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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810382567.8 (22)申请日 2018.04.26 (71)申请人 高常青 地址 410013 湖南省长沙市岳麓区桐梓坡 路172号 (72)发明人 高常青 王梅梅 李晶晶 乔娇娇 王姗妮 (74)专利代理机构 长沙星耀专利事务所(普通 合伙) 43205 代理人 宁冈 宁星耀 (51)Int.Cl. A61K 38/14(2006.01) A61K 38/19(2006.01) (54)发明名称 一种肺纤维化动物模型的构建方法 (57)摘要 一种肺纤维化动物模型。
2、的构建方法， 利用引 起能肺纤维化的化学或生物制剂和趋化因子联 合给药的模式构建肺纤维化动物模型。 本发明方 法所构建的肺纤维化动物模型具有明显的纤维 化病灶， 与人类肺纤维化病理学特征与临床真实 情况高度相似， 造模效果明显， 病变分布均匀， 结 果稳定， 死亡率低， 能对不同病程的肺纤维化疾 病进行临床模拟。 本发明肺纤维化动物模型的构 建方法应用于肺纤维化疾病的病因学、 病理学和 药理学研究。 权利要求书1页 说明书5页 附图1页 CN 108524912 A 2018.09.14 CN 108524912 A 1.一种肺纤维化动物模型的构建方法， 其特征在于， 利用能引起能肺纤维化的化。
3、学或 生物制剂和趋化因子联合给药的模式构建肺纤维化动物模型。 2.根据权利要求1所述肺纤维化动物模型的构建方法， 其特征在于， 所述联合给药的模 式中的能引起肺纤维化的生物制剂为博来霉素。 3.根据权利要求1或2所述肺纤维化动物模型的构建方法， 其特征在于， 所述联合给药 的模式中的趋化因子为引导纤维母细胞进行迁移的细胞受体所对应的配体。 4.根据权利要求13之一所述肺纤维化动物模型的构建方法， 其特征在于， 所述趋化 因子包括CXCR4受体的配体CXCL 12和CCR7受体的配体CCL19或CCL21。 5.根据权利要求14之一所述肺纤维化动物模型的构建方法， 其特征在于， 所述动物 模型所。
4、用的实验动物包括啮齿类、 兔、 犬类、 猪类、 羊类或猴类。 6.根据权利要求15之一所述肺纤维化动物模型的构建方法， 其特征在于， 所述啮齿 类包括小鼠、 大鼠、 仓鼠或豚鼠。 7.根据权利要求16之一所述肺纤维化动物模型的构建方法， 其特征在于， 所述联合 给药的模式的给药频率为： 博来霉素每2周给药12次， 连续410周； 趋化因子每天13 次， 停止给药博来霉素13周后停止给药趋化因子。 8.根据权利要求17之一所述肺纤维化动物模型的构建方法， 其特征在于， 所述联合 给药的模式的给药剂量为： 按小鼠体重28 mg/kg或0.12.0 U/kg 给药博来霉素； 按小 鼠体重0.11.0。
5、 mg/kg 给药趋化因子CXCL 12或CCL19或CCL21。 9.根据权利要求18之一所述肺纤维化动物模型的构建方法， 其特征在于， 所述联合 给药的模式的给药途径为气管灌注、 静脉注射或腹腔注射。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 108524912 A 2 一种肺纤维化动物模型的构建方法 技术领域 0001 本发明涉及医学实验领域， 具体涉及一种纤维化动物模型的构建方法， 尤其是涉 及一种肺纤维化纤维化动物模型的构建方法。 背景技术 0002 肺纤维化 （IPF） 是一种原因不明、 以弥漫性肺泡炎和肺泡结构紊乱， 并最终导致肺 间质纤维化为特征的疾病， 其病理组织学特点是普通。
6、型间质性肺炎 （UIP） ， 即上皮细胞增 生、 基底膜裸露、 肺泡实变、 出现成纤维细胞灶等。 目前， 临床上缺乏有效的治疗手段， 特发 性肺纤维化的发病率、 死亡率不断上升， 且随着年龄的增长， 其发病率和死亡率也逐渐升 高， 发病后5年存活率仅20%。 动物模型是研究疾病的重要手段， 理想的动物模型可以模拟呈 现疾病的各种特征， 对研究疾病的发病机制及筛选有效的治疗方案起关键作用， 但目前肺 纤维化动物模型尚有各种局限性。 常用的肺纤维化动物模型有药物、 毒物诱导模型和转基 因模型。 虽然转基因模型发展迅速， 但是转基因模型并不能模拟环境因素导致的纤维化。 0003 博来霉素 （BLM）。
7、 是一种具有抗肿瘤作用的多组分复合抗生素， 其毒副作用之一是 引起肺纤维化， 由于其病理组织学改变与人类肺纤维化较为接近， 故被广泛用于诱导构建 肺纤维化模型。 利用BLM进行模型制备的途径包括气管给药， 经鼻给药， 静脉注射， 腹腔注射 等， 其中经气管给药已是国内外公认的成熟方法。 但是用BLM诱导构建的动物肺纤维化模型 来推导人类肺纤维化， 或者是研究BLM对人类肺的毒性， 都有明显的不足， 不能满足临床医 学的病理研究需求。 0004 首先， 单一给药构建的肺纤维化动物模型在疾病发生发展的时间和空间上不同于 人类疾病的发生发展过程。 人类器官组织纤维化疾病大多为长时间反复多次对人体组织。
8、如 肺泡上皮细胞损伤， 导致不可完全修复的结果。 即使是单一药物多次给药模型， 与人类肺纤 维化发病的时间相比， 仍然太短。 0005 其次， 单一给药构建的肺纤维化动物模型的病理学特征与临床真实情况相差甚 远。 肺纤维化单一给药模型常有明显的中性粒细胞浸润， 而IPF病人中性粒细胞浸润不明 显； 型上皮细胞增生不明显， 但在IPF病人中明显； 肺纤维化模型的肺部组织纤维化不稳 定， 在6周后常消退， 基本上没有成纤维细胞灶， 而在IPF病人肺部组织纤维化长期存在， 且 成纤维细胞灶十分明显。 0006 因此， 单一给药构建的肺纤维化动物模型与人类肺纤维化相比在病理特征方面仍 存在巨大缺陷。 。
9、0007 CN106214280A公开了一种微创制作肺纤维化动物模型的方法。 具体步骤包括： 动 物麻醉， 气管插管， 药物灌注。 动物麻醉后以斜侧卧位保定， 用气管插管装置从口腔经声门 插入动物单侧肺并灌注药物。 根据动物肺、 气管和支气管的解剖结构以及气管给药时气管 插管装置停留在一侧肺的深度和位置， 药物可大多均匀分布在一侧肺中， 也可集中在一侧 肺的某个肺叶中。 此造模方法病理机制单纯， 模型中的成纤维细胞灶并不明显， 该方法与人 类发病的时间相比， 仍然太短， 说 明 书 1/5 页 3 CN 108524912 A 3 CN107006422A公开了一种吸烟引起树鼩多器官纤维化模型。
10、的建立方法。 该方法是将野 生树鼩驯化三个月后， 在不通风的房间内， 让树鼩在自然呼吸状态下吸收香烟烟雾， 每天两 次， 每次30分钟， 每周6天， 暴露时间为9个月； 所述香烟烟雾是燃烧100g烟叶产生的烟雾； 用 Masson染色评价树鼩吸烟引起多器官肺纤维化动物模型。 该方法操作繁琐， 且易造成模型 动物死亡。 发明内容 0008 本发明所要解决的技术问题是， 克服现有技术存在的上述缺陷， 提供一种造模效 果明显， 病变分布均匀， 结果稳定， 死亡率低， 构建的肺纤维化动物模型具有明显的纤维化 病灶， 与人类肺纤维化病理学特征与临床真实情况高度相似， 能对不同病程的肺纤维化疾 病进行临床。
11、模拟的肺纤维化动物模型的构建方法。 0009 本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下： 一种肺纤维化动物模型的构建方 法， 利用能引起肺纤维化的化学或生物制剂和趋化因子联合给药的模式构建肺纤维化动物 模型。 0010 进一步， 所述能引起肺纤维化的生物制剂为博来霉素。 0011 进一步， 所述联合给药的模式， 趋化因子为引导纤维母细胞进行迁移的细胞受体 所对应的配体。 0012 进一步， 所述趋化因子包括CXCR4受体的配体CXCL 12和CCR7受体的配体CCL19或 CCL21。 0013 进一步， 所述动物模型所用的实验动物包括啮齿类、 兔、 犬类、 猪类、 羊类或猴类。 0014 进。
12、一步， 所述啮齿类包括小鼠、 大鼠、 仓鼠或豚鼠。 0015 进一步， 所述联合给药的模式的给药频率为： 博来霉素每2周给药12次， 连续4 10周； 趋化因子每天13次， 停止给药博来霉素13周后停止给药趋化因子。 0016 进一步， 所述博来霉素和趋化因子联合给药的模式的给药剂量为： 按小鼠体重2 8 mg/kg或0.12.0 U/kg 给药博来霉素； 按小鼠体重0.11.0 mg/kg给药趋化因子CXCL 12或CCL19或CCL21。 0017 进一步， 所述联合给药的模式的给药途径为医学实验动物学允许给药途径， 例如 气管灌注、 静脉注射和腹腔注射等。 0018 优选地， 所述肺纤维。
13、化动物模型的构建方法的给药方式为气管灌注。 0019 趋化因子(Chemokine)一般由70125个氨基酸组成， 分子量较小 （614KD） 。 按照 一级肽链结构特点， 其N端半胱氨酸残基的位置和数目可将趋化因子分为4个亚族： CC、 CXC、 C 和CX3C （C为半胱氨酸， X 为任意氨基酸） 。 根据趋化因子的表达方式以及其在免疫系统中 的作用， 可分为两类： 内环境稳定性趋化因子和炎症性趋化因子。 内环境稳定性趋化因子主 要在归巢场所表达， 有着维持内环境稳态的功能， 并且对淋巴细胞归巢及成熟有着明确的 作用。 炎症性趋化因子由受到刺激的细胞表达， 如炎性细胞因子的诱导、 细菌毒素。
14、或其它破 坏内环境稳定的因素的刺激， 主要功能是募集效应细胞， 在协调天然和获得性免疫反应中 起重要作用。 趋化因子要发挥生物学作用， 必须与相应的受体结合才行。 趋化因子CXCL12为 基质细胞衍生因子1(SDF-1)， 其受体是CXCR4， 能够吸引外周血液中表达CXCL4的纤维细 胞。 趋化因子CXCL12具有明显的促进纤维细胞迁移运动作用， 尤其是加速外周血液中纤维 说 明 书 2/5 页 4 CN 108524912 A 4 细胞向病损处聚集， 促进纤维灶的形成。 利用博来霉素诱导的小鼠肺内CXCL12的浓度明显 高于外周血液中的浓度， 从而促使周围血液中表达CXCL4的纤维细胞， 。
15、即表面标记为CD45+ ColI+CXCR4+细胞， 向肺内损伤处聚集。 在动物 （包括人） 的体内还存在另一种细胞， 即CD45+ ColI+CCR7+细胞， 它们的功能与CD45+ColI+CXCR4+细胞极为相似。 其配体是趋化因子CXCL19 或趋化因子CXCL21。 实验证明， 趋化因子CXCL19或趋化因子CXCL21能够促进CD45+ColI+CCR7 +细胞向肺内聚集。 本发明方法构建的肺纤维化动物模型经气管灌注博来霉素的同时联合 给予趋化因子CXCL 12或CCL19或CCL21， 造成肺部损失的同时会加速外周血液中纤维细胞 向损伤处聚集， 促进纤维灶的形成， 不易引起模型动。
16、物在造模过程中途死亡。 0020 本发明的有益效果： （1） 本发明方法构建的肺纤维化动物模型具有明显纤维化病灶， 病变分布均匀， 结果稳 定， 死亡率低， 在病理学特征上与人类肺纤维化的临床真实情况高度相似的肺纤维动物模 型， 在时间上与人类发病进程更接近， 能对不同病程的肺纤维化疾病进行临床模拟。 0021 （2） 本发明方法通过博来霉素和趋化因子联合给药的模式， 不仅保留了机体外来 因素对肺组织的反复损伤作用， 造成肺泡上皮细胞转化成纤维细胞， 还创造性利用CXCR4受 体的配体CXCL 12和CCR7受体的配体CXCL19或CXCL21引导血液中的纤维母细胞向肺部损伤 处聚集， 促进肺。
17、部组织纤维化程度， 与临床IPF病人发病机理一致， 从分子水平高度模仿人 体纤维化病变过程。 附图说明 0022 图1是本发明实施例1博来霉素和趋化因子CXCR4受体的配体CXCL 12联合给药的 模式构建肺纤维化动物模型的肺切片Masson染色 （ 200） 显微镜镜下的光镜图。 0023 图2是本发明实施例2博来霉素和趋化因子CCR7受体的配体CXCL19联合给药的模 式构建肺纤维化动物模型的肺切片Masson染色 （ 200） 显微镜镜下的光镜图。 0024 图3是对比例1单一给药等体积博来霉素构建肺纤维化动物模型的肺切片Masson 染色 （ 200） 显微镜镜下的光镜图。 0025 。
18、图4是对比例2单一给药等体积生理盐水构建肺纤维化动物模型的肺切片Masson 染色 （ 200） 显微镜镜下的光镜图。 具体实施方式 0026 下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明。 0027 本发明实施例中所使用的趋化因子CXCR4受体的配体CXCL12、 CCR7受体的配体 CCL19购自Sigma-Aldrich (USA)； 注射用盐酸博来霉素 （BLM） 购自日本化药株式会社； Masson三色试剂盒购于上海锐赛生物技术有限公司 （上海浦东） 。 0028 实施例1 利用博来霉素和趋化因子CXCR4的配体CXCL 12联合给药的模式构建肺纤维化动物模 型： 给药频率： 博来霉素每。
19、2周给药一次， 连续8周； CXCL12每天给药一次； 停止给药博来霉 素1周后再停止给药CXCL12。 0029 给药剂量： 按小鼠体重2 mg/kg或0.1 U/kg 给药博来霉素； 按小鼠体重0.1 mg/kg 说 明 书 3/5 页 5 CN 108524912 A 5 给药趋化因子CXCL 12。 0030 给药途径： 气管灌注。 0031 实施例2 利用博来霉素和趋化因子CCR7受体的配体CXCL 19联合给药的模式构建肺纤维化动物 模型： 给药频率： 博来霉素每2周给药两次， 连续8周； CXCL19每天给药一次； 停止给药博来霉 素1周后再停止给药CXCL19。 0032 给药。
20、剂量： 按小鼠体重4 mg/kg或0.4 U/kg 给药博来霉素； 按小鼠体重0.4mg/kg 给药趋化因子CXCL 19。 0033 给药途径： 尾静脉注射。 0034 实施例1和实施例2的造模效果评价： 采用随机对照动物实验对本发明实施例1和实施例2进行肺纤维化动物模型病理切片 鉴定评价造模效果。 0035 本发明实施例中所述随机对照动物实验于2017年3月至2018年3月在湖南省中南 大学实验动物学部动物实验室完成。 0036 所述随机对照动物实验中的实验动物： 雄性SPF级C57BL/6小鼠200只， 购入时鼠龄 为35周， 体重为1620 g， 由中南大学实验动物学部动物实验中心提供。
21、， 小鼠饲养于SPF 动物房中， 给予SPF级饲料、 高压灭菌水喂养， 垫料经高温消毒灭菌， 动物房室温2224， 湿度40%70%， 日照和黑夜12 h交替。 0037 所述随机对照动物实验中的实验分组： 小鼠适应性喂养1周后进行实验。 200只小 鼠随机等分为四组， 即实施例1、 实施例2、 对比例1、 对比例2。 完成给药后分别随机选取实施 例1、 实施例2、 对比例1、 对比例2中10只小鼠， 颈椎脱臼处死动物， 然后取左肺放入10% （v/v） 甲醛溶液中固定， 经脱水、 包埋、 切片， 进行Masson染色。 染色后的肺切片病理鉴定见图1 4。 0038 图1为实施例1 （博来霉素。
22、和趋化因子CXCR4的配体CXCL 12联合给药） 构建的肺纤 维化动物模型的肺切片Masson染色 （ 200） 显微镜镜下的光镜图。 可见肺部组织出现大规 模的实变， 实变区肺泡壁增厚， 间隔断裂， 融合形成肺大泡， 存在大量成团纤维化病灶和散 在炎症细胞浸润， 肺泡间隔增厚和血管周围胶原蛋白沉积。 0039 图2为实施例2 （博来霉素和趋化因子CCR7受体的配体CXCL 19联合给药） 构建的肺 纤维化动物模型的肺切片， 可见肺泡间隔大量胶原蛋白沉积， 胶原沉积部位主要位于胸膜 下或血管周围肺间质， 呈点灶样、 团片样分布， 与周围正常的肺组织或病变较轻的肺组织相 邻 （空间异质性） ；。
23、 与对比例1相比， 纤维化斑片阴影面积明显增加。 0040 图3为对比例1 （单一给予与实施例1等体积的博来霉素） ， 可见肺部组织出现不同 程度的实变， 实变区肺泡壁增厚， 间隔断裂， 融合形成肺大泡， 间质有较多的炎症， 细胞浸润 和纤维样组织形成， 存在单个成团纤维化病灶和散在炎症细胞浸润。 0041 图4为对比例2 （单一给药与实施例1等体积的生理盐水） ， 可见肺泡形态正常， 肺泡 壁纤细， 间质中有极少量的炎症细胞浸润。 0042 综上所述， 本发明方法利用博来霉素多次给药和CXCL12 或博来霉素多次给药和 CCL19的模式构建的动物模型相比于单一给药博来霉素的小鼠肺组织纤维化程度更高， 效 说 明 书 4/5 页 6 CN 108524912 A 6 果更好， 且小鼠未出现死亡。 说 明 书 5/5 页 7 CN 108524912 A 7 图1 图2 图3 图4 说 明 书 附 图 1/1 页 8 CN 108524912 A 8 。