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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810650087.5 (22)申请日 2018.06.22 (71)申请人 南京市儿童医院 地址 210005 江苏省南京市广州路72号 (72)发明人 张爱华 吴梦秋 贾占军 张玥 陈维宜 麻昊阳 (74)专利代理机构 南京苏创专利代理事务所 (普通合伙) 32273 代理人 蒋真 (51)Int.Cl. A61K 31/352(2006.01) A61P 13/12(2006.01) A61P 3/10(2006.01) (54)发明名称 鱼藤酮在制备糖尿病肾病药物中。
2、的应用 (57)摘要 本发明的目的是提供鱼藤酮在制备糖尿病 肾病药物中的应用， 从而为糖尿病肾病治疗提供 一种新的候选化合物。 实验结果显示， 所选剂量 下鱼藤酮无肝脏、 肾脏及心脏毒性； 且能显著改 善糖尿病肾病模型小鼠的多尿症状、 逆转STZ导 致的小鼠的肾重增加、 肾小球肥大、 肾功能受损、 尿微量白蛋白增加、 肾脏代谢异常和肾纤维化。 权利要求书1页 说明书7页 附图3页 CN 108524492 A 2018.09.14 CN 108524492 A 1.鱼藤酮在制备糖尿病肾病药物中的应用。 2.鱼藤酮在制备降低糖尿病患者的肾损伤药物中的应用。 3.鱼藤酮在制备降低糖尿病患者的肾纤维。
3、化药物中的应用。 4.鱼藤酮在制备糖尿病肾病药物组合物中的应用。 5.鱼藤酮在制备改善糖尿病肾病患者的多尿症状的药物中的应用。 6.鱼藤酮在制备改善糖尿病肾病患者的肾重增加的药物中的应用。 7.鱼藤酮在制备改善糖尿病肾病患者的肾小球肥大的药物中的应用。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 108524492 A 2 鱼藤酮在制备糖尿病肾病药物中的应用 技术领域 0001 本发明涉及鱼藤酮在制备药物中的应用， 具体涉及鱼藤酮在制备糖尿病肾病药物 中的应用。 技术背景 0002 随着社会经济的发展和人们生活方式的改变， 糖尿病发病率逐年攀升， 据报道， 2008年中国有9200万糖尿病患者，。
4、 2013年达到1.14亿， 处于糖尿病前期的患者更是高达1.5 亿， 而血糖不正常的人有2.64亿。 糖尿病肾病(Diabetic Nephropathy， DN)是糖尿病病人微 血管的并发症之一， 目前已成为导致终末期肾脏病的第二因素。 0003 临床常见的继发性肾脏病包括急性肾损伤和慢性肾脏病。 急性肾损伤为药物、 毒 物或肾脏组织缺血等引起的急性肾小管损伤； 而慢性肾脏病则由各种原因引起的慢性肾脏 结构和功能障碍， 以肾小管间质纤维化等为主要特点。 糖尿病肾病为慢性肾脏病的一种， 但 其发病机制与其他慢性继发性肾脏病不同， 治疗手段亦存在差别。 糖尿病肾病一旦发展到 终末期肾脏病， 往。
5、往比其他肾脏疾病的治疗更加棘手， 因此寻找糖尿病肾病的治疗靶点与 有效的防治方法一直是医学领域的研究热点。 0004 大量研究证实， 高糖环境导致的代谢异常与线粒体功能障碍是糖尿病肾病的核心 病理机制。 高糖水平下， 肾脏各固有细胞内的糖酵解水平提升， 过剩的糖酵解产物丙酮酸进 入线粒体， 增加三羧酸循环水平与呼吸链电子传递速率， 伴随ROS产生与释放的增加。 过量 的ROS进而损伤线粒体功能， 使得肾脏各固有细胞受损。 有研究证明， 抑制ROS生成对于抑制 慢性肾脏病的发生发展具有重要的作用。 呼吸链复合物 (也称为NADH脱氢酶)作为线粒体 电子传递链中的第一个酶， 接受还原型NADH中的。
6、2H和2电子传递给FMN同时生成NAD+， 是线 粒体ROS生成最主要的酶。 因此， 通过抑制线粒体呼吸链复合物 ， 纠正高糖环境下肾脏固有 细胞的线粒体功能可能是干预糖尿病肾病的潜在策略。 0005 而鱼藤酮是一种特异性的线粒体呼吸链复合物 抑制剂， 存在于亚洲热带及亚热 带区所产豆科鱼藤属植物根中。 本研究证明低剂量鱼藤酮可改善高糖环境导致的代谢异常 与线粒体功能障碍， 可作为一种潜在的糖尿病肾病治疗药物。 目前尚无鱼藤酮用于糖尿病 肾病治疗的任何报道。 发明内容 0006 有鉴于此， 本发明的目的是提供鱼藤酮在制备糖尿病肾病药物中的应用从而为糖 尿病肾病治疗提供一种新的候选化合物。 00。
7、07 本发明提供了如下技术方案： 0008 鱼藤酮在制备糖尿病肾病药物中的应用。 0009 鱼藤酮在制备降低糖尿病患者的肾损伤药物中的应用。 0010 鱼藤酮在制备降低糖尿病患者的肾纤维化药物中的应用。 0011 鱼藤酮在制备糖尿病肾病药物组合物中的应用。 说 明 书 1/7 页 3 CN 108524492 A 3 0012 鱼藤酮在制备改善糖尿病肾病患者的多尿症状的药物中的应用。 0013 鱼藤酮在制备改善糖尿病肾病患者的肾重增加的药物中的应用。 0014 鱼藤酮在制备改善糖尿病肾病患者的肾小球肥大的药物中的应用。 0015 有益效果： 0016 实验结果显示， 鱼藤酮显著了改善糖尿病肾病。
8、模型小鼠的多尿症状。 此外， 相对于 STZ组， 鱼藤酮可逆转STZ导致的小鼠的肾重增加及肾小球肥大现象。 0017 给予STZ处理后小鼠血清Cr、 BUN水平相对Ctrl组均显著升高， 给予鱼藤酮治疗后 则Cr、 BUN水平下降。 尿微量白蛋白检测结果显示， STZ组小鼠产生大量尿微量白蛋白， 鱼藤 酮治疗可显著降低小鼠的尿微量白蛋白水平。 综合血清Cr、 BUN与尿微量白蛋白检测结果， 鱼藤酮对于STZ诱导的糖尿病小鼠的肾脏损伤具有较好的保护作用。 0018 鱼藤酮可改善糖尿病肾病小鼠肾脏组织中糖酵解(Glycolysis)、 三羧酸循环(TCA cycle)及谷胱甘肽等代谢异常， 并通过。
9、减少氧化型/还原型谷胱甘肽比率(GSSH/GSH)降低 肾脏组织ROS水平。 0019 代表性的纤维化基因FN、 -SMA、 Collagen I和Collagen III的表达在纤维化形成 过程中显著上调， 鱼藤酮给药可以显著逆转纤维化相关基因mRNA及蛋白的上调， 鱼藤酮还 可以通过抑制肾脏纤维化阻止并减缓糖尿病向终末期肾病的进展过程。 附图说明 0020 图1是低剂量鱼藤酮(100ppm混匀于饲料进食)的安全性评价， 饲料配制方法见实 施例1。 0021 图2是鱼藤酮改善糖尿病肾病小鼠多尿症状、 肾重增加与肾小球肥大的对比柱状 图， *P0.05,*P0.001comparedwith 。
10、Ctrl group； #P0.05and#P0.001comparedwith STZ-treated group， 图2中， 图2A的纵坐标表示24小时尿量(mL)； 图2B的纵坐标表示肾脏质 量(g)； 图2C的纵坐标表示平均肾小球直径( m)。 0022 图3是鱼藤酮降低糖尿病肾脏损伤指标血清Cr、 BUN及尿微量白蛋白水平的对比柱 状图， *P0.001comparedwith Ctrl group； #P0.05and#P0.01compared with STZ- treated group； 图3中， 图3A的纵坐标表示血清尿素氮水平(mM)； 图3B的纵坐标表示血清肌 酐( 。
11、M)； 图3C的纵坐标表示24小时尿微量白蛋白总量( g)。 0023 图4是鱼藤酮改善糖尿病肾病小鼠肾脏代谢异常的sPLS-DA分析图及代谢物和ROS 相对量对比柱状图， *P0.05,*P0.01and*P0.001comparedwith Ctrl group； #P 0.05compared with STZ-treated group； 图4B、 C的纵坐标表示代谢物相对量； 图4D的纵坐 标表示GSSH/GSH相对值； 图4E的纵坐标表示相对ROS水平。 0024 图5是鱼藤酮改善糖尿病肾病小鼠肾脏组织马松染色的镜下图及肾纤维化相关基 因的mRNA和蛋白表达水平的对比柱状图， *P。
12、0.05， *P0.01and*P0.001compared with Ctrl group； #P0.05compared with STZ-treated group； 图5B分别表示FN、 a-SMA、 Collagen 、 Collagen的mRNA表达相对值。 具体实施方式 0025 下面结合附图和具体实施例， 进一步阐述本发明。 应理解， 这些实施例仅用于说明 说 明 书 2/7 页 4 CN 108524492 A 4 本发明而不用于限制本发明的范围。 本发明实施例中所使用的生物材料和试剂， 如无特别 说明均可从市售渠道获得。 0026 以下实施例中所述鱼藤酮的剂量为100ppm。
13、混匀于饲料进食(实验数据证实小鼠每 天进食不超过5g饲料， 以小鼠25g体重估算， 药物使用剂量不超过20mg/kg/d)。 0027 如图1至图5。 0028 实施例1低剂量鱼藤酮(100ppm混匀于饲料进食)的安全性评价 0029 1实验材料 0030 本发明使用的C57BL/6种属小鼠购自于南京医科大学实验动物中心； 0031 本发明使用鱼藤酮(Rotenone,ROT)购自Sigma-Aldrich公司。 100ppm鱼藤酮饲料 (100mg鱼藤酮均匀混合至400kg饲料粉中， 使用600mL琼脂粉水溶液(2,m/v)糖混匀成 型)； 对照组小鼠所用饲料是以相同方法配制的不含药饲料。 。
14、0032 2实验方法 0033 2.1动物给药方法 0034 雄性C57BL/6小鼠30只(7周龄， 体重20-24g)适应性饲养1周后随机分为Ctrl组(n 7)和ROT组(n7)。 实验前动物自由进食， 维持12小时光照和12小时黑暗的昼夜节律。 实 验室温度： 20-25， 湿度505。 分组后， ROT组小鼠使用含100ppm鱼藤酮饲料饲养4天， 对 照组给予相同配制方法的不含药饲料饲养。 实验数据证实小鼠每天进食不超过5g饲料， 以 小鼠25g体重估算， 药物使用剂量不超过20mg/kg/d， 远远低于用于文献报道中鱼藤酮用于 高血压研究的剂量(600ppm混匀于饲料进食)。 003。
15、5 2.2血清生化检测 0036 收集各组别的小鼠全血样本， 室温静置12h， 于4000rpm离心10min， 转移上清得 到血清样本测定血清谷丙转氨酶(ALT)、 谷草转氨酶(AST)、 肌酐(Cr)、 尿素氮(BUN)及乳酸 脱氢酶(LDH)水平。 0037 3实验结果 0038 对照组与鱼藤酮组小鼠体重(图1A)、 肝损伤指标(血清谷丙转氨酶、 谷草转氨酶) (图1B-C)、 肾损伤指标(血清肌酐、 尿素氮)(图1D-E)及心脏毒性指标(乳酸脱氢酶)(图1F) 水平均无差异。 说明100ppm鱼藤酮饲料饲养小鼠为安全剂量， 在小鼠中以该方式给药无肝 脏、 肾脏及心脏毒性。 0039 实。
16、施例2鱼藤酮改善糖尿病肾病小鼠多尿症状、 肾重增加与肾小球肥大 0040 1实验材料 0041 本发明使用的链脲佐菌素(Streptozocin,STZ)与柠檬酸钠均购自Sigma-Aldrich 公司。 STZ使用柠檬酸钠溶液(pH4.0)溶解， 现配现用。 其他生物材料和化学材料同实施例 1。 0042 2实验方法 0043 2.1小鼠糖尿病肾病模型建立及鱼藤酮给药方法 0044 雄性C57BL/6小鼠30只(7周龄， 体重20-24g)适应性饲养1周后进行单侧肾脏摘除 手术。 具体方法为： 取小鼠腹部正中切口， 沿腹白线切开肌层， 进入腹腔， 推开肠管向对侧， 暴露一侧肾脏及血管， 充分。
17、游离肾门处血管， 结扎肾脏动静脉及输尿管后摘除单侧肾脏， 关 闭腹腔。 术后正常饲养1周后， 随机分为Ctrl组(n7)和实验组(n23)。 所有模型组小鼠在 说 明 书 3/7 页 5 CN 108524492 A 5 禁食6h后给予50mg/kg的剂量腹腔注射STZ， 每天一次， 连续注射5天。 相应地， 对照组注射相 同体积的柠檬酸钠溶液， 每天一次， 连续注射5天。 实验前动物自由进食， 维持12小时光照和 12小时黑暗的昼夜节律。 实验室温度： 20-25， 湿度505。 0045 注射结束一周后， 连续三天于相同时间测定所有小鼠的血糖水平， 三天平均血糖 高于15mM的小鼠视为造模。
18、成功。 按照血糖水平， 将实验组小鼠平均分配至STZ组(n10)与 STZ+ROT组(n10)。 分组后， 模型给药组小鼠使用含100ppm鱼藤酮饲料饲养(配制方法见实 施例1)； 对照组和模型组给予相同配制方法的不含药饲料饲养。 0046 2.2小鼠尿量监测 0047 于STZ+ROT组小鼠开始治疗后的第1至第4周使用小鼠代谢笼收集各组别的小鼠 24h尿液。 于2000rpm离心5min去除食物残渣及粪便等， 转移上清并测量尿液体积。 0048 2.3小鼠肾重测量、 肾小球直径测量与统计 0049 于STZ+ROT组小鼠开始治疗后的第4周处死小鼠， 取肾脏组织， 天平称取肾脏重量 后， 切取。
19、部分进行常规固定、 脱水、 石蜡包埋、 切片及Masson染色， Olympus BX51显微镜采集 图像并使用Olympus cellSens Standard 1.15软件测量肾小球直径。 对每个组织样本随机 选取若干视野， 并至少测量10个肾小球长径， 计算所得平均值即为该样本的平均肾小球直 径。 0050 3实验结果 0051 糖尿病肾病小鼠典型的初期症状包括多尿、 肾脏增大及肾小球肥大。 在确定鱼藤 酮的安全剂量前提下， 进一步验结果显示， Ctrl组小鼠24h尿量平均值约为1mL， STZ组尿量 显著高于对照组小鼠， 随疾病进程平均尿量逐步提高至约20mL， 而STZ+ROT组小鼠。
20、平均尿量 显著低于STZ组， 四周尿量均值均在10mL以下(图2A)， 说明鱼藤酮显著了改善糖尿病肾病模 型小鼠的多尿症状。 此外， 相对于STZ组， 鱼藤酮可逆转STZ导致的小鼠的肾重增加(图2B)及 肾小球肥大(图2C， 图5A)现象。 0052 实施例3鱼藤酮改善糖尿病肾病小鼠的肾脏损伤水平 0053 1实验材料 0054 本发明所使用的尿微量白蛋白检测试剂盒购自Bethyl Laboratories公司； 其他 生物材料和化学材料同实施例1。 0055 2实验方法 0056 2.1血清生化检测 0057 收集各组别的小鼠全血样本， 室温静置12h， 于4000rpm离心10min， 转。
21、移上清得 到血清样本测定血清肌酐(Cr)、 尿素氮(BUN)水平。 0058 2.2尿微量白蛋白检测 0059 取STZ+ROT组小鼠开始治疗后的第4周各组别的小鼠尿液， 按照尿液： PBS1:200 稀释后， 依照说明书步骤进行定量检测。 0060 24h尿微量白蛋白量( g)尿微量白蛋白浓度( g/mL)稀释倍数24h尿体积 (mL) 0061 3实验结果 0062 血清Cr、 BUN是临床评判肾功能的两个常用的重要生化指标， 尿微量白蛋白则反映 早期肾小球损伤， 是糖尿病肾病的重要指征之一。 给予STZ处理后小鼠血清Cr、 BUN水平相对 说 明 书 4/7 页 6 CN 1085244。
22、92 A 6 Ctrl组均显著升高， 给予鱼藤酮治疗后则血清Cr、 BUN水平下降(图3A-B)。 尿微量白蛋白检 测结果显示， STZ组小鼠产生大量尿微量白蛋白， 鱼藤酮治疗可显著降低小鼠的尿微量白蛋 白水平(图3C)。 综合血清Cr、 BUN与尿微量白蛋白检测结果， 鱼藤酮对于STZ诱导的糖尿病小 鼠的肾脏损伤具有较好的保护作用。 0063 实施例4鱼藤酮改善糖尿病肾病小鼠肾脏代谢紊乱 0064 1实验材料 0065 本发明所使用代谢物标准品Fructose 1 ,6-bisphosphate(FBP)、 Malate、 Succinate、 Oxidized glutathione(GS。
23、SG)、 Reduced glutathione(GSH)、 Glucose-6- phosphate(G6P)、 Pyruvate、 Lactate均购自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO,USA)； 代谢组学 样品前处理及数据采集所用仪器设备： XBridgeTM Amide HPLC column(3.5 m,4.6mm i.d, 100mm)(Waters Corp.,Milford,MA)； AB SCIEX Triple TOF 5600型飞行时间质谱仪 (SCIEX,Framingham,MA,USA)配有岛津LC-30A高效液相色谱系统(Shimadzu,Jap。
24、an)， 包括 真空在线脱气机DGU-20As， 液相泵LC-30AD， 控制器SPD-m20A， 自动进样器SIL-30AC， CTO- 20A柱温箱， 电喷雾离子化源和Analyst 1.5.1工作站， MultiQuant 2.0数据处理软件 (SCIEX,Concord,ON,USA)， SIMCA-P 13.0软件(Umetrics,Sweden)。 0066 2实验方法 0067 2.1组织代谢组学样本前处理方法 0068 取于STZ+ROT组小鼠开始治疗后的第4周的各组小鼠肾脏组织约50mg组织样本， 加 入500 L超纯水， 钢珠室温振荡匀浆5次(1min/次)； 4， 18,。
25、000rpm离心5min， 取100 L上清， 并加入400 L含15 g/mL内标的甲醇溶液； 4静置1h后， 4， 18,000rpm离心10min， 转300 L 上清， 真空浓缩不加热挥干； 加入120 L超纯水复溶， 4， 18,000rpm离心10min， 取80 L上清 于进样瓶中， 20 L进样。 0069 2.2基于HPLC-Triple TOF的组代谢组学测定方法 0070 (1)色谱条件 0071 进样体积20 L； 流速400 L/min； 色谱柱Amide XBridge HPLC column(3.5 m, 4.6mm i.d,100mm)(Waters Corp.。
26、,Milford,MA)； 柱温40； 自动进样器温度4； 水相(A) 为5mM醋酸铵溶于水： 乙腈(95： 5,v/v)混合液中， 浓氨水调pH至9.0； 有机相(B)为乙腈。 采用梯度洗脱方式进行分离： 03.0min， 85B； 3.06.0min， 8530B； 6.0min 15.0min， 302B； 15.018min， 2B； 18.0min19.0min， 285B； 1926min， 85B。 0072 (2)质谱条件 0073 SCIEX TripleTOF 5600质谱系统(Framingham,MA,USA)； 离子源： 电喷雾离子化源 (ESI)； 负离子方式检测；。
27、 ESI源参数设置： Ion Source Gas 1(GS1)为33psi， Ion Source Gas 2(GS2)为33psi， Curtain gas(CUR)为25psi， source temperature为475， ion spray voltage floating为-4500V。 质谱参数设置： Collision gas为N2， Q1vacuum gauge为2.2* 10-5torr， TOF vacuum为0 .309*10-6torr； 扫描方式为Information-dependent acquisition(IDA)， 母离子扫描范围m/z 501000Da。
28、， 碎片离子扫描范围m/z 501000Da。 母 离 子 信 号 采 集 设 置 为 高 分 辨 模 式 ， c o l l i s i o n e n e r g y ( C E ) 为 - 5 V ， declusteringpotential(DP)值为-95V。 碎片离子信号采集设置为CE为-30V10V， DP值为- 说 明 书 5/7 页 7 CN 108524492 A 7 95V； IDA采集参数设置： 电荷数为1， 强度高于500cps， excluded isotopes within 4Da， mass tolerance of 10ppm， maximum numbe。
29、r ofcandidate ions was 4。 母离子和碎片离 子累积时间分别为250ms and 100ms。“exclude formertarget ions” 设置为8s after 1occurrence。 IDA选项卡中勾选 “dynamic background subtract” 。 0074 2.3多元数据分析 0075 代谢物峰面积经ROC曲线下面积校正后， 使用Metaboanalyst(http:/ www.metaboanalyst.ca/)在线工具进行多元数据分析。 0076 2.4代谢物鉴定 0077 使用Student s t检验对24hr的代谢物峰面积数据。
30、进行显著性分析， 对显著变化 (p0.05)的化合物进行鉴定。 使用公众数据库如METLIN(http:/metlin.scripps.edu/)， MassBank(http:/www.massbank.jp/)和Human Metabolome Database(HMDB)(http:/ www.hmdb.ca/)中收集的代谢物以及代谢物标准品的精确分子质量和二级质谱碎裂谱图与 样品中分子离子峰及其对应的质谱碎片的精确分子量进行比对、 鉴定和解析。 0078 3实验结果 0079 高糖环境导致的代谢异常与线粒体功能障碍是糖尿病肾病的核心病理机制。 本部 分通过对小鼠肾组织的代谢组学检测， 。
31、使用偏最小二乘法-判别分析法(sparse partial least squares-discriiminate analysis， sPLS-DA)分析可见， Ctrl组(右侧组， 黑点)、 STZ 组(左侧组， 灰点)与STZ+ROT组(中间组， 黑点)均得到良好区分， 且STZ+ROT组较STZ组更接 近Ctrl组(图4A)， 说明鱼藤酮可改善模型组小鼠的肾脏代谢异常。 进一步对代谢物的鉴定 与 相对定量分析 ， 结果显示鱼 藤酮可改 善糖尿 病肾 病小鼠 肾 脏组 织中 糖酵解 (Glycolysis)、 三羧酸循环(TCA cycle)及谷胱甘肽代谢异常(图4B-D)， 并降低肾脏。
32、组织 ROS水平(图4E)。 0080 实施例5鱼藤酮改善糖尿病肾病小鼠肾纤维化相关水平 0081 1实验材料 0082 逆转录试剂盒与SYBR green PCR mix购自Vazyme公司； Trizol RNAiso plus购自 TAKARA公司； 其他生物材料和化学材料同实施例1。 0083 2实验方法 0084 2.1肾脏组织马松(Masson)染色 0085 于STZ+ROT组小鼠开始治疗后的第4周处死小鼠， 取肾脏组织， 天平称取肾脏重量 后， 切取部分进行常规固定、 脱水、 石蜡包埋、 切片及Masson染色。 0086 2.2肾脏组织纤维化因子FN、 -SMA、 Colle。
33、gen I和Collegen III的mRNA及蛋白水 平检测 0087 同实施例1， 2。 0088 3实验结果 0089 糖尿病肾病进展为终末期肾病过程中， 最重要的病理变化是肾小球纤维化。 本部 分通过组织马松染色及FN、 -SMA、 Collegen I和Collegen III的mRNA及蛋白水平检测对小 鼠肾脏中的纤维化程度进行评价。 马松染色结果显示， STZ组小鼠胶原纤维增生明显(蓝色 纤维)， 大量存在肾小管间质与肾小球中； 而STZ+ROT组小鼠肾脏中胶原纤维增生情况得到 显著逆转(图5A)。 实时定量PCR与Western Blot结果显示， 代表性的纤维化基因FN、 -。
34、SMA、 说 明 书 6/7 页 8 CN 108524492 A 8 Collagen I和Collagen III的表达在纤维化形成过程中也得到显著上调， 鱼藤酮给药可以 显著逆转纤维化相关基因mRNA及蛋白的上调(图5B,图5C)， 提示鱼藤酮还可能通过抑制肾 脏纤维化阻止并减缓糖尿病向终末期肾病的进展过程。 说 明 书 7/7 页 9 CN 108524492 A 9 图1 图2 说 明 书 附 图 1/3 页 10 CN 108524492 A 10 图3 图4 说 明 书 附 图 2/3 页 11 CN 108524492 A 11 图5 说 明 书 附 图 3/3 页 12 CN 108524492 A 12 。