《人参皂苷单体化合物在制备治疗黄病毒科病毒感染的药物中的用途.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《人参皂苷单体化合物在制备治疗黄病毒科病毒感染的药物中的用途.pdf（10页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201410777175.3 (22)申请日 2014.12.15 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 104688753 A (43)申请公布日 2015.06.10 (73)专利权人 中国农业科学院特产研究所 地址 130112 吉林省长春市净月经济开发 区聚业大街4899号 (72)发明人 张淑琴 谭斌 金银萍 程世鹏 王凤雪 郭靖 王英平 (74)专利代理机构 北京思元知识产权代理事务 所(普通合伙) 11598 代理人 余光军 (51)Int.Cl. A61。
2、K 31/704(2006.01) A61K 31/7034(2006.01) A61P 31/14(2006.01) (56)对比文件 徐先祥等.中药皂苷抗病毒作用研究概况. 中药药理与临床 .2008,第24卷(第2期),第 110-112页. 徐先祥等.中药皂苷抗病毒作用研究概况. 中药药理与临床 .2008,第24卷(第2期),第 110-112页. 李静波等.人参茎叶皂甙与Rb1等单体对病 毒复制的影响. 白求恩医科大学学报 .1992,第 18卷(第1期),第24-26页. 审查员 赵保忠 (54)发明名称 人参皂苷单体化合物在制备治疗黄病毒科 病毒感染的药物中的用途 (57)摘要。
3、 本发明公开了人参皂苷单体化合物在制备 治疗黄病毒科病毒感染的药物中的用途， 属于人 参皂苷单体化合物的新医药用途领域。 本发明从 多种人参皂苷单体化合物中筛选出具有良好的 抗牛病毒性腹泻病毒的人参皂苷单体化合物， 这 些化合物通过直接杀灭病毒颗粒、 阻断病毒侵入 细胞或抑制病毒在细胞内复制等方式发挥抗牛 病毒性腹泻病毒作用， 能够用于治疗由牛病毒性 腹泻病毒或丙型肝炎病毒等黄病毒科病毒感染 所导致的疾病。 本发明进一步公开了一种治疗黄 病毒科病毒感染的药物组合物， 包括治疗上有效 量的人参皂苷单体化合物和药学上可接受的辅 料或载体。 权利要求书1页 说明书7页 附图1页 CN 1046887。
4、53 B 2018.09.14 CN 104688753 B 1.人参皂苷单体化合物在制备治疗黄病毒科病毒感染的药物中的用途； 所述黄病毒科 病毒是牛病毒性腹泻病毒(Bovine Viral Diarrhea Virus)； 其中， 所述人参皂苷单体化合物为人参皂苷Rb2或人参皂苷Rb3中的任意一种或两种。 2.人参皂苷单体化合物在制备杀灭黄病毒科病毒颗粒的药物中的用途； 所述黄病毒科 病毒是牛病毒性腹泻病毒(Bovine Viral Diarrhea Virus)； 其中， 所述人参皂苷单体化合物为人参皂苷Rb2或人参皂苷Rb3中的任意一种或两种。 3.人参皂苷单体化合物在制备阻断黄病毒科病。
5、毒侵入细胞的药物中的用途； 所述黄病 毒科病毒是牛病毒性腹泻病毒(Bovine Viral Diarrhea Virus)； 其中， 所述人参皂苷单体化合物为人参皂苷Rb2或人参皂苷Rb3中的任意一种或两种。 4.人参皂苷单体化合物在制备抑制黄病毒科病毒在细胞内复制的药物中的用途； 所述 黄病毒科病毒是牛病毒性腹泻病毒(Bovine Viral Diarrhea Virus)； 其中， 所述人参皂苷单体化合物为人参皂苷Rb2或人参皂苷Rb3中的任意一种或两种。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 104688753 B 2 人参皂苷单体化合物在制备治疗黄病毒科病毒感染的药物中 的用途 技。
6、术领域 0001 本发明涉及人参皂苷单体化合物的新医药用途， 尤其涉及人参皂苷单体化合物在 制备治疗黄病毒科病毒感染药物中的用途， 属于人参皂苷单体化合物的新医药用途领域。 背景技术 0002 人参皂苷(Ginsenoside)是人参的主要成分之一， 以往研究人参皂苷多集中于抗 癌活性及免疫调节作用。 人参皂苷具有一定的抗病毒作用， 而具体人参皂苷单体的直接抗 病毒作用的报道较少。 0003 牛病毒性腹泻/黏膜病(Bovine viral diarrhea/mucosal disease， BVD/MD)是由 牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus， BVDV。
7、)引起的牛等动物的重要传染病。 目前， BVDV免疫抑制及持续性感染所引发的经济损失非常严重。 BVDV与丙型肝炎病毒 (hepatitis C virus， HCV)均隶属于黄病毒科， 且由于基因组结构、 复制翻译策略和蛋白质 功能与丙型肝炎病毒(HCV)密切相似， BVDV一直被认为是研究HCV生命活动及抗病毒药物筛 选的理想替代模型。 筛选出具有直接抗病毒作用的人参皂苷单体， 对于治疗黄病毒科病毒 感染具有重要意义。 发明内容 0004 本发明所要解决的技术问题是提供人参皂苷单体化合物在制备治疗黄病毒科病 毒感染的药物中的新用途， 这些化合物通过直接杀灭病毒颗粒、 阻断病毒侵入细胞或抑制。
8、 病毒在细胞内复制等方式发挥抗病毒作用， 能够用于治疗由牛病毒性腹泻病毒或丙型肝炎 病毒等黄病毒科病毒感染所导致的疾病。 0005 为解决上述技术问题， 本发明所采取的技术方案是： 0006 本发明首先将包括人参皂苷Rb1， Rb2， Rb3， Rc， Rd， Re， Rg1， Rg2， Rg3(s)， Rf， Rh1 (s)， Rh2， 拟人参皂苷Rh2， 拟人参皂苷F11， 三七皂苷R1， 刺五加皂苷B和刺五加甙E等在内的 多种人参皂苷单体化合物通过细胞毒性实验确定这些人参皂苷单体化合物在MDBK细胞的 安全浓度。 细胞毒性实验结果发现： 人参皂苷Rb1、 Rb2、 Rb3、 Rc、 Re。
9、、 Rg1、 Rf、 Rh1(s)、 拟人参 皂苷F11、 三七皂苷R1、 刺五加皂苷B和刺五加甙E这些单体化合物在最大浓度(500 g/mL)对 MDBK细胞无毒性， 细胞单层完整， 细胞单折光性良好， 视野中未见死细胞； Rg3(s)以及Rh2浓 度高于62.5 g/mL对MDBK细胞有毒性； 拟人参皂苷Rh2浓度高于31.25 g/mL对MDBK细胞有毒 性， 浓度高于250 g/mL时， 细胞单层严重残缺， 基本不成层， 折光性很差， 视野中主要为圆细 胞或死细胞。 0007 在确定了人参皂苷单体化合物对于细胞毒性的基础上， 本发明进一步通过人参皂 苷单体化合物对牛病毒性腹泻病毒(BV。
10、DV)致细胞病变的抑制实验以期望筛选得到对BVDV 病毒有良好的抑制作用且对细胞无毒的人参皂苷单体化合物； 实验结果发现， Rb2和Rb3大 于100 g/mL即可对BVDV病毒产生良好的抑制作用， 细胞状态正常， 证明人参皂苷单体化合 说 明 书 1/7 页 3 CN 104688753 B 3 物不仅对于牛病毒性腹泻病毒有非常好的抑制作用， 而且对于细胞无毒； Rd， Rh2和Rg3(s) 尽管对于病毒有产生一定的抑制作用， 但是这些单体化合物对于细胞的毒性很大； 其余的 人参皂苷单体化合物即便在最大浓度(500 g/mL)时对BVDV病毒无任何抑制作用。 0008 人参皂苷单体化合物Rb。
11、2或Rb3抑制BVDV病毒复制方式确定实验结果表明， 人参皂 苷单体化合物Rb2或Rb3浓度为200 g/mL时， 可以直接杀灭病毒颗粒、 抑制病毒在细胞内复 制等环节阻抗病毒作用。 通过预防组结果表明， 人参皂苷单体化合物Rb2或Rb3具有一定阻 断病毒侵入细胞作用。 因此， 人参皂苷单体化合物Rb2， Rb3通过直接杀灭病毒颗粒、 阻断病 毒侵入细胞或抑制病毒在细胞内复制等多个环节的方式发挥抗病毒作用， 可以用于制备治 疗由牛病毒性腹泻病毒或丙型肝炎病毒等黄病毒科病毒感染所导致的疾病的药物。 0009 本发明所述黄病毒科病毒包括牛病毒性腹泻病毒(Bovine Viral Diarrhea 。
12、Virus， BVDV)、 丙型肝炎病毒(hepatitis C virus， HCV)、 猪瘟病毒(Classical Swine fever virus， CSFV)或绵羊边界病毒(Border disease virus， BDV)中的任意一种或多种。 0010 由于研究发现能够抑制BVDV在细胞中复制的药物一般都可以用于治疗HCV感染 (Buckwold V,Beer B,Donis R,Bovine viral diarrhea virus as a surrogate model of hepatitis C virus for the evaluation of antivira。
13、l agents.Antiviral Research,2003,60(1):115； Michelle P Walker,Nanhua Yao,Zhi Hong Promising candidates for the treatment of chronic hepatitis C.Expert Opinion on Investigational Drugs,August 2003,Vol.12,No.8:1269-1280.)因此， 本发明所筛选的 人参皂苷单体化合物在治疗丙型肝炎病毒感染方面亦具有一定效果。 0011 本发明还公开了一种治疗黄病毒科病毒感染的药物组合物， 包括： 治疗。
14、上有效量 的人参皂苷单体化合物和药学上可接受的辅料或载体。 0012 其中， 所述人参皂苷单体化合物包括人参皂苷Rb2、 Rb3、 Rd、 Rg3(s)或Rh2中的任意 一种或多种； 优选的， 所述人参皂苷单体化合物为人参皂苷Rb2或人参皂苷Rb3中的任意一 种或两种。 0013 本发明所述人参皂苷Rb2、 Rb3、 Rd、 Rg3(s)或Rh2的分子式、 化学结构式见表1。 0014 表1 人参皂苷Rb2、 Rb3、 Rd、 Rg3(s)或Rh2的分子式及化学结构式 0015 说 明 书 2/7 页 4 CN 104688753 B 4 0016 说 明 书 3/7 页 5 CN 10468。
15、8753 B 5 0017 0018 本发明所述人参皂苷单体化合物可以商品化购买， 也可以在人参茎叶中或人参根 部提取， 其提取方法为本领域技术人员所熟知。 0019 本发明技术方案与现有技术相比， 具有以下有益效果： 0020 本发明筛选出的人参皂苷单体化合物Rb2以及Rb3通过直接杀灭病毒颗粒、 阻断病 毒侵入细胞或抑制病毒在细胞内复制等多个环节的方式发挥抗病毒作用， 具有优异的抗病 毒活性且对细胞无毒， 可以用于制备治疗由牛病毒性腹泻病毒或丙型肝炎病毒等黄病毒科 病毒感染所导致疾病的药物。 附图说明 0021 图1为人参皂苷单体化合物Rb2和Rb3对BVDV抑制的荧光检测结果； 其中， 。
16、A： MDBK细 胞对照； B： DMSO对照； C： BVDV对照； D： Rb2预防组； E： Rb2治疗组； F： Rb2灭活组； G： Rb3预防组； H： Rb3治疗组； I： Rb3灭活组。 具体实施方式 0022 下面结合具体实施例来进一步描述本发明， 本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。 但是应理解所述实施例仅是范例性的， 不对本发明的范围构成任何限制。 本领域 技术人员应该理解的是， 在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和 形式进行修改或替换， 但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。 0023 1、 实验材料 0024 药物： 人参皂苷标准品Rb1。
17、， Rb2， Rb3， Rc， Rd， Re， Rg1， Rg2， Rg3(s)， Rf， Rh1(s)， Rh2， 拟人参皂苷Rh2， 拟人参皂苷F11， 三七皂苷R1， 刺五加皂苷B， 刺五加甙E， 购买于吉林大学， HPLC检测含量 98； 0025 其中Rb1， Rc， Rd， Rg1， Rg3(s)， Rf， Rh1(s)， Rh2， 三七皂苷R1采用无水乙醇溶解， Rb2， Rb3， Re， Rg2， 拟人参皂苷F11， 拟人参皂苷Rh2， 刺五加甙E， 刺五加皂苷B采用DMSO溶解， 4保存备用。 0026 细胞： MDBK细胞， 购于中国兽医药品监察所， 培养于含有6无BVDV。
18、病毒污染的胎 牛血清的DMEM培养液中； 0027 病毒： BVDV-C24V毒株， 购于中国兽医药品监察所。 0028 实施例1人参皂苷单体化合物对细胞毒性实验 0029 1、 实验方法 0030 将MDBK细胞用0.25胰酶消化后加入生长液吹散混匀， 100 l/孔接种于96孔细胞 说 明 书 4/7 页 6 CN 104688753 B 6 培养板， 37， 5CO2中培养24h后生长为单层细胞， 弃去培养液， 待用。 将人参皂苷标准品 做2倍倍比稀释进行粗筛。 每一浓度接种事先准备好的细胞5孔， 每孔100 l。 以样品溶剂和 正常MDBK细胞作为阴性对照。 无水乙醇与DMSO在2.5。
19、浓度以下基本无细胞毒性， 所有测试 样品均在溶剂无毒性范围内进行实验， 37， 5CO2中培养， 第二日起， 每日在倒置显微镜 下逐日观察细胞形态， 观察72小时后记录最终结果。 0031 2、 实验结果 0032 实验结果见表2。 0033 表2 人参皂苷单体化合物在MDBK细胞的安全浓度确定 0034 0035 注：“” 表示细胞单层完整， 细胞单折光性良好， 视野中未见死细胞。 0036 “+” 表示细胞单折光性正常， 视野中可见极少量圆细胞或死细胞。 0037 “+” 表示单层有较大残缺， 折光性较差， 视野中可见大量圆细胞或死细胞。 0038 “+” 表示细胞单层严重残缺， 基本不成。
20、层， 折光性很差， 视野中主要为圆细胞或 死细胞。 0039 实施例2人参皂苷单体化合物对BVDV病毒抑制实验 0040 1、 实验方法 0041 将MDBK细胞接种于96孔细胞培养板， 每孔0.1ml， 待细胞长成单层， 将不同浓度的 人参皂苷单体化合物与BVDV病毒混合， 在37感作1小时后， 接种于事先准备好的细胞， 100 l/孔， 同时设置溶剂对照、 病毒对照和正常细胞对照， 37， 5CO2中培养72小时后， 通过 观察细胞病变和免疫荧光试验确定药物对病毒的杀灭情况。 0042 2、 实验结果 0043 人参皂苷单体化合物对BVDV病毒致细胞病变的抑制作用实验结果见(表3)表明， 。
21、Rb2和Rb3大于100 g/mL即可对病毒产生良好的抑制作用； Rd， Rh2和Rg3(s)对细胞的毒性很 大， 但同时对病毒亦产生一定的抑制作用。 其余人参皂苷单体化合物(Rb1、 Rc、 Re、 Rg1、 Rg2、 Rf、 Rh1(s)、 拟人参皂苷Rh2、 拟人参皂苷F11、 三七皂苷R1、 刺五加皂苷B和刺五加甙E)在最 说 明 书 5/7 页 7 CN 104688753 B 7 大浓度(500 g/mL)对BVDV病毒无任何抑制作用。 0044 表3 不同浓度人参皂苷单体化合物抗牛病毒性腹泻病毒结果 0045 0046 注：“+” 表示大于75细胞呈现阳性； 0047 “+” 表。
22、示50细胞呈现阳性； 0048 “+” 表示25以下细胞呈现阳性； 0049 “-” 表示细胞状态正常， 无阳性。 0050 实施例3人参皂苷单体化合物Rb2或Rb3抑制BVDV病毒复制方式确定实验 0051 1、 实验方法 0052 将MDBK细胞接种于24孔细胞培养板， 待细胞长成单层， 分别设立预防组、 直接灭活 组、 治疗组、 BVDV病毒感染对照、 正常MDBK细胞对照及DMSO对照组。 通过观察细胞病变和免 疫荧光试验确定药物对病毒的杀灭情况。 0053 预防组： 先加入人参皂苷单体化合物Rb2或Rb3(浓度为200 g/mL)500 l/孔， 37， 5CO2中培养2小时后， 弃。
23、药物， 加入BVDV病毒(104.0TCID50/mL)500 l/孔， 放入37， 5CO2 说 明 书 6/7 页 8 CN 104688753 B 8 培养箱中继续培养， 通过观察细胞病变和免疫荧光试验确定药物对病毒感染细胞的阻断情 况。 0054 直接灭活组： 将人参皂苷单体化合物Rb2或Rb3(浓度为200 g/mL)与BVDV病毒 (104.0TCID50/mL)1： 1混合后， 37， 5CO2中培养2小时后， 加入细胞培养板， 500 l/孔， 放入 37， 5CO2培养箱中继续培养， 通过观察细胞病变和免疫荧光试验确定药物对病毒的杀 灭情况。 0055 治疗组： 先加入BVD。
24、V病毒(104.0TCID50/mL)500 l/孔37， 5CO2中培养2小时后， 弃病毒， 加入人参皂苷单体化合物Rb2或Rb3(浓度为200 g/mL)500 l/孔， 放入37， 5CO2 培养箱中继续培养， 通过观察细胞病变和免疫荧光试验确定药物对病毒的抑制情况。 0056 2、 实验结果 0057 结果见图1。 图1E-F表明， 人参皂苷单体化合物Rb2浓度为200 g/mL时， 可以直接杀 灭病毒颗粒、 抑制病毒在细胞内复制等环节阻抗BVDV病毒。 预防组结果(图1D)表明， 人参皂 苷单体化合物Rb2具有一定阻断病毒侵入细胞作用。 0058 图1H-I表明， 人参皂苷单体化合物Rb3浓度为200 g/mL时， 可以直接杀灭病毒颗 粒、 抑制病毒在细胞内复制等环节阻抗BVDV病毒。 预防组结果(图1G)表明， 人参皂苷单体化 合物Rb3具有一定阻断病毒侵入细胞作用。 0059 因此， 本发明认为人参皂苷单体化合物Rb2， Rb3以其直接杀灭病毒颗粒、 阻断病毒 侵入细胞或抑制病毒在细胞内复制等多个环节的方式发挥抗病毒作用， 可以应用于制备抗 黄病毒科病毒药物。 说 明 书 7/7 页 9 CN 104688753 B 9 图1 说 明 书 附 图 1/1 页 10 CN 104688753 B 10 。