Α蒎烯、Β蒎烯、1,8桉叶油醇、莰烯中一种以上在制备人血管内皮细胞损伤药物的应用.pdf

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1、10申请公布号CN104127394A43申请公布日20141105CN104127394A21申请号201410335806622申请日20140715A61K31/015200601A61K31/047200601A61P9/12200601A61P9/10200601A61P13/12200601A61P3/10200601A61P9/0020060171申请人沈祥春地址550004贵州省贵阳市云岩区北京路九号贵阳医学院申请人陶玲72发明人沈祥春陶玲张彦燕令狐克刚张小金74专利代理机构杭州新源专利事务所普通合伙33234代理人李大刚孙玉英54发明名称蒎烯、蒎烯、1,8桉叶油醇、莰烯中一种。

2、以上在制备人血管内皮细胞损伤药物的应用57摘要本发明提供一种蒎烯、蒎烯、1,8桉叶油醇、莰烯中的一种或一种以上在制备治疗人血管内皮细胞损伤的药物的应用。本发明可以有效提高内皮细胞存活率，从而具有制备治疗人血管内皮细胞损伤的药物的新用途。51INTCL权利要求书1页说明书9页附图1页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书9页附图1页10申请公布号CN104127394ACN104127394A1/1页21蒎烯、蒎烯、1,8桉叶油醇、莰烯中的一种或一种以上在制备治疗人血管内皮细胞损伤的药物的应用。2根据权利要求1所述的蒎烯、蒎烯、1,8桉叶油醇、莰烯中的一种或一种以上。

3、在制备治疗人血管内皮细胞损伤的药物的应用，其特征在于是在制备治疗人血管内皮细胞损伤导致的高血压、冠心病、慢性肾衰、外周血管疾病、糖尿病或慢性肾衰的药物的应用。权利要求书CN104127394A1/9页3蒎烯、蒎烯、1,8桉叶油醇、莰烯中一种以上在制备人血管内皮细胞损伤药物的应用0001技术领域0002本发明涉及蒎烯、蒎烯、1,8桉叶油醇、莰烯中的一种或一种以上在制备治疗人血管内皮细胞损伤的药物的应用，属于制药领域。背景技术0003心血管系统疾病（CARDIOVASCULARDISEASE,CVD）如高血压、糖尿病导致的心血管系统损伤，动脉粥样硬化，心肌梗死，心绞痛，风湿性心脏病等是心血管疾病的。

4、常见疾病，已成为严重危害人类健康、引起死亡的主要疾病，同时也是老年人认知功能障碍和情感障碍的重要原因之一。我国为CVD高发国家，CVD年发病率为185219/10万,估计每年有200万新发CVD病例,有150万人死于CVD,有CVD存活者700万人。CVD是我国人口死亡的第一位原因，2/3的CVD患者死亡或遗留不同程度的残疾,给国家和家庭造成巨大的经济负担。据估计每年CVD的治疗费用约150亿元人民币。0004内皮细胞（VASCULARENDOTHELIALCELL,VEC）作为人体最大的器官，在维持血管稳态功能中起重要作用。整个血管的内表面由一层内皮细胞所覆盖，是构成血管通透性的主要屏障，并。

5、能合成和分泌调节凝血纤溶系统的物质、调节血管张力的因子以及细胞因子等，在血管张力、血管形成及炎症反应中起有重要作用。血管内皮细胞层不仅是血液与组织间的屏障，而且是十分活跃的代谢及内分泌器官，血管内皮细胞结构和功能的改变在心血管疾病的发生发展中起十分重要的作用。据文献报道，心血管疾病的发生与炎性反应的产生有着密切的联系。炎性反应细胞因子包括TNF、IL、TXA2、ANG、IFN、细胞集落因子等，血管内皮细胞炎症反应是各种心血管疾病发生、发展过程中的一个关键组成部分，是其共同的病理生理学基础。当血管内皮细胞受到损伤时，除了引起血管壁的损伤外，更重要的是内分泌功能的失调，使其分泌的多种活性物质及相关。

6、因子之间的平衡被打破，从而导致心血管系统功能的障碍。控制炎性反应的机制十分复杂，体外亦具有诸多的影响因素，其作用过程包含许多环节。因此，开展血管内皮细胞损伤保护作用的研究，对降低心血管系统的危险因素及心脑血管系统疾病的预防、治疗和愈后具有非常重要的意义，目前已成为心脑血管疾病研究的新热点。0005研究表明，机体组织NO含量的变化直接影响内皮功能，从而导致原发性高血压、冠状动脉粥样硬化、心肌缺血再灌注损伤、充血性心力衰竭等许多心血管疾病。NO是由一氧化氮合酶NOS从L精氨酸合成的自由基，是一种高反应的小分子。NO执行重要的生物功能，包括扩张血管、抗血小板聚集、抑制平滑肌细胞增殖等。内皮细胞存在有。

7、两种一氧化氮合酶，即INOS和ENOS。一氧化氮合酶是NO产生过程中的限速酶，因此NOS的酶活性及其表达量直接影响到NO的产量。在正常人血管内皮细胞中ENOS表达较多，INOS表达较少，而病理情况下则相反。核转录因子NFB在体内存在于胞浆中，被激活后进入细胞核与TNF说明书CN104127394A2/9页4等促炎细胞因子、INOS等基因的位点结合，启动多种炎性基因的转录和翻译过程，导致持续或放大的炎症反应。从而导致内皮功能炎性损伤，诱发包括高血压、冠心病、慢性肾衰、外周血管疾病、糖尿病及慢性肾衰等一系列心脑血管疾病。基于上述理想，如何发明一种制备治疗人血管内皮细胞损伤的药物应用，成为了业界亟待。

8、解决的课题。发明内容0006本发明的目的在于，提供一种蒎烯、蒎烯、1,8桉叶油醇、莰烯中的一种或一种以上在制备治疗人血管内皮细胞损伤的药物的应用。本发明可以有效提高内皮细胞存活率，从而具有制备治疗人血管内皮细胞损伤的药物的新用途。0007为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案如下蒎烯、蒎烯、1,8桉叶油醇、莰烯中的一种或一种以上在制备治疗人血管内皮细胞损伤的药物的应用。0008上述的蒎烯、蒎烯、1,8桉叶油醇、莰烯中的一种或一种以上在制备治疗人血管内皮细胞损伤的药物的应用，是在制备治疗人血管内皮细胞损伤导致的高血压、冠心病、慢性肾衰、外周血管疾病、糖尿病或慢性肾衰的药物的应用。0009与现有。

9、技术相比，本发明可以有效提高内皮细胞存活率，具有制备治疗人血管内皮细胞损伤的药物的新用途。00101、以下为本发明的药效研究实验11LPS的配制将01GLPS粉末溶于20ML09的氯化钠注射液中，配成终浓度为5MG/ML的母液，过滤除菌后20冰箱中保存，临用时用氯化钠注射液稀释成所需浓度。001112蒎烯、蒎烯、1,8桉叶油醇和莰烯标准品均可从市场购得。001213蒎烯试液的配制取标准品10L，加DMSO定容至10ML，配成浓度为098MG/ML的母液，过滤除菌常温避光保存，临用时用无血清的DMEM培养基稀释成所需浓度（0371G/L）。001314蒎烯试液的配制取标准品10L，加DMSO定容。

10、至10ML，配成浓度为098MG/ML的母液，过滤除菌常温避光保存，临用时用无血清的DMEM培养基稀释成所需浓度（0202G/L）。0014151,8桉叶油醇试液的配制取标准品10L，加DMSO定容至10ML，配成浓度为099MG/ML的母液，过滤除菌常温避光保存，临用时用无血清的DMEM培养基稀释成所需浓度（0438G/L）。001516莰烯试液的配制称取标准品01G，加DMSO溶解并定容至10ML，配成浓度为10MG/ML，过滤除菌常温避光保存，临用时用无血清的DMEM培养基稀释成所需浓度（0405G/L）。00162实验方法21HUVECS的复苏HUVECS购于美国SCIENCELL公司。

11、，北京裕恒丰国内代理公司。从超低温冰箱中取出冻存的HUVECS，立即放入37水浴中迅速解冻。显微镜下进行细胞计数（1105个/ML）后，以13的比例将细胞悬液转入3个25CM2细胞培养瓶，每瓶加25MLECM，平晃使其均匀铺满瓶底。放入37，饱和湿度，5CO2的培养箱中培养，次日换液一次。说明书CN104127394A3/9页5001722HUVECS的传代待细胞生长融合成单层细胞后，弃掉培养液，用无菌PBS缓冲液洗涤两次，每次3ML。加入1ML025胰蛋白酶，置倒置显微镜下观察，当细胞回缩变圆后，迅速加入12ML中和液终止消化，用吸管吹打制成细胞悬液，常温1500R/MIN离心56MIN弃上。

12、清，加入6MLECM按13比例将细胞悬液接种于培养瓶，置37，饱和湿度，5CO2培养箱中培养。001823HUVECS的冻存待细胞长满后，胰酶消化法收集第3代对数生长期细胞，显微镜下细胞计数（1105个/ML）后，1500R/MIN离心56MIN。弃上清，每管加入15ML冻存液，混匀后转移至冻存管内，采取梯度冷冻先置于430MIN、再201H、后置于80长期保存。24药效研究实验241实验分组实验分成六个组空白组（CONTROLDOSE，CONTR）、LPS模型组（MODELDOSE，LPS）、蒎烯组、蒎烯组、1,8桉叶油醇组和莰烯组。0019242苏木素伊红染色（HE染色）将形态完好的细胞接。

13、种到6孔板内，长满后按上述分组加药，LPS孵育12H后，取出PBS浸洗3次，每次5分钟，加4的多聚甲醛固定15MIN，弃去多聚甲醛，PBS浸洗3次，每次5分钟，待孔内干燥后，加苏木精染液染色1520MIN，PBS浸洗3次，每次5分钟，HCL乙醇（75乙醇配制1HCL）分化30秒，PBS浸洗3次，每次5分钟，95乙醇润洗5秒，伊红染液染色（510）分钟，70乙醇洗2次。镜检着色满意后观察细胞，拍照。0020243四氮唑盐法（MTT）分析细胞存活率取生长良好的传代培养的HUVECS，制成细胞悬液，以每孔1104个接种于96孔培养板（每孔100L），培养至细胞基本融合，换成无血清的DMEM培养液继续。

14、培养24H，使细胞同步化。每孔分别加入上述配置好的各种药物，继续培养12H，再加入MTT（5MG/ML）20L，继续孵育4H，终止培养。小心吸去孔内培养液，每孔加入150L二甲基亚砜，低速震荡10MIN，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490NM波长处测量各孔吸光值，结果以OD值表示。细胞存活率实验组OD值/对照组OD值100。0021244乳酸脱氢酶（LDH）的测定将HUVECS经过上述分组给药处理后，收集24孔板培养液，吸出培养液，20冰箱保存，备测。00221分析原理LDH能够催化乳酸生成丙酮酸，丙酮酸与2，4二硝基苯肼反应在碱性环境下形成棕红色苯腙化合物，在440NM波长测定，通过比。

15、色求出酶的活力。00232分析方法根据试剂盒说明书完成。取样说明书CN104127394A4/9页6混匀，室温放置3分钟，440NM蒸馏水调零1CM光径测各管吸光度，根据公式计算LDH活力。0024计算公式245NO的测定将内皮细胞经过上述分组给药处理后，用规格为15ML的无菌管收集96孔板培养液，吸出培养液，于20冰箱冷冻保存，备测。00251分析原理NO化学性质活泼，在体内很快代谢成NO2和NO3，而NO2又进一步转化成NO3，本法利用硝酸还原酶特异性将NO3还原成NO2，通过显色深浅测定其浓度的高低。00262分析方法根据试剂盒说明书完成。0027显色剂的配制试剂三试剂四试剂五2511前。

16、处理取96孔板内上清液（100L）试剂一（200L）混匀。然后加入试剂二（100L），漩涡混匀，静置10MIN。35004000R/MIN,离心15MIN，取上清液160L进行以下操作。0028取样空白组标准管测定管双蒸水（ML）01620MOL/LNANO2标准液（ML）016上清液（ML）016显色剂（ML）008008008混匀，室温静置10分钟，蒸馏水调零，550NM，1CM光径，测各管吸光值。0029计算公式25单成分基础研究实验251单成分分析实验取生长良好的传代培养的HUVECS，制成细胞悬液，以每孔1104个接种于96孔培养板（每孔100L），培养至细胞基本融合，换成无血清的D。

17、MEM培养液继续培养24H，使细胞同步化。实验按照表1分成7个组，除模型组外，其余各组给予相应药液作用1H后，再用LPS复说明书CN104127394A5/9页7制HUVECS炎性损伤细胞模型。加入MTT（5MG/ML）20L，继续孵育4H，终止培养。小心吸去孔内培养液，每孔加入150L二甲基亚砜，低速震荡10MIN，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490NM波长处测量各孔吸光值，结果以OD值表示。0030表1单成分分析实验分组TAB1THEGROUPOFSINGLECOMPONENTANALYSISEXPERIMENT空白组模型组1,8桉叶油醇莰烯蒎烯蒎烯15G/ML0438G/L0405。

18、G/L0202G/L0371G/L252正交试验为筛选主要活性物质,对4个主要因素蒎烯、蒎烯、1,8桉叶油醇、莰烯采用244项下实验方法进行了L827正交试验，见表2。0031表2正交试验因素水平TAB2FACTORANDLEVELOFORTHOGONALTEST水平蒎烯蒎烯1,8桉叶油醇莰烯1有有有有2无无无无252单成分不同浓度MTT实验将蒎烯、蒎烯、1,8桉叶油醇、莰烯含量配成2倍、10倍、50倍浓度，然后根据244项下实验方法测定OD值，246项下实验法测定培养上清NO含量。0032表3四种成分不同倍数浓度TAB3DIFFERENTCONCENTRATIONSOF4SINGLECOMP。

19、ONENTS药物2倍浓度10倍浓度50倍浓度蒎烯0742G/L371G/L1855G/L蒎烯0404G/L202G/L101G/L1,8桉叶油醇0876G/L438G/L219G/L莰烯081G/L405G/L2025G/L26实验数据的统计处理所有数据用SPSS200软件进行统计学处理，数据以均数标准差表示。采用STUDENTT检验（TTEST），P1,8桉叶油醇蒎烯蒎烯。上述正交试验中试验号27都是直接代表了2种活性成分混合的实验例，它的原理是4种化合物不同的两两及以上混合的考察，从正交试验的原理上来说可以体现2中以上不同的混合方式。0040（6）单成分不同浓度实验表9单成分不同浓度实验结。

20、果GROUPCONCENTRATIONOD490NO570CONTRNSFREESERUMDMEM0153001618947126318LPSLPS15G/MLFREESERUMDMEM0128000911557730450蒎烯LPS15G/ML蒎烯0742G/L01454000211904524237LPS15G/ML蒎烯371G/L01475000813073428641LPS15G/ML蒎烯1855G/L01540000313983026407蒎烯LPS15G/ML蒎烯0404G/L01495000911747226481LPS15G/ML蒎烯202G/L0151800041123156。

21、24178LPS15G/ML蒎烯101G/L015400114125240234781,8桉叶油醇LPS15G/ML1,8桉叶油醇0876G/L01710004913928425413LPS15G/ML1,8桉叶油醇438G/L017750008915395427563LPS15G/ML1,8桉叶油醇219G/L0181000915501028423莰烯LPS15G/ML莰烯081G/L0179001014377728451LPS15G/ML莰烯405G/L01797000815051723423LPS15G/ML莰烯2025G/L018300051752292945由表9可知不同浓度的蒎烯、。

22、蒎烯、1,8桉叶油醇或莰烯按各组可以减轻LPS诱导的HUVECS损伤。0041附图说明0042图1是HUVECS倒置显微镜（1010）观察图；图2是蒎烯、蒎烯、1,8桉叶油醇或莰烯按对LPS诱导HUVECS损伤的保护作用HESTAINING图。0043具体实施方式0044下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但是所列实施例并非用于限制本发明。0045实施例1本发明所涉及蒎烯片剂的制备取20克化合物蒎烯，用环糊精制备包合物，再加入制备片剂的常规辅料淀粉、硬脂酸、滑石粉等180克，混匀，常规压片机制成1000片，口服，每天3次，一次14片。0046实施例2本发明所涉及蒎烯胶囊剂的制备取20克化合物。

23、蒎烯，用环糊精制备包合物，再加入制备胶囊剂的常规辅料如说明书CN104127394A8/9页10淀粉、糊精、糖粉等180克，混匀，制粒，装胶囊制成1000粒，口服，每天3次，一次14粒。0047实施例3本发明所涉及1,8桉叶油醇片剂的制备取2克化合物1,8桉叶油醇，用环糊精制备包合物，再加入制备片剂的常规辅料淀粉、硬脂酸、滑石粉等180克，混匀，常规压片机制成2000片，口服，每天2次，一次1片。0048实施例4本发明所涉及莰烯胶囊剂的制备取2克化合物莰烯，加入制备胶囊剂的常规辅料如糊精180克，混匀，装胶囊制成1000粒，口服，每天3次，一次13粒。0049实施例5本发明所涉及蒎烯滴丸剂的制。

24、备取20克化合物蒎烯，加入制备滴丸剂的常规辅料如聚乙二醇6000、聚乙二醇4000、硬脂酸180克，混匀，装胶囊制成1000粒，口服，每天3次，一次13粒。0050实施例6本发明所涉及1,8桉叶油醇软胶囊剂的制备取20克化合物1,8桉叶油醇，用明胶做胶囊壳，滴制法或压制法，制成软胶囊剂1000粒，口服，每天3次，一次13粒。0051实施例7取10克化合物蒎烯，10克化合物蒎烯，加入制备滴丸剂的常规辅料如聚乙二醇6000、聚乙二醇4000、硬脂酸180克，混匀，装胶囊制成1000粒，口服，每天3次，一次13粒。0052实施例8取15克化合物蒎烯，5克化合物蒎烯，加入制备滴丸剂的常规辅料如聚乙二醇。

25、6000、聚乙二醇4000、硬脂酸180克，混匀，装胶囊制成1000粒，口服，每天3次，一次13粒。0053实施例9取5克化合物蒎烯，15克化合物蒎烯，再加入制备片剂的常规辅料淀粉、硬脂酸、滑石粉等180克，混匀，常规压片机制成1000片，口服，每天3次，一次14片。0054实施例10取15克化合物蒎烯，5克1,8桉叶油醇，再加入制备片剂的常规辅料淀粉、硬脂酸、滑石粉等180克，混匀，常规压片机制成1000片，口服，每天3次，一次14片。0055实施例11取15克化合物蒎烯，5克1,8桉叶油醇，再加入制备片剂的常规辅料淀粉、硬脂酸、滑石粉等180克，混匀，常规压片机制成1000片，口服，每天3。

26、次，一次14片。0056实施例12取15克化合物蒎烯，5克1,8桉叶油醇，加入制备滴丸剂的常规辅料如聚乙二醇6000、聚乙二醇4000、硬脂酸180克，混匀，装胶囊制成1000粒，口服，每天3次，一次1粒。0057实施例13取5克蒎烯，5克蒎烯，5克1,8桉叶油醇，加入制备滴丸剂的常规辅料如聚乙二醇6000、聚乙二醇4000、硬脂酸180克，混匀，装胶囊制成1000粒，口服，每天3次，一次1粒。0058实施例14取5克蒎烯，5克化合物蒎烯，5克1,8桉叶油醇，1克莰烯，再加入制备片剂的常规辅料淀粉、硬脂酸、滑石粉等180克，混匀，常规压片机制成1000片，口服，每天3次，一次14片。0059实。

27、施例15取10克化合物蒎烯，5克1,8桉叶油醇，1克莰烯，加入制备滴丸剂的常规辅料如聚乙二醇6000、聚乙二醇4000、硬脂酸180克，混匀，装胶囊制成1000说明书CN104127394A109/9页11粒，口服，每天3次，一次13粒。0060实施例16取5克蒎烯，5克化合物蒎烯，5克1,8桉叶油醇，1克莰烯，加入制备滴丸剂的常规辅料如聚乙二醇6000、聚乙二醇4000、硬脂酸180克，混匀，装胶囊制成1000粒，口服，每天3次，一次13粒。0061实施例17取5克化合物蒎烯，5克1,8桉叶油醇，1克莰烯，加入制备滴丸剂的常规辅料如聚乙二醇6000、聚乙二醇4000、硬脂酸180克，混匀，装胶囊制成1000粒，口服，每天3次，一次13粒。说明书CN104127394A111/1页12图1图2说明书附图CN104127394A12。