triton X-100/DDM混合物为抽提HEV膜蛋白的裂解剂，也就是5-10％(w/v)Triton X-100和5-10％DDM(w/v)的混合物。
按每克菌体加入2-3mL蛋白酶抑制剂。用Branson超声仪250在冰浴中菌体悬浮液超声破碎15分钟，1cm探头输出50％，超声2s，停顿2s。菌体破碎后100000g超速离心1h分离颗粒物和可溶性蛋白，沉淀重悬于240-300mL的柱层析缓冲液含适量裂解剂或裂解剂组合，总蛋白和裂解剂的比例为1∶4(w/w)，4℃搅拌2h抽提膜蛋白。100000g离心1h获得可溶性上清，用层析缓冲液稀释使TritonX-100和DDM的浓度分别为0.5-1.0％w/v。
优选的裂解剂按4∶1(w/w)加入到超声后的菌体离心沉淀悬浮液中，100000g超速离心1小时，MBP-ΔORF2就存在于超速离心的上清液中，上样直链淀粉亲和层析柱，10-15倍柱体积的缓冲液洗涤后除去层析柱的非特异结合蛋白，10mM麦芽糖洗脱，洗脱液经12％SDS-PAGE检测分子量为63-64kDa，纯度为90％以上。
对纯化MBP-ΔORF2进行总结描述，18L大肠杆菌培养液产生湿重为23g细菌，经菌体裂解，离心、优化的2种裂解剂混合物制成的裂解液抽取，除去75％的细菌蛋白，活性提高5倍，经直链淀粉亲和层析柱纯化，活性提高30倍，纯度为90％以上。
实施例3戊型肝炎病毒截断的衣壳蛋白HEV-ΔORF2蛋白酶切和亲和层析纯化
1试验方法
1.1MBP-ΔORF2融合蛋白的酶切
Xa因子用缓冲液配制(20mM Tris，pH 8.0，0.2M NaCl、5mM CaCl2)，按100μg蛋白加入1单位Xa因子，将实施例2制备的HEV-ΔORF2蛋白加入Xa因子，室温作用36-48小时，95％的蛋白酶切消化。
1.2抗麦芽糖抗体Sepharose 4亲和介质纯化
酶切反应液和5mL抗麦芽糖抗体偶联Sepharose 4亲和介质混合后4℃孵育18-24小时，每1mL介质吸附0.5mg MBP，能与MBP上的特异位点共价结合，用于纯化与MBP融合表达的蛋白。室温4000rpm离心后收获上清。
酶切、纯化中蛋白采用12％SDS-PAGE、考马斯亮蓝染色分析以及实施例1免疫印迹分析，用实施例2所采用方法测定蛋白含量。
2试验结果
室温进行蛋白酶解反应，反应时间48小时，有90-95％MBP-ΔORF2剪切为ΔORF2蛋白。Xa因子剪切反应物通过MBP抗体偶联的Sepharose 4层析柱，由于ΔORF2不能和MBP抗体结合，多部分ΔORF2从层析柱流穿，MBP蛋白和少量未消化剪切的MBP-ΔORF2蛋白结合到层析柱上。30mL或50mL透析好的酶切反应液体与5mL亲和层析介质充分混合，置4℃摇床震荡过夜，收集流穿液，流穿液室温4000rpm离心后收获上清，在上清液获得纯化的HEV-ΔORF2，纯度检测可达90％。层析柱用3倍柱体积的结合缓冲液(75mM Tris，pH7.5)充分洗涤后，再用10ml洗脱液(0.1M甘氨酸，pH2.7)洗脱收集，收集液含主要含MBP蛋白以及少量MBP-ΔORF2蛋白，立即加入30μl的碱性缓冲液的(3M Tris，pH8.8)，使pH至6.8～7.2。可用于抗体的制备。
实施例4戊型肝炎病毒截断的衣壳蛋白HEV-ΔORF2分子筛层析纯化和结构初步研究
实施例3的流穿液离心后的上清液中加入Triton X-100，并使其终浓度为0.031％(w/v)，用截留值为20kDa的滤器离心浓缩至含5-10mg/mL蛋白，使用2500mL柱体积Superdex 20002/150柱进行分子筛层析。浓缩蛋白500μL注射上样，用平衡液(10mM HEPES，pH 7.2，150mM NaCl，0.3mM磷酸三氯乙酯(TCEP)，0.031％(w/v)Trioton X-100)洗脱，分步收集洗脱液，收集液检测纯度和含量。合并收集洗脱液并用截留值为20KDa的超滤器透析浓缩。
实施例3的流穿液经分子筛层析纯化后，ΔORF2纯度提高175倍，达99.0％，并在-80℃保存稳定，在4℃保存4个月，其活性仍为原来的98％。同时表明戊型肝炎病毒截断的衣壳蛋白HEV-ΔORF2融合蛋白、MBP-ΔORF2以及ΔORF2是以多聚体形式存在，MBP-ΔORF2在Triton X-100或DDM中形成6聚体复合体，戊型肝炎病毒截断的衣壳蛋白HEV-ΔORF2在Triton X-100或DDM中形成4聚体病毒样颗粒。
在凝胶过滤纯化中测定了MBP-ΔORF2蛋白-裂解剂复合体的分子量650kDa，ΔORF2裂解剂复合体分子量为250kDa。
实施例5戊型肝炎病毒截断的衣壳蛋白HEV-ΔORF2亲和层析纯化多克隆抗体的制备
1.1抗血清的制备
初次免疫原的制备采用纯化MBP-ΔORF2(浓度10mg/ml，实施例3制备)+弗氏完全佐剂，按1∶1制成，再次免疫抗原采用纯化ΔORF2蛋白(浓度1mg/ml，实施例4制备)+弗氏不完全佐剂乳化而成。4-5kg新西兰白兔5-6只，静脉注射1ml的初次免疫原，在7、14、22、36、50、64、78、92天注射再次免疫抗原，最后一次免疫12天后，对兔子进行心脏采血，分离血清，-20℃备用。
1.2抗体或抗血清效价测定
血清效价测定采用ELISA法，具体如下：
100μl含1μg纯化HEV-ΔORF2蛋白碳酸钠溶液包被96孔板，置4℃过夜，按150μ/孔加入洗液PBST(PBS，05％Tween-20)洗涤3次，用含3％牛血清白蛋白的PBS(pH7.4)37℃封闭1h，加入不同稀释度(1∶100、1∶1000、1∶104、1∶105)的抗血清在37℃、5％CO2温箱中孵化2h，用洗液洗涤3次，加入辣根过氧化物酶偶联的羊抗兔IgG抗体，该抗体按1∶5000或1∶1000用含1％牛血清白蛋白的PBS稀释，在37℃作用1h，PBST洗涤3次，加入四甲基联苯胺(TMB)底物进行显色反应10分钟。2M硫酸终止反应，用ELISA读数仪在450nm读取OD值。
血清效价的测定也可用蛋白印迹的方法，具体如下：
用微型电泳(Miniprotein II；Bio-Rad)对纯化HEV-ΔORF2蛋白进行电泳(200V电压，室温45min)，在100V电压4℃条件下转移1h，转移的膜用含3％BSA的PBS(pH7.4)在37℃封闭1h，用含0.05％Tween-20的PBST洗涤3次，分别加入1∶5000、1∶10000、1∶20000、1∶50000稀释的抗血清在室温孵育1h，PBST洗涤3次，加入按1∶5000或1∶3000稀释的碱性磷酸酶偶联的羊抗兔IgG抗体，室温作用1h，洗涤3次，加入底物显色。
1.3抗血清的初步纯化
取5ml血清，4℃以10000rpm离心30min，上清转入50ml的离心管中，一边轻轻搅拌，一边加入饱和硫酸铵至终浓度50％，用膜封口冰上放置4h后，4℃以10000rpm离心30min，将上清移入到干净的50mL的管中，获得多克隆抗体，然后用截留值为12-14kD的透析袋或管4℃过夜透析，透析液(PBS，pH7.5)体积应为抗体的1000～10000倍。
1.4ΔORF2蛋白亲和层析柱的制备
取1-2g CNBr活化的介质Sepharose 4B，用250～500ml的1mM HCl溶液洗涤、再用500ml的蒸馏水膨胀介质，用500mL的结合缓冲液(0.1M NaHCO3，0.5M NaCl，pH8.3)洗涤，加入含纯化HEV 3.4M蛋白或MBP蛋白、或MBP-M蛋白溶液进行偶联，4℃过夜，偶联条件为1ml介质结合2mg纯化ΔORF2蛋白或MBP蛋白或MBP-ΔORF2蛋白。用结合缓冲液洗去未结合ΔORF2蛋白，加入0.2M甘氨酸液(pH8.0)4℃封闭12h，再用结合缓冲液(pH 8.5)洗涤1次，用醋酸缓冲液(0.1M醋酸，0.5M NaCl，pH4.0)洗涤4次，加入0.1％的SDS进行变性后，用于纯化抗体或加入适量叠氮化钠置2～8℃备用。
1.5ΔORF2蛋白抗体纯化
3mL或5mL透析好的抗体与3mL亲和层析介质充分混合，置4℃摇床震荡过夜，用3倍柱体积的结合缓冲液(75mM Tris，pH7.5)充分洗涤后，再用10mL洗脱液(0.1M甘氨酸，pH2.7)洗脱收集，收集液立即加入30μL的碱性缓冲液的(3M Tris，pH8.8)，使pH至6.8～7.0。纯化抗体溶液浓缩后加入后30％v/v甘油，使纯化抗体浓度为250μg/mL，在-20℃保藏备用。
实施例6HEV-ΔORF2病毒样颗粒疫苗在预防鸡HEV感染和肝炎脾肿大中的应用
1材料和方法
1.1.禽HEV原型株传染性病毒
5周龄有HS综合症(鸡肝炎脾肿大综合症)的胆汁\粪便分离，地点河北威县养鸡场，用PBS制成悬液，用SPF雏鸡滴定，该种子含5×102.550％鸡感染剂量/mL。
1.2健康鸡HEV-ZL株传染性病毒
健康鸡HEV-ZL株分离于河北威县某鸡场的健康鸡群，试验性感染SPF雏鸡滴定，粪便和血清HEV RT-PCR检测阳性的样本收集制成感染性病毒。首先静脉注射SPF鸡扩增有感染性的病毒材料，收集每日的鸡粪检测HEV RNA，粪便中HEV RNA阳性的鸡尸检，收集胆汁、肠含物用PBS制成10％悬液(w/v)，作为禽HEV病毒种子，滴定。
1.3禽HEV-ZL株在SPF鸡上的感染性滴定
24只SPF鸡分成6组，每组4只，禽HEV-ZL传染性种子用PBS 10倍稀释10-1-10-5.在隔离器中各组每只鸡静脉注射200μL的不同稀释液，对照的4只鸡注射200μLPBS。每周取血液和粪便拭子，用ELISA检测血清抗HEV抗体，RT-PCR检测血清和粪便的HEV RNA，持续观察10周检测，计算50％鸡感染剂量/mL(50％chicken infectious dose，CHID50/mL)。
1.42种鸡HEV病毒(疫苗攻击毒，对照组和正常未免疫组、未攻毒组)
戊型肝炎病毒样颗粒疫苗配制：
根据使用对象，采用不同类型的佐剂，人用按每剂含15μg纯化ΔORF2蛋白，按0.6-0.7mg/mL加入佐剂氢氧化铝吸附，总蛋白不超过100μg，内毒素不高于10EU，细菌DNA残留量不低于1ng，宿主菌蛋白不高于总蛋白的0.02％，无残余抗生素活性。动物主要为猪、犬，按1∶3重量比加入水包油包水佐剂乳化，其中每剂纯化ΔORF2蛋白抗原不低于20μg，总蛋白不高于120μg，内毒素不高于100EU，菌DNA残留量不低于10ng，宿主菌蛋白不高于总蛋白的0.05％，无残余抗生素活性。
72只5周龄，SPF鸡分成4组，每组18只。1-2组免疫禽用水包油包水佐剂配制的疫苗，含抗原2.5μg，免疫2次，间隔1月。6月后1组(n＝18)静脉注射5×102.5CHID50的原型鸡HEV病毒，2组(n＝18)静脉注射5×102.5CID50的鸡HEV-ZL病毒。3-4组注射PBS作为对照组，6月后，3组(n＝18)静脉注射5×102.5CHID50的原型鸡HEV病毒，4组(n＝18)静脉注射5×102.5CID50的鸡HEV-ZL病毒，3组(n＝18)作为未感染鸡。每组单独隔离饲养，严格按生物安全条例进行喂食和饮水。
1.5样品收集和处理
攻毒感染前后每周收集每只鸡的血液和肛门拭子，每周血浆测试生化指标，血清样本用ELISA检测抗HEV抗体，血清和粪便的禽HEV RNA用巢式RT-PCR检测。每组的6只鸡分别在感染后2、3、4周解剖取器官，器官包括肝、胸腺、脾、心、胰腺、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结直肠，用中性福尔马林溶液固定进行组织病理观察。
1.6大体病理学和组织病理学评估
肝等组织或器官用10％中性福尔马林溶液固定，病理损伤按标准的分级系统判定。肝损伤分级0-4，0表示无损伤；1表示有少于5个病灶；2表示有5-8个病灶；3表示有9-15个病灶；4表示有大于15个的病灶。胸腺损伤分级0-4，0表示无病灶；1，表示有1-5个病灶；2表示5-10个病灶；3表示有10-20病灶；4有20达以上病灶。脾脏损伤分级0-3，0表示正常；1表示轻微损伤；2表示中度损伤；3表示严重损伤。
1.7血液生化分析
每组取6只，总计18只，从感染2周-4每周的血液检测生化指标进行分析，检测天冬氨酸氨基转移酶(Aspartate aminotransferase，AST)、乳糖脱氢酶(Lactate dehydrogenase，LDH)、肌酸磷酸激酶(Creatine phosphokinase，CPK)、胆酸(Bile acids，BA)以及总蛋白(Total protein，TP)。禽HEV原型株和禽HEV-ZL衣壳蛋白核苷酸同源性为90.7％
1.8ELISA检测抗HEV IgG
重组纯化截断的ΔORF2蛋白作为包被抗原，检测鸡HEV IgG，兔抗鸡辣根过氧化物酶作为第二抗体(购自Sigma公司)。OD 405nm大于0.3为阳性。鸡HEV感染急性期血清和正常SPF血清分别为阳性和阴性对照。
1.9HEV RT-PCR检测
100μL血清或10％的粪便悬液用TRI试剂(MRC)提取RNA，重悬于12.25μLDNase、无RNA酶、蛋白酶的水中，42℃60min进行逆转录反应：用1μL鸡HEV特异的P2引物(5’-ACAGTTTCACCTCAGGCTCG-3’)或11μL鸡HEV-ZL特异引物YR(5’-CTGCGCAACAGTATCCATTAAG-3’)，0.25μL[50U]超级逆转录酶II(购自美国Invitrogen公司)，1μL 0.1M DTT，4μL 5x RT缓冲液，0.5μl[20U]RNA酶抑制(购自美国Promega公司)，1μl 10mM dNTPs。
加入5μL cDNA在50μL反应体系扩增反应。第一轮扩增鸡HEV原型病毒595bp片段，第一轮反应正向引物P1(5’-ACAACATCCACCCCTACAAG-3’)和反向引物P2。第二轮正向引物P3(5’-AGAACAATGGTTGGCGGTCC-3’)和反向引物P4(5’-GAGGGCAAGCCACCTAAAAC-3’)，扩增预期的鸡HEV原型毒的394bp片段。扩增反应的参数包括：94℃变性9min，进入39个循环，每次循环包括94℃变性0.5min、52℃退火(第二轮PCR 56℃)0.5min，72℃延伸1min，最后72℃延伸7min。
检测鸡HEV-ZL株，第一轮反应，正向引物YF(5’-GCTGCCCTTGGGATGTTTGCAT-3’)和反向引物YR预期扩增产生712bp片段。第二轮反应，用正向引物YF2(5’-AGTTTTGCGGTCTGTCGTGTTT-3’)和反向引物YR2(5’-AGCGTGTTAATCACCGCAAGGC-3’)扩增预期为578bp的片段。反应条件除第一轮反应退火温度48℃，第二轮反应退火温度54℃外，其余参数和扩增HEV原型病毒一样。
各组感染鸡的粪便和血清扩增产物用0.8％琼脂糖分离纯化测序。
1.10统计学分析
组织病理损伤用损伤分值表示，平均分值使用方差分析，抗体滴度用GLIMMIX程序进行高斯分布(Gaussian distribution)分析，生化指标肝酶、总蛋白、胆酸用GLIMMIX程序分析。
2未免疫和感染组鸡的试验结果
2.1HEV-ZL株感染性病毒种子的制备
田间获得的原始粪便和胆汁悬液接种2只SPF雏鸡，3天后粪便有禽HEV RNA检出，感染23天后，收集HEV RNA阳性的粪便制成10％PBS悬液。另一只在感染30天后，收集粪便和胆汁制成10％PBS悬液。
2.2用SPF鸡滴定HEV-ZL株病毒种子的传染性
所有接种10-1、10-2HEV-ZL株病毒种子稀释液的鸡抗体全部阳转，见表2，但其他组的对照组鸡抗体始终阴性。接种最高感染剂量(10-1稀释)的4只鸡，有1只在感染5天后抗体就阳转，其他鸡在感染后6天抗体阳转。接种感染剂量(10-2稀释)的鸡中，1只鸡感染后1天抗体阳转，2只4天后抗体阳转，另外2只在感染6-7天抗体阳转。最高剂量感染的鸡出现病毒血症和粪便排毒，但在接种10-3稀释感染剂量的组中没有观查到病毒血症、粪便排毒，见表3。接种10-4稀释感染剂量、10-5稀释感染剂量、PBS感染组的鸡在试验期间RT-PCR检测HEV RNA阴性，抗HEV-IgG阴性，因此用抗体阳转作为感染性病毒感染滴度计算末端。所以HEV-ZL株病毒种子传染性滴度为5×102.5CHID50/mL。
2.3鸡HEV原型株和HEV-ZL株在未免疫的鸡上的显微损伤比较
只有2只感染的鸡在感染2天后观察到明显的损伤，一只1/18为感染鸡HEV原型株，在肝脏左叶圆形斑点区，另一只1/18为感染HEV-ZL株传染性病毒感染鸡，在肝脏右叶有膜下出血。2只鸡在组织病理分级上较高，分别为3和4，其他17/18的鸡感染后没有明显的肉眼观察到的损伤。免疫组的鸡感染后未见到肉眼观察到的损伤。
HEV-ZL株传染性病毒感染鸡肝脏显微损伤包括淋巴细胞静脉炎、淋巴细胞和嗜异性静脉周炎、纤维类蛋白肉芽肿，但轻微，膜下出血，没有观察到大面积肉芽肿或淀粉样湖(amyloid-likeLakes)。
在感染后3天鸡HEV原型株感染的鸡组织损伤平均分值高于HEV-ZL株传染性病毒感染鸡，HEV-ZL株传染性病毒感染鸡组织损伤平均分值高于对照组，但第4天，他们的分值无差异，见表3。总之，肝损伤分值不同组有差异(P＝0.03)，HEV原型株肝损伤(最少卡方均值LSM2.722)大于HEV-ZL株感染组(最少卡方均值LSM2.61)，HEV-ZL株感染组肝损伤大于对照组(最少卡方均值LSM1.877，但肝损伤在发生时间并无显著差异(P＝0.48)。鸡脾损伤分值在各感染的组中不同，P＝0.0006，但损伤发生时间无差异(P＝0.32)。胸腺有轻微外皮增生损伤，不同感染组的损伤分值没有差异(P＝0.27)。免疫组的鸡感染后未见到肉眼观察到的损伤和显微损伤。
2.4抗鸡HEV IgG转化
接种感染HEV病毒前，免疫鸡HEV抗体全部阳性，全部免疫鸡在感染后3天，抗鸡HEV IgG水平显著提升。
在感染后3天，1组鸡HEV原型株感染鸡有100％(12/12)鸡抗HEV IgG，2组HEV-ZL株传染性病毒感染鸡中有75％(12/12)抗HEV IgG显著上升。攻毒感染后3天，1组和2组鸡血清ELISA OD值达到高峰，免疫的1组鸡感染HEV原型株ELISA OD平均值(mean OD±SEM)为6.89±0.21，HEV-ZL株传染性病毒感染组ELISA OD平均值(mean OD±SEM)为8.45±0.26，疫苗免疫1组和疫苗免疫2组的ELISA OD值没有显著差异(P＝0.11)。疫苗1组和对照组3ELISA OD值有显著差异(P＝0.0001)，抗体生成时间也不同(GRP X WPI，P＝0.0001)。疫苗2组和对照4组ELISA OD值有显著差异(P＝0.0001)，抗体生成时间也不同(GRP X WPI，P＝0.0001)。
接种感染HEV病毒前，未免疫鸡HEV抗体阴性，大多数感染的鸡在感染后3天，抗鸡HEV IgG阳转，见表4和表5。
在感染后3天，3组鸡HEV原型株感染鸡有83％(10/12)鸡抗HEV IgG阳转，4组HEV-ZL株传染性病毒感染鸡中有75％(9/12)抗HEV IgG阳转。在感染的4天，3组和4组所有的鸡100％(6/6)阳转，不同感染攻毒3、4组的ELISA OD值有显著差异(P＝0.0001)，抗体生成时间也不同(GRP X WPI，P＝0.0001)。HEV原型株感染组(P＜0.0001)和HEV-ZL株传染性病毒感染组(P＜0.0001)GRP X WPI效果显著，但阴性对照组(P＝0.11)GRP X WPI效果不显著。感染后3天，2组ELISA OD值达到高峰，HEV原型株感染组高于HEV-ZL株传染性病毒感染组，HEV原型株感染组ELISA OD平均值(mean OD±SEM)为0.847±0.081，HEV-ZL株传染性病毒感染组ELISA OD平均值(mean OD±SEM)为0.721±0.1。
2.5RT-PCR检测粪便、血清中鸡HEV RNA
每周采集的血液、粪便拭子采用鸡HEV RNA引物，进行巢式RT-PCR检测，1-2组鸡的血清、粪便任何时间都没有HEV RNA存在。
3组、4组鸡的血清、粪便都有HEV RNA存在，见表5。感染1周后，血清、粪便开始就有HEV RNA检出，感染2周大多数鸡出现病毒血症、粪便排毒。
在HEV原型株感染1周后，有15/18的鸡粪便排毒，感染2周后18/18的鸡粪便全部排毒，感染3周后有8/12的鸡粪便排毒，有1/6鸡感染4周排毒。
HEV-ZL株传染性病毒感染组，有17/18鸡在感染1周粪便排毒，17/18鸡感染2周粪便排毒，7/12的鸡感染3周后粪便排毒，在感染4周有1/6的鸡粪便排毒。
在HEV原型株感染组，感染1周后，11/18鸡血就有HEV RNA检出，感染2周17/18出现HEV RNA，感染3周5/12血清HEV RNA阳性，感染4周有1/6鸡血清HEV RNA检出阳性。
HEV-ZL株传染性病毒感染组，感染1周后，11/18鸡血就有HEV RNA检出，感染2周15/18出现HEV RNA，感染3周3/12血清HEV RNA阳性，感染4周有0/6鸡血清HEV RNA检出阳性。
疫苗免疫组的鸡，在整个试验期间，粪便拭子、血清HEV RNA检出阴性。3-4组不同致病性的鸡HEV感染鸡的粪便、血清的RT-PCR产物测序结果确证了HEV病毒在鸡上致病，恢复过程有不同程度的减毒，说明了HEV-ΔORF2疫苗的安全性、免疫原性以及保护性，保护鸡免受HEV病毒感染、也减少了鸡的HEV病毒血症和粪便排毒。
2.6血液分析
各组6只，总计24只鸡血AST、BA、TP进行了检测，1组免疫组鸡HEV原型株感染鸡攻毒和2组免疫鸡HEV-ZL株传染性病毒感染鸡攻毒后，血液LDH检测值无差异(P＝0.52)，LDH水平时间也无显著差异(P＝0.1)。一组LDH(least square mean(LSM))为1532.21，SEM为68.47，2组LSM为1538.31，SEM为74.39。
3组HEV原型株感染鸡和4组HEV-ZL株传染性病毒感染鸡LDH检测值也无差异(P＝0.21)，但在出现时间有差异(P＝0.001)。HEV原型株感染组和HEV-ZL株传染性病毒感染组血清CPK应答在感染(P＝0.049)和时间(P＝0.043)上显著差异。HEV原型株感染组的平均CPK水平较高(P＜0.0001)，依次高于HEV-ZL株传染性病毒感染组(P＜0.0001)、疫苗1组(P＜0.0001)或疫苗2组(P＜0.0001)。HEV原型株感染3组LSM为1686.15，HEV-ZL株传染性病毒感染4组LSM为1402.66。
说明不同致病性的鸡HEV感染引起LDH的升高，是鸡感染HEV的生化指标，疫苗注射2剂可保护鸡免受鸡HEV的感染，同时说明疫苗不影响鸡的正常生理参数的变化和安全性。
鸡HEV引起鸡肝炎脾肿大综合症，由于标准的鸡HEV的稀少和目前无法细胞培养，采用分离HEV原型株和毒力减弱的鸡传代恢复株进行攻毒。首先对分离的HEV进行传染性滴定。采用商用水包油包水禽用佐剂，乳化成含2.5μg抗原的疫苗，免疫程序2剂、肌肉注射、间隔1月，攻毒时间为免疫后6个月，对免疫组鸡和未免疫鸡感染攻击毒致病性在临床过程、病理损伤方面进行了比较确定。对疫苗的免疫原性、保护效果，包括抗体生成能力，对HEV感染引起病毒血症、粪便排毒、肝脾损伤、以及CPK水平的保护进行分析。
表2HEV原型株传染性滴度(鸡评价攻击毒以及模型建立，攻击毒产生的抗体阳转)
表3HEV-ZL株传染性滴度(鸡评价攻击毒以及模型建立，攻击后粪便排毒和病毒血症)
表4免疫和未免疫鸡攻毒后的肝脾显微损伤分级结果
表5未免疫鸡鸡感染攻毒后粪便HEV RNA、血清HEV-RNA、血清抗体检测(免疫组应在粪便排毒、病毒血症1-2周阴性，抗体在1-2周出现，如感染3-4周情况类似)
实施例7戊型肝炎病毒截断的衣壳蛋白HEV-ΔORF2对犬HEV病毒感染的保护效果
1材料和方法
接种感染材料：感染犬的肝立即-20℃冷冻后，再放置-70℃保存备用。为制备肝接种感染液，用10％PBS(w/v)研磨制成匀浆，移入15mL试管，涡旋震荡1min，4℃、4000×g离心20min，上清转入新试管并用针式滤器过滤(0.22μm GP filter unit，Millipore公司产品)。上清分成多份，每份2.5mL贮存于-70℃，包含2×104HEV RNA拷贝/μL RNA。
犬的巢式PCR产物为RNA复制酶基因261bp片段，与基因库(登记序列KC802090、KC802091、KC802092、KC802093)雪貂、獴序列有98％-100％的同源性，有1非同义突变，异亮氨酸变成缬氨酸，与G3-G4HEV核苷酸同源性分别为76％和69％，与G3-G4HEV氨基酸序列同源性分别为87％和78％。
样品和犬分组：
试验用犬要求：检测证实血清抗anti-HEV阴性，粪便HEV RNA阴性，体温检测正常。隔离饲养。免疫程序，肌肉注射免疫2剂疫苗，每剂含HEV-ΔORF2抗原20μg(按照实施例6的方法制备戊型肝炎病毒样颗粒疫苗)，间隔1月免疫，设立阴性对照(免疫PBS和感染攻击)。免疫1年后进行感染攻击，感染攻击的部位颅侧腔静脉，用量2.0mL，每日观察，分组见表6。2组在感染攻击的时间点0，1，3，5，8，11，14，17，21，24，27，29天测量体重、体温，收集血液样本、粪便样本。连续2天体温≥40.0℃为发烧，所有血清样本保存在-20℃以备抗体和生化检测，粪便样本稀释到PBS中，保存-70℃以备RNA提取。尸检收集组织样本(肝、肝淋巴结、肠系膜和下颌淋巴结、胆汁、膀胱、大肠、小肠、胰腺、肾、脾、扁桃体、心脏、脑、生殖腺、子宫或前列腺、股四方肌)用于病毒学、组织病理和免疫组化学分析研究，其中一部分器官组织用4％中性福尔马林溶液固定，一部分贮存于-70℃以备提取RNA。
1.1临床化学分析
用自动分析仪(VetScan，美国Abaxis公司产品)，紫外分光光度法分析血清样本(longitudinally)，使用特殊转子(VetScan Mammalian Liver Profile reagent rotor，Abaxis)定量检测血清中丙氨酸转氨酶(Alanine aminotransferase，ALT)、白蛋白(Albumin，ALB)、碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase，ALP)，胆酸(Bile acids，BA)，总胆汁红素(Total bilirubin，TBIL)、总胆固醇(Total cholesterol，CHOL)、伽玛谷氨酰转移酶(Gamma-glutamyl transferase(γGT))、血液尿素氮(Blood urea nitrogen，BUN)，计算生化参数的高位参考值范围和阴性对照的值。
1.2抗体和RNA检测
制备的重组HEV-ΔORF2蛋白包被ELISA法检测血清或血浆的抗体，OD450nm值等于或大于1为阳性。
1.3血清和粪便悬液提取病毒RNA的方法
血清RNA采用 Viral RNA Mini Kit(德国QIAGEN GmbH公司产品)，按厂家提供推荐说明书进行。所有组织中的病毒RNA提取用RNeasy Mini Kit(德国QIAGEN GmbH公司产品)，采用这2种方法，都设立内部控制用RNA(IC2)。HEV RNA用定量实时PCR检测(RT-qPCR)，所使仪器CFX96TM实时系统(德国Bio-Rad Laboratories产品)。引物和探针见表7，用的定量探针RT-PCR试剂盒(QIAGEN GmbH公司产品)进行RT-qPC，反应体系25μL，引物最终浓度0.8μM、探针最终浓度0.1μM，加入5μL提取的RNA。逆转录反应的条件50℃反应30min后，95℃变性15min，进入45次循环扩增，每次循环：95℃(10s)、55℃(25s)、72℃(25s)。按照含81bp的RT-qPCR扩增子作为校准品绘制的标准曲线确定HEV拷贝数。
1.4组织病理和免疫组化
福尔马林固定的组织样本按标准操作程序用苏木精-伊红(HE)染色，用于免疫组化的观察样本切成3μm切片、脱蜡、吸水。预处理步骤包括3％H2O2/甲醇溶液封闭内在的过氧化物酶30分钟，微波炉600W功率下10分钟抗原抗原补救。1∶200稀释兔抗人CD3多克隆抗体结合犬CD3抗原，检测肝脏的炎症反应；病毒抗原兔抗HEV超免血清的亲和层析纯化的多克隆抗体(HEV-ΔORF2，gt3)1∶1000稀释，该抗体的制备和纯化见实施例5。切片和生物素结合羊抗兔IgG孵育(购自德国Vector Laboratorie)，加入亲和素/生物素酶复合体( ABC试剂，购自德国Vector Laboratories)，再加入3，3-二氨基联苯胺(DAB)底物(购自美国Sigma-Aldrich公司)观察，病毒抗原浓度分级如：0表示没有观察到抗原染色；+表示轻微免疫标记，小于20％的细胞抗原阳性；++表示中度免疫标记，20-40％细胞抗原阳性；+++表示明显免疫标记，大于40％细胞抗原阳性，每一切片分2次独立操作观察。
2戊型肝炎病毒感染犬和病理观察结果
2.1临床生化参数
静脉注射感染的家犬体温没有显著上升，有2头只是出现轻微抑郁、轻微腹泻、轻微厌食的临床症状，有一头血清BA和γGT在静脉注射感染后21天出现上升，但在感染后25天，血清中ALT和γGT隔天后恢复正常。所有免疫的家犬静脉注射感染没有发热和其他临床症状，BA一直保持正常水平，有2头在攻毒感染后29天γGT水平上升，其中一头家犬ALT水平上升。表8说明免疫家犬和阴性对照家犬血清中BA、ALT和γGT水平随时间变化的规律，其他生化指标或参数保持正常。
2.2血清学和HEV RNA检测结果
2/4的PBS阴性对照家犬在感染后17天抗HEV-IgG阳转，其他1/6的阴性对照家犬试验的期间抗HEV-IgG一直阴性。阴性对照家犬的3/6在感染后14天HEV-IgG抗体检出阳性，1/6头犬在感染后13天出现HEV-IgG抗体，见表9。
阴性对照家犬中2/6头犬在感染后28天、21天，血清的HEV RNA大于10拷贝/μL。在感染后3-5天，有3/6头犬粪便中HEV RNA大于105拷贝/μL。抗体阳转的2/6家犬在试验的28天内，HEV拷贝数始终保持高水平，直到28天后稍微下降。抗体阳转2/6家犬粪便中HEV排毒显著减少，小于＜101拷贝s/μL RNA。
阴性对照组所有感染家犬的肝、胆囊、盲肠、结肠、脾中有HEV RNA检测阳性。有1/6头在脑、肌肉、子宫中检测到＞20拷贝/μL RNA，明显阳性。家犬中的粪便排毒和血清中RNA拷贝数与家犬相当，但在抗体阳转的的2家犬，在感染的14天，粪便的HEV排毒明显减少。大多感染家犬的肝、胆囊、盲肠、结肠、脾中有HEV RNA检测阳性，感染1天后1/6头肝中检出有大量的RNA拷贝数，血清和粪便中HEV RNA检测结果见表9。表10为所选组织样本的病毒载量结果，在4/12的家犬、家犬的胆汁中有HEV RNA。
免疫组所有家犬抗HEV IgG抗体在2-3天内显著上升，观察期间维持在较高水平，血清和粪便的HEV RNA始终阴性，说明疫苗激发犬高水平的抗体和其他未检测的免疫保护反应，至少维持3月，在感染攻毒后抗体生成显著增强，在1周内达到高峰，减少HEV病毒感染和病毒血症、粪便排毒。说明犬HEV疫苗在犬的保护效果至少3个月。
2.3病理学结果
在所有犬中，免疫组和阴性对照组犬肝中没有大的特异病毒性肝炎的变化，但未免疫的感染犬一些家犬的大肠淋巴组织有轻度到中度的滤泡增生的宏观特征，肝淋巴结有滤泡增生的宏观特征。尸检显示肠中有中度线虫感染和多灶白点(牛奶状点)，慢性肝炎在肝中的特征。所有未免疫感染的犬的肝观察，内部肝叶的病毒抗原分布不同，引起不同大小、形态、次数的损伤，但免疫组的犬并未发现有肝内部肝叶的损伤。
所有未免疫阴性组感染的犬中，发现肝中有轻度到中度外周淋巴质溶解侵润(Periportal lymphoplasmacytic Infiltrates)和库弗氏细胞增生(Kupffer cell proliferations)，但在门静脉周围无抗原检测到。免疫组化观察，在肝叶中主要在库弗氏细胞和肝窦表皮细胞、甚至肝细胞发现有HEV病毒抗原，部分肝损伤和CD3阳性细胞侵润与.库弗氏细胞和肝窦表皮细胞的HEV抗原相关。具体感染病毒家犬的与免疫家犬比较更显异质性，有2/6的家犬的肝显示有多灶肝细胞肿大和空泡样、病毒抗原分布扩散为特征的轻度到中度的多灶叶内淋巴组织溶解侵润，其他2/6的家犬发生了中间肝叶因为淋巴细胞、桨细胞、库弗氏细胞侵润相关的肝细胞死亡，这些损伤显然与明显标记HEV病毒抗原相关。
未免疫注射感染HEV的犬显示有肝内叶肝细胞单个肉芽为特征淋巴间质溶解侵润的中度扩散和小量到中量的病毒抗原扩散。在一些感染的犬的不同淋巴结和被膜层发现HEV抗原，其他犬的没有发现。犬的病理损伤、组织病理、组化检测见表6。
表6免疫、对照组犬试验一览(安全性)
病毒抗原浓度分级如：0表示没有观察到抗原染色；+表示轻微免疫标记，小于20％的细胞抗原阳性；++表示中度免疫标记，20-40％细胞抗原阳性；+++表示明显免疫标记，大于40％细胞抗原阳性。
表7检测犬HEV RNA的引物(1部分和猪3和猪4HEV相同)
表8免疫组犬和感染攻击犬的生化参数检测结果
实施例8戊型肝炎病毒疫苗在猪上的交叉保护效果
1材料和方法
1.1HEV病毒
HEV传染性病毒，基因III型猪HEV，通过猪粪便感染细胞，再经感染猪收集粪便获得，滴度104.550％猪感染剂量(PID50)，人基因III型HEV美国株、人基因IV型中国株，来自美国NIH，粪便用PBS稀释成10％悬液，使含3.4×108基因等量滴度/mL(Genomic equivalent titer，GE)，在猪上静脉注射有传染性。
1.2试验方法
抗HEV IgG抗体阴性，健康，5周龄48头猪，随机分成8组，每组6头，在BSL-2的试验房中单独饲养，严格按生物安全条例进行喂食和饲养。
疫苗分别含10、50、100μg HEV截断的ORF2VLP(病毒样颗粒)抗原/mL，用水包油包水佐剂乳化配制(按照实施例6的方法制备戊型肝炎病毒样颗粒疫苗)。阴性对照组只免疫3个剂量疫苗和PBS，攻击用PBS或不攻击。在猪颈侧面注射免疫，第一剂1mL疫苗，肌肉注射免疫，1月后进行第二剂注射免疫。全程免疫完成12月后，第一组用PBS和疫苗组程序一样，免疫二次，用PBS攻击，第二组用PBS免疫二次，用猪HEV3攻击，都为阴性对照组，第三组、第四组、第五组分别免疫三个不同剂量的疫苗，分别静脉注射104.5PID50的基因III型猪HEV；第六到第八组全程免疫1mL含50μgHEV截断的ORF2VLP抗原的疫苗，第六组静脉注射3.4×108GE滴度的基因III型人HEV(美国株)，第七组静脉注射3.4×108GE滴度基因IV型人HEV(中国株)，第八组静脉注射104.5PID50的基因IV型猪HEV。
攻击后4周所有猪进行肝损失病毒观察。淋巴间质溶解分值评估，0代表无炎症；1代表10个肝叶有1-2个淋巴细胞溶解侵润；1代表10个肝叶有1-2个淋巴细胞溶解侵润；2代表10个肝叶有3-5个淋巴细胞溶解侵润；3代表10个肝叶有6-10个淋巴细胞溶解侵润；4或大于10代表10个肝叶有10个以上淋巴细胞溶解侵润。
免疫前后、攻毒前后每周收集粪便、血液样本用巢式RT-PCR检测HEV-RNA，用ELISA测定抗HEV-IgG。
1.2.1样品收集
免疫前每周收集血清和粪便拭子，免疫后每周收集血清用ELISA法检测IgG anti-HEV，攻毒后每周取血和粪便拭子用巢式RT-PCR检测HEV RNA。尸检后收集肝、胆汁、小肠内含物，胆汁和10％的小肠悬液检测HEV RNA，肝进行病理观察并按分级打分。
1.2.2RT-PCR检测HEV RNA
各基因型HEV的引物见表11，这里仅为基因III型HEV，其他型别的检测的RT-PCR方法相同，就是引物不同。
基因III型HEV特异巢式PCR，100μL10％粪便悬液或血清用TriZol试剂(Life Technologies)提取，重悬于30μL无菌水中，反应体系加入1μL(10μM)外部逆转录引物HEVORF1-REV1，1μL(200units/μl)Superscript II逆转录酶(生命公司购买)，1μL的0.1M DTT、4μL的5×RT缓冲液，0.5μL(40units/μl)RNasin核酸酶抑制剂(Promega)，1μL的10mM dNTP 42℃1h进行逆转录反应。
第一轮PCR反应，用引物HEVORF1-FWD1和引物HEVORF1-REV1扩增471bp产物，第二次用巢式PCR，正向引物HEVORF1-FWD2和反向引物HEVORF1-REV2，5μL AmpliTaq Gold DNA聚合酶(AB公司购买)、5μL第一轮PCR产物扩增277bp片段，见表11。循环参数包括95℃变性9min后，进行39个循环：94℃变性1min，52℃退火1min，72℃延伸1min，39次循环完成后最后72℃延伸7min。PCR产物采用1％琼脂糖胶电泳观察分析。
1.2.3酶联免疫吸附(ELISA)检测抗HEV IgG
猪血清用包被的纯化HEV-ΔORF2包被、亲和层析HEV-ΔORF2多克隆抗体为第一抗体，具体方法参见实施例5，ELISA的阈值为所有动物免疫前血清平均OD±3标准误SD，所有血清按1∶100稀释复孔检测。
1.2.4统计学分析
组织病理分值见表12，用不对称的t-test(Excel，微软公司软件)统计分析。P小于0.05为显著差异。
2试验结果
2.1组织病理学结果
猪肌肉注射不同剂量10、50、100μgHEV-ΔORF2诱导了强烈的IgG anti-HEV反应，抗原特异的ELISA检测结果表明在各个剂量组的抗体水平无明显差异，表明HEV-ΔORF2在10-100μg剂量可在猪上诱导抗体反应，疫苗剂量含抗原10-100μg，最低含HEV-ΔORF2抗原10μg，最高含HEV-ΔORF2抗原100μg。
免疫期间，各猪每周的血样用ELISA检测，免疫第一剂后1月，第一组和第二组猪中，有12/12头猪抗HEV-IgG阴性，第三组猪中有3/6头猪HEV-IgG阳转，第四组有5/6猪抗HEV-IgG阳转，第五组中有4/6头猪抗HEV-IgG阳转，第六组猪中有4/6抗体阳转，第七组猪全部抗HEV-IgG阳转，第八组猪4/6抗HEV-IgG阳转，疫苗第一剂刺激猪体产生了抗HEV-IgG，阳转率为72.2.％。第二剂疫苗完成后1周，所有免疫的猪抗HEV-IgG全部阳转，除第一对照组。表明疫苗2剂注射，间隔1月，肌肉注射的免疫程序可诱导猪产生HEV-IgG抗体。
所有免疫猪体温和增重和对照组比较无显著差异，证实疫苗安全。
攻毒4周后尸检，各组样本猪肝切片进行淋巴胞质肝炎(Lymphoplasmacytic Hepatitis)病理观察，见表12，未免疫猪攻击的症状分值较高，猪基因III型病毒感染攻击产生亚临床轻微症状，表明疫苗有效降低猪基因III型HEV引起的肝损伤的损伤，也表明对猪HEV、人HEV的肝损失产生保护。
2.2RT-PCR检测血清和粪便中的HEV RNA
攻毒后用HEV ORF1的引物进行巢式RT-PCR检测HEV RNA，不同基因型HEV阳性血清、阴性血清、阳性粪便10％悬液、阴性粪便10％悬液都同步和样本进行逆转录和巢式PCR反应以避免操作误差。结果见表13。
第二组猪用基因3型HEV攻毒，感染期的1-3周共有6/6的猪发生了病毒血症，第一周2/6头，感染2周后4/6的猪发生病毒血症，感染3周6/6的猪血清RNA检出阳性。
感染1周，第三组有1/6头检测发现有病毒血症，第四组1/6猪血清中有HEVRNA检出，第五组有0/6无病毒血症攻毒后，第六组有1/6猪有病毒血症，第七组有1/6的猪有病毒血症，第八组没有病毒血症。感染攻击2周后，所有免疫攻击组血清HEVRNA检测阴性。表明疫苗减少或缩短猪HEV的病毒血症，保护猪免受HEV感染。
第二组在试验的2-4周都排毒，持续2-3周。攻毒后一周，第三组所有猪粪便有1/6HEV RNA检出，第四组有0/6的猪粪便检出HEV RNA检出，第五组有0/6猪粪便检出HEV RNA，第六组有1/6猪粪便HEV RNA阳性，第七组有1/6猪粪便HEV RNA检出，第八组有1/6猪粪便HEV RNA检出阳性，攻毒后二周，第三组猪粪便全部HEVRNA阴性，第四组有0/6的猪粪便检出HEV RNA检出阳性，第五组有1/6猪粪便检出HEV RNA，第七组有0/6猪粪便HEV RNA性，第八组有0/6猪粪便HEV RNA检出。感染攻击3周后除对照组猪，全部免疫猪粪便并无HEV-RNA检出。对照组猪感染3月后粪便有1/6HEVRNA检出阳性。
表11巢式RT-PCR检测HEV病毒的引物
表12不同动物源性的HEV攻毒后肝组织损伤分值
*和阴性对照组比较P＜0.05，显著差异。
表13RT-PCR检测免疫猪不同HEV攻毒后的病毒血症和粪便病毒排放