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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201410239171.X (22)申请日 2014.05.30 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 105148266 A (43)申请公布日 2015.12.16 (73)专利权人 中国科学院过程工程研究所 地址 100190 北京市海淀区中关村北二条1 号 (72)发明人 马光辉 王连艳 苏志国 刘媛 杨婷媛 周炜清 (74)专利代理机构 北京品源专利代理有限公司 11332 代理人 巩克栋 侯桂丽 (51)Int.Cl. A61K 39/39(2006.01。
2、) A61K 9/107(2006.01) A61P 37/04(2006.01) A61K 39/145(2006.01) A61K 39/17(2006.01) A61K 39/135(2006.01) A61K 39/12(2006.01) (56)对比文件 CN 102579339 A,2012.07.18, CN 101670104 A,2010.03.17, 巩方玲等.尺寸均一乳液的制备技术. 生物 颗粒与粉体制备、 应用技术研讨会论文集 .2010,120-121. 骆东等.油乳佐剂的研究进展. 中国家禽 .2008,第30卷(第12期),35-37. Kohhei Tetsut。
3、ani et alAdjuvants in influenza vaccines. Vaccine .2012,第30卷 7658-7661. 审查员 马静 (54)发明名称 一种W/O型疫苗油佐剂制剂及其制备方法 (57)摘要 本发明涉及一种W/O型疫苗油佐剂制剂及其 制备方法。 所述制剂为W/O型乳液， 其中水相为含 有抗原的溶液， 油相包含白油、 乳化剂和稳定剂； 所述W/O型乳液的平均粒径在0.1-8.22m之间， 分散系数小于0.1。 所述方法通过将预乳液转移 至快速膜乳化的储料罐中， 在0.1-2.5MPa压力下 过微孔膜， 得到所述W/O型疫苗油佐剂制剂。 本发 明的W/O型疫苗。
4、油佐剂制剂尺寸均一、 可控， 乳液 均一性的提高有利于乳滴稳定性增强， 奥氏熟化 过程比传统方法制备的乳液更慢， 进而使其在注 射进体内后， 抗原突释低， 而后期抗原持续释放， 诱导快速、 高效、 持续的免疫应答水平。 权利要求书1页 说明书9页 附图7页 CN 105148266 B 2018.09.04 CN 105148266 B 1.一种W/O型疫苗油佐剂制剂， 其特征在于， 所述制剂为W/O型乳液， 其中水相为含有抗 原的溶液， 油相包含白油、 乳化剂和稳定剂； 所述W/O型乳液的平均粒径在0.1-8.22 m之间， 分散系数小于0.1。 2.根据权利要求1所述的W/O型疫苗油佐剂制。
5、剂， 其特征在于， 所述W/O型乳液的平均粒 径在0.59-8.22 m之间。 3.根据权利要求2所述的W/O型疫苗油佐剂制剂， 其特征在于， 所述W/O型乳液的平均粒 径在0.59-5.0 m之间。 4.根据权利要求1所述的W/O型疫苗油佐剂制剂， 其特征在于， 所述抗原选自禽流感灭 活病毒、 新城疫灭活病毒、 猪圆环病毒和口蹄疫病毒中的1种或至少2种的组合。 5.根据权利要求1所述的W/O型疫苗油佐剂制剂， 其特征在于， 所述乳化剂为亲水亲油 平衡值在3.56.0之间的表面活性剂。 6.根据权利要求5所述的W/O型疫苗油佐剂制剂， 其特征在于， 所述乳化剂选自Span60、 Span80和。
6、Span83中的1种或至少2种的组合。 7.根据权利要求1所述的W/O型疫苗油佐剂制剂， 其特征在于， 所述稳定剂选自硬脂酸、 硬酯酸铝和单硬酯酸甘油酯中的1种或至少2种的组合。 8.一种制备权利要求1-7任一项所述的W/O型疫苗油佐剂制剂的方法， 包括以下步骤： (1)将含有抗原的溶液作为水相分散于包含白油、 乳化剂和稳定剂的油相中， 获得W/O 型预乳液； (2)将所述W/O型预乳液转移至快速膜乳化的储料罐中， 在0.1-2.5MPa压力下过微孔 膜， 得到所述W/O型疫苗油佐剂制剂。 9.根据权利要求8所述的方法， 其特征在于， 所述步骤(1)中水相与油相的体积比为1:1 1:10。 1。
7、0.根据权利要求8所述的方法， 其特征在于， 所述抗原选自禽流感灭活病毒、 新城疫灭 活病毒、 猪圆环病毒和口蹄疫病毒中的1种或至少2种的组合。 11.根据权利要求8所述的方法， 其特征在于， 所述乳化剂为亲水亲油平衡值在3.5 6.0之间的表面活性剂。 12.根据权利要求8所述的方法， 其特征在于， 所述乳化剂选自Span60、 Span80和Span83 中的1种或至少2种的组合。 13.根据权利要求8所述的方法， 其特征在于， 所述稳定剂选自硬脂酸、 硬酯酸铝和单硬 酯酸甘油酯中的1种或至少2种的组合。 14.根据权利要求8所述的方法， 其特征在于， 所述步骤(1)中采用均质乳化、 超声。
8、乳化、 机械搅拌或磁力搅拌将所述水相分散于所述油相中， 获得W/O型预乳液。 15.根据权利要求8所述的方法， 其特征在于， 所述步骤(2)中微孔膜的孔径为0.5-50 m。 16.根据权利要求15所述的方法， 其特征在于， 所述步骤(2)中微孔膜的孔径为0.8-9.2 m。 17.根据权利要求8所述的方法， 其特征在于， 所述步骤(2)中过微孔膜反复进行， 次数 为3-5次。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 105148266 B 2 一种W/O型疫苗油佐剂制剂及其制备方法 技术领域 0001 本发明涉及疫苗技术领域， 尤其涉及兽用疫苗领域中均一、 可控的W/O型疫苗油佐 剂制剂及。
9、其制备方法， 可用于提高制剂稳定性， 诱导快速免疫应答以及提升免疫应答强度 和水平。 背景技术 0002 随着经济全球化进程的加快， 动物及动物产品的流通越来越频繁， 动物疫病的传 播媒介不断增多， 发病和病害流行的几率显著增加， 在造成经济损失的同时， 也严重危害了 人类的健康和生命安全。 据不完全统计， 近20年来， 新增加的动物疫病就有10余种， 其中猪 蓝耳病、 猪伪狂犬病、 圆环病毒等疫病均对我国的养猪业造成了较大影响。 2004年以来全球 蔓延爆发的高致病性禽流感疫情更是对我国养禽业发展构成了严重挑战。 近十年来， 虽然 我国畜牧业的产值平均以10的速度增长， 但是因疫病造成的畜禽。
10、死亡率， 比西方国家至 少高出1倍多， 严重制约了现代畜牧产业的发展。 如猪传染性疫病中因呼吸道引起的疾病特 别突出， 发病率达3060， 死亡率达530。 而疫苗发展是积极有效防控动物疫病 的策略之一。 0003 目前已发展的动物疫苗包括活疫苗(弱毒疫苗、 基因缺失疫苗、 载体疫苗和病毒抗 体复合物疫苗)和灭活疫苗(灭活病毒疫苗、 化学合成疫苗、 分泌抗原疫苗、 基因工程亚单位 疫苗、 抗独特型抗体疫苗和免疫复合体疫苗)。 随着生物技术的快速发展， 一些新型疫苗不 断研制成功， 推动了免疫佐剂研制的发展。 免疫佐剂是指先于抗原或与抗原同时， 或与抗原 混合后注射动物， 能非特异性增强机体对抗。
11、原免疫应答的物质。 目前， 在兽用疫苗中应用和 发展的佐剂包括化学类免疫佐剂(如氢氧化铝、 弗氏佐剂、 矿物油、 水花生油乳剂、 吐温-80、 司盘、 左旋咪唑和脂质体等)、 微生物类免疫佐剂(如分枝杆菌、 BCC、 脂多糖、 胞壁酰二肽、 胞 肽、 脂溶性蜡质D和短小棒状杆菌)、 植物类免疫佐剂(如茯苓多糖、 红花多糖、 酵母多糖、 香 菇多糖和中草药类等)、 生化类免疫佐剂(如胸腺肽、 转移因子、 白细胞介素、 干扰素和肿瘤 坏死因子等)、 抗生素类免疫佐剂(如红霉素和伊维菌素)， 聚合物微球载体、 硒、 维生素(如 维生素E、 D、 C)免疫刺激复合物(1SCOMS)等也在作为免疫佐剂被。
12、研究。 0004 在众多佐剂中， 矿物油佐剂是兽用疫苗尤其是禽类疫苗中应用最多的佐剂。 以矿 物油为佐剂的疫苗制剂中， 通过乳化过程将抗原包覆于油滴中， 油滴发挥了抗原储库作用， 在注射部位持续释放抗原， 防止抗原从注射部位的快速清除， 诱导高效、 持续的免疫应答水 平。 因此， 油佐剂制剂中抗原在注射部位的释放行为是影响抗原特异性免疫应答强度、 水平 和持续时间的关键。 0005 抗原的释放行为与乳液的性质密切相关， 包括乳滴粒径大小、 乳液粒径分布和油 相组成等。 基于奥氏熟化理论， 乳液粒径分布的不同， 会导致其储存稳定性的差异， 粒径分 布越不均一， 越容易发生小粒径乳滴逐渐瓦解、 大。
13、粒径乳滴逐渐长大， 而大乳滴长大到一定 程度又会发生破裂， 因此在小液滴瓦解和大液滴长大的融合过程中， 伴随着抗原的释放； 而 乳滴尺寸越均一， 稳定性就越好。 由此可以看出， 粒径分布的差异会导致抗原释放行为的差 说 明 书 1/9 页 3 CN 105148266 B 3 异。 而这种差异会进一步导致体内免疫效果的差异。 本发明旨在兽用疫苗油佐剂疫苗制剂 中建立一种新型的乳液制备方法即快速膜乳化法， 制备粒径均一、 可控的油佐剂疫苗制剂， 克服传统高速搅拌、 均质乳化、 超声等方法制备的乳液粒径不均一、 不可控、 批次间重复性 不佳的问题； 同时， 在粒径均一的基础上获得高效、 持续的免疫。
14、应答效果。 发明内容 0006 本发明的目的在于提供一种尺寸均一、 可控、 免疫应答水平高、 免疫应答持久的W/ O型疫苗油佐剂制剂及其制备方法。 本发明提供的W/O型疫苗油佐剂制剂尺寸均一、 可控， 乳 液均一性的提高有利于乳滴稳定性增强， 奥氏熟化过程比传统方法制备的乳液更慢， 进而 使其在注射进体内后， 抗原突释低， 而后期抗原持续释放， 诱导快速、 高效、 持续的免疫应答 水平。 0007 为实现本发明的目的， 采用以下技术方案： 0008 在第一方面， 本发明提供一种W/O型疫苗油佐剂制剂， 所述制剂为W/O型乳液， 其中 水相为含有抗原的溶液， 油相包含白油、 乳化剂和稳定剂； 所。
15、述W/O型乳液的平均粒径在 0.1-8.22 m之间， 分散系数(PDI)小于0.1。 0009 本发明提供的乳滴尺寸均一、 可控的W/O型疫苗油佐剂制剂， 其乳滴的粒度分散系 数(PDI)小于0.1， 粒径在纳米级至微米级可控， 可有效提高储存稳定性并降低突释。 该均一 乳液可稳定储存6个月以上不发生分层， 抗原在前2天几乎不释放， 后期能持续释放4周或更 长时间。 0010 本发明中， 所述PDI的定义为： 多分散系数， 代表乳滴均匀分散的程度， 即粒度分布 系数。 该数值越小， 乳滴分布越均匀。 相反地， 该数值越大， 乳滴分布越宽泛。 一般认为PDI小 于0.1的乳液具有单分散性。 0。
16、011 作为本发明的优选方案， 所述W/O型乳液的平均粒径在0.59-8.22 m之间， 优选 0.59-5.0 m之间。 0012 作为本发明的优选方案， 所述抗原选自禽流感灭活病毒、 新城疫灭活病毒、 猪圆环 病毒和口蹄疫病毒中的1种或至少2种的组合。 需要说明的是， 这里列举的抗原仅是几种典 型但非限定性的实例， 本领域的技术人员应当理解本发明的W/O型疫苗油佐剂制剂及其制 备方法具有普适性， 可采用各种抗原。 0013 作为本发明的优选方案， 所述乳化剂为亲水亲油平衡值在3.56.0之间的表面活 性剂。 0014 优选地， 所述乳化剂选自Span60、 Span80和Span83中的1。
17、种或至少2种的组合。 需要 说明的是， 这里列举的乳化剂仅是几种典型但非限定性的实例， 本领域的技术人员应当理 解本发明的W/O型疫苗油佐剂制剂及其制备方法具有普适性， 可采用各种制备乳液常用的 乳化剂。 0015 作为本发明的优选方案， 所述稳定剂选自硬脂酸、 硬酯酸铝和单硬酯酸甘油酯中 的1种或至少2种的组合。 需要说明的是， 这里列举的稳定剂仅是几种典型但非限定性的实 例， 本领域的技术人员应当理解本发明的W/O型疫苗油佐剂制剂及其制备方法具有普适性， 可采用各种制备乳液常用的稳定剂。 0016 在第二方面， 本发明提供一种制备第一方面所述的W/O型疫苗油佐剂制剂的方法， 说 明 书 2。
18、/9 页 4 CN 105148266 B 4 包括以下步骤： 0017 (1)将含有抗原的溶液作为水相分散于包含白油、 乳化剂和稳定剂的油相中， 获得 W/O(油包水)型预乳液； 0018 (2)将所述W/O型预乳液转移至快速膜乳化的储料罐中， 在0.1-2.5MPa压力下过微 孔膜， 得到所述W/O型疫苗油佐剂制剂。 0019 本发明提供的乳滴尺寸均一、 可控的W/O型疫苗油佐剂制剂， 其粒径大小可通过所 选用的微孔膜的孔径实现控制， 其粒径均一性可通过过膜压力和过膜次数进行优化调控。 0020 上述制备方法中， 所述压力可在0.1-2.5MPa之间调节， 这主要由制备过程中使用 的微孔膜。
19、孔径的大小及目标乳液大小的制备要求所决定。 0021 作为本发明的优选方案， 所述步骤(1)中水相与油相的体积比为1:11:10。 在此 范围内形成的W/O型预乳液稳定性高， 利于下一步过微孔膜的操作。 0022 作为本发明的优选方案， 所述抗原选自禽流感灭活病毒、 新城疫灭活病毒、 猪圆环 病毒和口蹄疫病毒中的1种或至少2种的组合。 0023 优选地， 所述乳化剂为亲水亲油平衡值在3.56.0之间的表面活性剂。 0024 优选地， 所述乳化剂选自Span60、 Span80和Span83中的1种或至少2种的组合。 0025 优选地， 所述稳定剂选自硬脂酸、 硬酯酸铝和单硬酯酸甘油酯中的1种或。
20、至少2种 的组合。 0026 本发明的制备方法中， 所述预乳液粒径大小最好大于膜孔径， 预乳液的制备方法， 可通过均质乳化、 超声乳化、 机械搅拌或磁力搅拌等常规方法制备。 0027 本发明的制备方法中， 所述的微孔膜可选择选亲水性膜， 如玻璃膜、 聚碳酸酯膜、 纤维膜或陶瓷膜等。 在制备过程中， 可通过选择不同孔径的微孔膜来控制乳滴的粒径大小， 常用的微孔膜孔径为0.5-50 m， 更优选为0.8-9.2 m。 0028 本发明方法制备效率很高， 预乳液过膜时的流速大小高达10mls-1， 因而制备过 程大多瞬间完成。 0029 本发明的制备方法中， 所述的步骤(2)中过微孔膜可反复进行多次。
21、， 即将步骤(2) 所得的乳液作为预乳液用压力再次通过微孔膜， 直至得到的乳液的粒径大小与均一性满足 要求。 对于大多数体系而言， 过膜次数为3-5次。 0030 本发明的制备方法与现有技术相比， 具有如下特点： 0031 (1)本发明提供的乳滴粒径均一、 可控的油佐剂疫苗制剂制备方法， 均一的乳液不 仅储存稳定， 大大减慢奥氏熟化进程， 作为兽用疫苗制剂时， 有效降低抗原在注射部位前2 天的抗原释放， 而后期抗原持续稳定释放， 提升免疫应答水平和持续性。 0032 (2)本发明的W/O型疫苗油佐剂制剂， 乳滴尺寸均一、 可控， 分散系数(PDI)小于 0.1， 乳液稳定性好， 能够储存6个月。
22、以上； 抗原能持续释放4周或更长时间。 0033 (3)本发明的W/O型疫苗油佐剂制剂的制备方法， 可通过控制制备过程中的微孔膜 孔径大小和操作压力来控制产品的粒径大小和均一性。 0034 (4)本发明的W/O型疫苗油佐剂制剂的制备方法， 克服了现有技术制备的油佐剂乳 液制剂粒径不均一、 不可控的问题， 保证了批次间产品的可重复性， 特别是保障了抗原释放 的可控性。 0035 (5)本发明方法制备条件耗能低、 温和； 制备参数可控性强、 重现性好； 制备出的油 说 明 书 3/9 页 5 CN 105148266 B 5 佐剂乳液粒径均一、 可控， 利于大规模工业化生产。 0036 本发明的有。
23、益效果体现在： 针对兽用疫苗油佐剂乳液制剂， 提供一种乳滴尺寸均 一、 可控的乳液制备方法， 所制备的乳液制剂乳滴粒径分布窄， 储存稳定性显著提升， 同时， 可大大降低注射后在注射部位抗原的突释效应， 持续释放可达1个月之久， 体内免疫结果表 明， 均一油佐剂制剂可有效提升抗原特异性免疫应答水平和持续性。 附图说明 0037 下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。 0038 图1是本发明中快速膜乳化法制备乳液的装置和原理示意图。 0039 图2是实施例1中传统高速搅拌法制备的乳液显微镜照片。 0040 图3是实施例2中快速膜乳化法制备的乳液显微镜照片。 0041 图4是实施例1和实施例2所述。
24、的乳液粒径分布图。 0042 图5是实施例4中以BSA为模型抗原高速搅拌下制备的乳液的显微镜照片。 0043 图6是实施例5中以BSA为模型抗原快速膜乳化制备的乳液的显微镜照片。 0044 图7是实施例6所述的抗原体外释放行为结果图。 0045 图8是实施例7中抗原在注射部位的募集情况。 0046 图9是实施例8中不同乳液免疫后的新城疫的血凝抑制结果。 0047 图10是实施例9中不同乳液免疫后的禽流感的血凝抑制结果。 0048 图11是实施例10中不同乳液免疫后的新城疫的特异性抗体结果。 0049 图12是实施例11中不同乳液免疫后的禽流感的特异性抗体结果。 0050 图13是实施例12中的。
25、免疫后外周血中CD4-CD8+/CD4+CD8-的结果。 0051 图14是实施例12中不同乳液免疫后的外周血中CD4+CD8+比例。 具体实施方式 0052 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。 本领域技术人员将会理 解， 以下实施例仅为本发明的优选实施例， 以便于更好地理解本发明， 因而不应视为限定本 发明的范围。 0053 下述实施例中的实验方法， 如无特殊说明， 均为常规方法； 所用的实验材料， 如无 特殊说明， 均为自常规生化试剂厂商购买得到的。 0054 实施例1 0055 量取20mL含灭活新城疫和禽流感病毒的溶液， 作为水相(W)， 量取60mL含Span80和 稳。
26、定剂硬脂酸铝的白油作为油相(O)， 将油相加入至匀浆机中， 在3500转/分钟条件下， 将水 相(W)加入至油相(O)中， 均质匀浆3分钟， 随后， 将转数调整至10000转/分钟， 继续乳化5分 钟， 得到W/O型油佐剂鸡新城疫-禽流感二联疫苗制剂。 光学显微镜照片如图2所示， 结果表 明所制备的乳液中有较大的液滴； 所制备的乳液进行粒径和粒径分布的测定， 采用带有粒 径分析功能的ZetaPlus测定， 用移液管取1滴上述制备的乳液加入至1mL的油相中， 将其转 移至ZetaPlus的样品池中， 采用ZetaPlus仪进行乳液粒径与粒径分布的测定， 结果如图4所 示， 结果表明， 传统高速搅。
27、拌制备的乳液平均粒径为2.226 m， 粒径分布系数PDI为0.187， 粒 径分布较宽。 所制备乳液在常温下储存7个月后分层， 在低温下储存12个月后分层， 在高温 说 明 书 4/9 页 6 CN 105148266 B 6 (40下)储存3个月后分层。 0056 实施例2 0057 采用孔径为2.8 m的微孔膜制备含鸡新城疫-禽流感二联疫苗的油佐剂制剂， 量取 20mL含灭活新城疫和禽流感病毒的溶液， 作为水相(W)， 量取60mL含Span80和稳定剂硬脂酸 铝的白油作为油相(O)， 将水相(W)在机械搅拌下倒入油相(O)中， 低速搅拌制备W/O预乳液， 随后， 将此预乳液转至快速膜乳。
28、化的储料罐中， 在0.45MPa的氮气压力下， 反复过膜3次， 得 到的W/O型油佐剂疫苗制剂。 光学显微镜照片如图3所示， 结果表明所制备的乳液粒径均一 性好； 所制备的乳液进行粒径和粒径分布的测定， 采用带有粒径分析功能的ZetaPlus测定， 用移液管取1滴上述制备的乳液加入至1mL的油相中， 将其转移至ZetaPlus的样品池中， 采 用ZetaPlus仪进行乳液粒径与粒径分布的测定。 结果如图4所示， 结果表明， 快速膜乳化制 备的乳液平均粒径为2.446 m， 粒径分布系数PDI为0.057， 与实施例1中高速搅拌制备的乳 液相比， 粒径均一性更佳。 所制备乳液在常温下储存12个月。
29、不分层， 在低温下储存18个月后 不分层， 在高温(40下)储存6个月后不分层。 0058 实施例3 0059 由于所用的鸡新城疫-禽流感灭活病毒疫苗未经纯化， 很难进行抗原量的准确定 量， 导致无法进行抗原体外释放行为研究。 为此， 采用牛血清白蛋白(BSA)为模型抗原， 进行 乳液制备， 进行抗原体外释放行为研究。 精确称取一定量的BSA， 将其溶于一定体积的去离 子水中， 配制浓度为500mg/mL的BSA溶液， 量取20mL的BSA溶液作为水相(W)， 量取60mL含 Span80的白油和稳定剂硬脂酸铝作为油相(O)， 将油相加入至匀浆机中， 在3500转/分钟条 件下， 将水相(W)。
30、加入至油相(O)中， 均质匀浆3分钟， 随后， 将转数调整至10000转/分钟， 继 续乳化5分钟， 得到W/O型油佐剂鸡新城疫-禽流感二联疫苗制剂。 其平均粒径和粒径分布采 用带有粒径分析功能的ZetaPlus测定纳， 其平均粒径为2.312 m， 粒径分布系数PDI为 0.198， 光学显微镜照片如图5所示， 结果表明所制备的乳液中有较大的液滴， 粒径分布比较 宽。 0060 实施例4 0061 由于所用的鸡新城疫-禽流感灭活病毒疫苗未经纯化， 很难进行抗原量的准确定 量， 导致无法进行抗原体外释放行为研究。 为此， 采用牛血清白蛋白(BSA)为模型抗原， 进行 乳液制备， 进行抗原体外释。
31、放行为研究。 同样采用孔径为2.8 m的微孔膜进行乳液制备。 精 确称取一定量的BSA， 将其溶于一定体积的去离子水中， 配制浓度为500mg/mL的BSA溶液， 量 取20mL的BSA溶液作为水相(W)， 量取60mL含Span80和稳定剂硬脂酸铝的白油作为油相(O)， 将水相(W)在机械搅拌下倒入油相(O)中， 低速搅拌制备W/O预乳液， 随后， 将此预乳液转至 快速膜乳化的储料罐中， 在0.45MPa的氮气压力下， 反复过膜3次， 得到的W/O型油佐剂疫苗 制剂。 其平均粒径和粒径分布采用带有粒径分析功能的ZetaPlus测定纳， 其平均粒径为 2.458 m， 粒径分布系数PDI为0.。
32、060， 光学显微镜照片如图6所示， 结果表明所制备的乳液粒 径分布窄， 粒径均一性好。 0062 实施例5 0063 分别精确量取实施例3和实施例4中所制备的含模型抗原BSA的乳液1mL， 将其加入 至透析袋中， 两端封好， 将其置于140mL含0.01M磷酸盐的等渗缓冲液(pH7.2)中， 在37的 恒温摇床中进行抗原释放， 在预先设定的时间点， 从透析袋外的缓冲液中取样400 L， 同时， 说 明 书 5/9 页 7 CN 105148266 B 7 补加新鲜的磷酸盐缓冲液确保总体积不变， 取样至第20天； 采用微量BCA法测定样品中BSA 蛋白含量， 进而计算各时间点的蛋白累积释放量，。
33、 并以时间作图， 得到不同方法乳液中蛋白 的释放行为曲线。 结果如图7所示， 从图中可以看出， 在前2天， 传统高速搅拌制备的乳液， 抗 原突释比较高， 达20左右， 而快速膜乳化制备的乳液则几乎没有抗原的释放， 第3天仅有 3的抗原发生了释放。 0064 实施例6 0065 采用Balb/c小鼠(雌性， 6-8周)开展注射部位免疫细胞募集实验， 实验分两组， 即 高速搅拌制备的乳液与快速膜乳化制备的乳液， 每组6只， 以实施例3和实施例4中制备的乳 液进行免疫实验， 免疫剂量为100 L乳液/只， 其中含有BSA量为10 g， 采用皮下注射方式免 疫。 在预先设定的时间点， 将免疫后的小鼠处。
34、死， 取下注射部位的皮肤及其皮下组织， 将其 用pH7.4的磷酸盐缓冲液彻底冲洗， 并剪成小块儿。 将这些组织用酶消化后过细胞筛， 得到 单细胞悬液。 将此单细胞悬液采用流失抗体Ly6C-APC、 CD11b-eFlour450、 Ly6G-FITC、 CD11c-APC-Cy7和F4/80-PE进行染色， 上流式细胞仪进行免疫细胞募集情况分析。 结果如图 8所示， 结果表明， 高速搅拌制备的油佐剂疫苗制剂和快速膜乳化法制备的油佐剂疫苗制剂 在注射部位对免疫细胞募集具有相似的结果趋势， 其中， 中性粒细胞NPh在注射后24-48h达 到峰值， 单核细胞Mo和巨噬细胞MPh在注射后48h达到峰值。
35、， 树突状细胞DC在注射后72h达到 峰值， 通常认为， DC是体内最强大的抗原提呈细胞， 因此， 认为72h之前释放的抗原大部分没 有被DC所摄取发挥免疫应答功能， 只有72h及其之后释放的抗原才能被最大程度加工、 呈 递， 并最终发挥提升免疫应答的功能。 0066 实施例7 0067 以7-10日龄的雌性SPF鸡(female White Leghorn chickens)开展免疫实验， 共分 4组， 每组10只， 采用皮下注射免疫方式。 实验组分别取实施例1和实施例2中所制备的油佐 剂疫苗制剂对SPF鸡进行免疫， 免疫剂量分别为250 L/只； 对照组1为无油佐剂组， 即每只鸡 各免疫3。
36、1 L的新城疫(NDV)和禽流感(AIV)的抗原溶液； 对照组2为不免疫组。 免疫后分别于 第10、 15、 22和28天取血， 用于新城疫和禽流感血凝抑制抗体检测。 抗新城疫抗原的HI滴度 结果如图9所示， 结果表明， 第10天时， 膜乳化制备的油佐剂疫苗能够诱导显著高于高速搅 拌组的HI抗体滴度， 而后续15天、 22天和28天， 两者诱导了相似的HI抗体滴度， 表明快速膜 乳化制备的油佐剂疫苗制剂能够诱导更快和更强的体液免疫应答水平。 0068 实施例8 0069 以7-10日龄的雌性SPF鸡(female White Leghorn chickens)开展免疫实验， 共分 4组， 每组。
37、10只， 采用皮下注射免疫方式。 实验组分别取实施例1和实施例2中所制备的油佐 剂疫苗制剂对SPF鸡进行免疫， 免疫剂量分别为250 L/只； 对照组1为无油佐剂组， 即每只鸡 各免疫31 L的新城疫(NDV)和禽流感(AIV)的抗原溶液； 对照组2为不免疫组。 免疫后分别于 第10、 15、 22和28天取血， 用于新城疫和禽流感血凝抑制抗体检测。 抗禽流感抗原的HI滴度 结果如图10所示， 结果表明， 在第10天和第22天， 膜乳化制备的油佐剂疫苗能够诱导显著高 于高速搅拌组的HI抗体滴度， 而在第15天和第28天， 两者诱导了相似的HI抗体滴度， 表明快 速膜乳化制备的油佐剂疫苗制剂能够。
38、诱导更快和更强的体液免疫应答水平。 0070 实施例9 0071 以7-10日龄的雌性SPF鸡(female White Leghorn chickens)开展免疫实验， 共分 说 明 书 6/9 页 8 CN 105148266 B 8 4组， 每组10只， 采用皮下注射免疫方式。 实验组分别取实施例1和实施例2中所制备的油佐 剂疫苗制剂对SPF鸡进行免疫， 免疫剂量分别为250 L/只； 对照组1为无油佐剂组， 即每只鸡 各免疫31 L的新城疫(NDV)和禽流感(AIV)的抗原溶液； 对照组2为不免疫组。 免疫后分别于 第10、 15、 22和28天取血， 用于抗原特异性抗体IgG的检测。。
39、 结果如图11所示， 结果表明， 快速 膜乳化制备的油佐剂疫苗制剂诱导的特异性抗体水平在各时间点均显著高于高速搅拌制 备的油佐剂疫苗制剂， 进一步证实， 快速膜乳化制备的均一乳液能够诱导更强的体液免疫 应答水平。 0072 实施例10 0073 以7-10日龄的雌性SPF鸡(female White Leghorn chickens)开展免疫实验， 共分 4组， 每组10只， 采用皮下注射免疫方式。 实验组分别取实施例1和实施例2中所制备的油佐 剂疫苗制剂对SPF鸡进行免疫， 免疫剂量分别为250 L/只； 对照组1为无油佐剂组， 即每只鸡 各免疫31 L的新城疫(NDV)和禽流感(AIV)的。
40、抗原溶液； 对照组2为不免疫组。 免疫后分别于 第10、 15、 22和28天取血， 用于抗原特异性抗体IgG的检测。 结果如图12所示， 结果表明， 快速 膜乳化制备的油佐剂疫苗制剂诱导的特异性抗体水平在第10天、 第22天和第28天均高于高 速搅拌制备的油佐剂疫苗制剂， 进一步证实， 快速膜乳化制备的均一乳液能够诱导更强的 体液免疫应答水平。 0074 实施例11 0075 提取免疫后的鸡外周血， 并分离获得外周血淋巴细胞， 采用流式抗体RPE-CD4和 CY5-CD8分别标记CD4和CD8， 避光、 4下孵育30min； 染色完毕后， 上流式细胞仪进行CD4+和 CD8+细胞定量检测。 。
41、免疫后外周血中CD4-CD8+/CD4+CD8-的结果如图13所示， 结果表明， 免疫 油乳剂后， 外周血中CD8+/CD4+显著高于纯抗原组， 表明通过免疫油乳剂能够有效提高免疫 系统的活化水平。 通过对比膜乳化技术制备的油乳剂与常规方法制备的油乳剂发现， 快速 膜乳化技术制备的油乳剂能够诱导产生更高的CD8+/CD4+， 该结果也可表明与常规高速搅拌 方法制备的油乳剂相比， 快速膜乳化技术制备的油乳剂能够诱导产生更强的免疫活化。 不 同乳液免疫后的外周血中CD4+CD8+比例结果如图14所示， 结果表明， 在鸡外周血中存在着 CD4+CD8+双阳性的细胞(DP T细胞)， 研究表明， 这些。
42、双阳性细胞为抗原特异性记忆细胞， 能 够产生疫苗诱导的记忆性免疫应答。 外周循环DP T细胞是一种独特的T细胞群， 是成熟的记 忆细胞,具有典型的CD4+和CD8+T细胞功能。 由图14可明显看出， 免疫快速膜乳化技术制备的 油乳剂后， 外周血中DP T细胞的比例显著高于常规高速搅拌方法制备的油乳剂组， 表明快 速膜乳化技术的油乳剂能够诱导更高水平的免疫应答。 0076 实施例12 0077 采用孔径为2.8 m的微孔膜制备含猪圆环病毒疫苗的油佐剂制剂， 量取60mL含猪 圆环病毒的溶液， 作为水相(W)， 量取60mL含Span60(1.0)和稳定剂硬脂酸(0.5)的白油 作为油相(O)， 。
43、将水相(W)在机械搅拌下倒入油相(O)中， 低速搅拌制备W/O预乳液， 随后， 将 此预乳液转至快速膜乳化的储料罐中， 在0.45MPa的氮气压力下， 反复过膜3次， 得到平均粒 径为2.22 m、 PDI值为0.059的均一W/O型油佐剂疫苗制剂。 免疫后在7、 14、 35天的抗体水平 均高于高速搅拌法制备的不均一乳液(平均高出0.6个滴度)。 0078 实施例13 0079 采用孔径为2.8 m的微孔膜制备含猪圆环病毒疫苗的油佐剂制剂， 量取10mL含猪 说 明 书 7/9 页 9 CN 105148266 B 9 圆环病毒的溶液， 作为水相(W)， 量取60mL含乳化剂Span83(0。
44、.8)和稳定剂单硬脂酸甘油 酯(1.0)的白油作为油相(O)， 将水相(W)在机械搅拌下倒入油相(O)中， 低速搅拌制备W/O 预乳液， 随后， 将此预乳液转至快速膜乳化的储料罐中， 在0.45MPa的氮气压力下， 反复过膜 3次， 得到平均粒径为2.19 m、 PDI值为0.052的均一W/O型油佐剂疫苗制剂。 免疫后在7、 14、 35天的抗体水平均高于高速搅拌法制备的不均一乳液(平均高出0.4个滴度)。 0080 实施例14 0081 采用孔径为2.8 m的微孔膜制备含猪圆环的油佐剂制剂， 量取6mL含猪圆环病毒的 溶液， 作为水相(W)， 量取60mL含乳化剂Span60和Span83。
45、及稳定剂硬脂酸和单硬脂酸甘油脂 的白油作为油相(O)， 将水相(W)在机械搅拌下倒入油相(O)中， 低速搅拌制备W/O预乳液， 随 后， 将此预乳液转至快速膜乳化的储料罐中， 在0.45MPa的氮气压力下， 反复过膜3次， 得到 平均粒径为2.28 m、 PDI值为0.053的均一W/O型油佐剂疫苗制剂。 免疫后在7、 14、 35天的抗 体水平均高于高速搅拌法制备的不均一乳液(平均高出0.2个滴度)。 0082 实施例15 0083 采用孔径为0.5 m的微孔膜制备含口蹄疫病毒疫苗的油佐剂制剂， 量取20mL含灭 活口蹄疫病毒的溶液， 作为水相(W)， 量取60mL含乳化剂Span83(0.。
46、2)和稳定剂单硬脂酸 甘油酯(2.0)的白油作为油相(O)， 将水相(W)在机械搅拌下倒入油相(O)中， 低速搅拌制 备W/O预乳液， 随后， 将此预乳液转至快速膜乳化的储料罐中， 在1.00MPa的氮气压力下， 反 复过膜3次， 得到平均粒径为0.59 m、 PDI值为0.058的均一W/O型油佐剂疫苗制剂。 免疫后在 7、 28、 35天的抗体水平均高于高速搅拌法制备的不均一乳液(平均高出0.3个滴度)。 0084 实施例16 0085 采用孔径为9.2 m的微孔膜制备含口蹄疫病毒疫苗的油佐剂制剂， 量取20mL含灭 活口蹄疫病毒的溶液， 作为水相(W)， 量取60mL含乳化剂(0.6)S。
47、pan83和稳定剂单硬脂酸 甘油酯(2.0)的白油作为油相(O)， 将水相(W)在机械搅拌下倒入油相(O)中， 低速搅拌制 备W/O预乳液， 随后， 将此预乳液转至快速膜乳化的储料罐中， 在0.15MPa的氮气压力下， 反 复过膜3次， 得到平均粒径为8.22 m、 PDI值为0.072的均一W/O型油佐剂疫苗制剂。 免疫后在 7、 28、 35天的抗体水平均高于高速搅拌法制备的不均一乳液(平均高出0.15个滴度)。 0086 实施例17 0087 采用孔径为2.8 m的微孔膜制备含猪蓝耳病病毒疫苗的油佐剂制剂， 量取30mL含 灭活猪蓝耳病病毒的溶液， 作为水相(W)， 量取60mL含乳化剂。
48、Span83和稳定剂单硬脂酸甘油 酯的白油作为油相(O)， 将水相(W)在机械搅拌下倒入油相(O)中， 低速搅拌制备W/O预乳液， 随后， 将此预乳液转至快速膜乳化的储料罐中， 在0.45MPa的氮气压力下， 反复过膜5次， 得 到平均粒径为2.32 m、 PDI值为0.060的均一W/O型油佐剂疫苗制剂。 免疫后在10、 28、 42天的 抗体水平均高于高速搅拌法制备的不均一乳液(平均高出0.8个滴度)。 0088 实施例18 0089 采用孔径为2.8 m的微孔膜制备含猪蓝耳病病毒疫苗的油佐剂制剂， 量取6mL含灭 活猪蓝耳病病毒的溶液， 作为水相(W)， 量取60mL含乳化剂Span83和稳定剂单硬脂酸甘油酯 的白油作为油相(O)， 将水相(W)在机械搅拌下倒入油相(O)中， 低速搅拌制备W/O预乳液， 随 后， 将此预乳液转至快速膜乳化的储料罐中， 在0.45MPa的氮气压力下， 反复过膜3次， 得到 平均粒径为2.21 m、 PDI值为0.050的均一W/O型油佐剂疫苗制剂。 免疫后在10、 28、 42天的抗 说 明 书 8/9 页 10 CN 105148266 B 10 体水平均高于高速搅拌法制备的不均一乳液(平均高出0.3个滴度)。 0090 实施例19 0091 采用孔径为2.8 m的微孔膜制备含猪蓝耳病病毒疫苗的油佐剂制剂， 量取2。